Bildgebung der Wurzelhaare Morphologie der Arabidopsis Sämlinge in einer zweischichtigen mikrofluidischen Plattform

Das übergeordnete Ziel dieser mikrofluidischen Spaced-Kultivierungsmethode ist es, Pflanzen direkt aus Samen in einer strukturierten Umgebung zu züchten, die auch für eine kontrollierte Behandlung und hochauflösende Bildgebung der Wurzeln der Sämlinge verwendet werden kann. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Pflanzenbiologie zu beantworten, z. B. wie das Wurzelwachstum von Pflanzen auf physikalische und chemische Signale auf mehreren Längenskalen reagiert. Der Hauptvorteil dieser Plattform besteht darin, dass die Reparaturen auf eine einzige Ebene beschränkt sind, was es unmöglich macht, sie zu behandeln und abzubilden, ohne den optischen Fokus zu verlieren.

Heute wird mir Dr. Sahar Hasim zur Seite stehen, sie ist wissenschaftliche Mitarbeiterin an der University of Tennessee. Gießen Sie zunächst ein Verhältnis von PDMS zu Härter im Verhältnis 10:1 auf einen vorgefertigten und selenisierten Master-Wafer. Entgasen Sie das PDMS in einer Vakuumkammer und härten Sie das Polymer dann eine Stunde lang in einem Ofen bei 70 Grad Celsius aus.

Schneiden Sie anschließend mit einem Skalpell die PDMS-Geräte ab und schälen Sie sie vom Master. Verwenden Sie dann eine 1,5-Milliliter-Biopsie, um den Sameneinlass in einem 45-Grad-Winkel zu stanzen, um das Wurzelwachstum in den Hauptkanal zu fördern. Verwenden Sie den gleichen Stempel auch, um die Behandlungseinlässe zu reinigen.

Verwenden Sie Klebeband, um Schmutz vom Gerät zu entfernen, und legen Sie es mit der Designseite nach unten auf eine Glasabdeckfolie. Autoklavieren Sie die Geräte nach dem Zusammenbau. Geben Sie die Samen von Arabidopsis thaliana in ein Mikrofugenröhrchen und fügen Sie eine Mischung aus Bleichmittel und Reinigungsmittel hinzu, um die Samen zu sterilisieren.

Waschen Sie die Samen dann viermal mit sterilem Wasser. Als nächstes stratifizieren Sie die Samen, indem Sie sie über Nacht im Mikrofuge-Röhrchen kühlen oder bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius lagern. Stellen Sie die sterilen Geräte vor der Verwendung in eine Vakuumentgasungskammer, um Luft aus dem gasdurchlässigen PDMS und den Fluidikkanälen zu entfernen.

Dadurch wird die spätere Befüllung der Geräte verbessert. Nehmen Sie die Geräte aus der Vakuumkammer und tauchen Sie sie sofort in eine Petrischale, die mit flüssigem Medium mit einer Viertelstärke von pflanzlicher Basis bei einem pH-Wert von 5,7 gefüllt ist. Ziehen Sie mit einer Pipette Flüssigkeit durch die Einlässe, um das Gerät zu füllen.

Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in den Kanälen verbleiben, indem Sie sie visuell inspizieren, bevor Sie sie in einzelne frische, trockene Petrischalen umfüllen. Gießen Sie anschließend heißes Agar um das Gerät herum, bis der Agarspiegel fast bündig mit der Oberseite des Geräts ist. Verwenden Sie in einer sterilen Umgebung eine kleine Pipette und geben Sie einen sterilisierten Seed in den Einlass jedes Geräts.

Decken Sie dann jede Petrischale mit Wachsfilm ab und legen Sie sie in eine helle, dunkle, zyklische Wachstumskammer bei Raumtemperatur. Richten Sie die Petrischale in der Wachstumskammer bei Raumtemperatur vertikal aus, damit die Schwerkraft die Wurzeln dazu anregt, durch den Kanal zu wachsen. Verwenden Sie zum gewünschten Zeitpunkt und während der Entwicklung des Sämlings eine Pipette, um eine vorgeschriebene Menge der experimentellen Behandlung auf jeden der acht seitlichen Anschlüsse an den Geräten zu geben.

Wenn Sie fertig sind, verschließen Sie die Petrischalen wieder mit Wachsfolie. Bringen Sie sie dann wieder in die Wachstumskammer zurück. Stellen Sie die Vergrößerung eines inversen Hellfeldmikroskops zwischen 4- und 20-facher Vergrößerung ein.

Legen Sie die gesamte Petrischale, die das Gerät und den Keimling enthält, unter das Mikroskop, um Hellfeld- oder differentielle Interferenzkontrastbildgebung zu erhalten. Optimieren Sie die Lichtverhältnisse, indem Sie die Belichtungszeiten, die Lampenhelligkeit, die Blende und die Polarität des Lichts anpassen, um die morphologischen Merkmale zu verdeutlichen, die von Interesse sind. Fahren Sie dann die Bühne zum gewünschten Bereich der Wurzel und konzentrieren Sie sich auf die Wurzel oder das Wurzelhaar von Interesse.

Erfassen Sie einen einzelnen Zeitpunkt oder eine Zeitreihe von Bildern, um das Wachstum der Wurzelhaare zu visualisieren. Für die Zeitreihe bilden Sie die wachsenden Wurzelhaare einmal pro Minute ab. Um das Wachstum der Hauptwurzel zu visualisieren, nehmen Sie alle 30 Minuten ein Bild auf.

Wenn Sie fertig sind, bringen Sie die Petrischale und die Sämlinge in vertikaler Position in die Wachstumskammer zurück. Sobald der Sämling die gewünschte Zeit gewachsen ist, verwenden Sie eine Pinzette, um das Deckglas und das Gerät vom Agar zu entfernen. Befeuchten Sie dann ein Labortuch mit Ethanol und reinigen Sie damit die Unterseite des Deckglases.

Tragen Sie das richtige Öl auf ein 63x Öl-Immersionsobjektiv auf und legen Sie den Abdeckschub nach unten auf den Mikroskoptisch. Heben Sie dann die Bühne an, um mit dem Immersionsmedium auf dem Objektiv in Kontakt zu kommen. Optimieren Sie die Lichtverhältnisse, indem Sie die Belichtungszeiten, die Lampenhelligkeit, die Blende und die Polarität des Lichts anpassen.

Fahren Sie dann die Bühne zum gewünschten Bereich der Wurzel und konzentrieren Sie sich auf die interessierenden Wurzelhaare. Um das Wachstum der Wurzelhaare im Laufe der Zeit zu quantifizieren, richten Sie die Software so ein, dass sie ein Bild pro Minute an der gewünschten Stelle aufnimmt. Um die Autofluoreszenz oder Fluoreszenzmarker der Pflanze zu visualisieren, minimieren Sie die Fluoreszenz-Expositionszeit, während Sie immer noch ein identifizierbares Fluoreszenzsignal erhalten.

Nehmen Sie Bilder der Organellen so schnell auf, wie es die Belichtungszeit zulässt. Sobald der Sämling die gewünschte Zeit gewachsen ist, entferne das Gerät und den Deckglas von der Petrischale. Drehen Sie das Gerät auf den Kopf und ziehen Sie den Deckglas vorsichtig ab, sodass die Wurzel im PDMS-Kanal bleibt.

Platzieren Sie das PDMS-Gerät auf einem flachen, reflektierenden Substrat, z. B. mit einer Mikrobeschichtung in Gold, und montieren Sie das Gerät dann mit der Wurzel nach oben auf dem AFM-Probenhalter. Nachdem Sie einen Aufsatz für die Flüssigvertiefung oben auf dem PDMS-Gerät befestigt haben, füllen Sie ihn mit Wasser, um die Wurzeln während der Bildgebung mit Feuchtigkeit zu versorgen. Nachdem die Probe in das Rasterkraftmikroskop geladen wurde, stellen Sie den z-Regler auf die Dicke des PDMS-Geräts ein und fahren Sie den Ausleger in den interessierenden Bereich auf der Wurzel.

Richten Sie den Laser mit einer Kamera an der Spitze des Cantilevers aus und verwenden Sie die Kontaktmodus-Bildgebung, um während des Scannens nur minimale Kraft auf die Wurzel auszuüben. Senken Sie den Scanmechanismus langsam ab, bis der Ausleger gerade noch Kontakt mit der Probe hat. Passen Sie dann die Scangröße für den gewünschten Bereich an und wählen Sie eine Scangeschwindigkeit von einer Zeile pro Sekunde mit 256 Spannungspunkten pro Zeile.

Erfassen Sie abschließend den Scan. Die hier beschriebenen zweischichtigen PDMS-Mikrofluidikgeräte weisen einen 200 Mikrometer hohen Mittelkanal für die Hauptwurzel von Arabidopsis und zwei 20 Mikrometer hohe Seitenkammern auf, um die seitlich wachsenden Wurzelhaare einzuschließen. Dadurch wird sichergestellt, dass sich die Wurzelhaare auf der gleichen Bildgebungsebene wie die Hauptwurzel befinden.

Im Rahmen der mikrofluidischen Plattform können Wurzelhaare auf zellulärer Ebene quantifiziert werden, und zwar in Bezug auf ihre Länge, Dichte und die Winkligkeit ihres Wachstums von der Wurzel aus. Einer der stärksten Vorteile der Verwendung einer mikrofluidischen Plattform ist die Fähigkeit, den Organismen gleichmäßig präzise Konzentrationen chemischer Behandlungen zuzuführen. Hier wird ein Sämling vor und nach der Zugabe von fluoreszierenden carboxylierten Polystyrolkügelchen abgebildet.

Die Zugabe dieser abiotischen Behandlung hat die Ausrichtung des optischen Fokus der Wurzelhaare der Sämlinge nicht gestört. Mit Hilfe von Fluoreszenzmarkern kann der zytoplasmatische Strom in einem Wurzelhaar gesehen werden. Die Bewegung dieser drei Organellen wird in diesem kumulativen Verteilungsdiagramm erfasst.

Neben der optischen Bildgebung ermöglicht diese Plattform auch die AFM- und REM-Bildgebung, da sie zerlegt werden kann, ohne die Wurzel zu stören. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, einschließlich chemischer Bildgebung, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie chemische Profile um die Wurzel herum aussehen.