Name: Eine Kultur Zellmodell der Widerstand Arterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Lernen Sie die etablierte Zellkulturmethode zur Untersuchung myoendothelialer Verbindungen in Widerstandsarterien. Dieses Modell ermöglicht die spezifische Isolierung von Zellfraktionen zur Analyse von Signalwegen.

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Diese Arbeit von National Heart unterstützt wurde, Lung and Blood Institute gewährt R01088554, der T32HL007284 und der American Heart Association predoctoral Gemeinschaft 14PRE20420024. Wir danken vor allem die St. Jude Cellular Imaging geteilt Forschung Core, einschließlich Randall Wakefield und Linda Horner für die Elektronenmikroskopie Bilder, Adam Straub für die Unterstützung bei repräsentativen Immunfluoreszenz Bilder und Pooneh Bagher für Sie wertvolles Feedback über das Manuskript-Protokoll.

1. galvanischen Zellen für die VCCC <ol><li>großen 225 cm 2 Kulturflaschen der EG und SMC unter sterilen Bedingungen bei 37 ° C, bis zum Zusammenfluss von 70-90 %. Sicherstellen Sie, dass mehr EG als SMC verwendet werden; Wenn primäre menschlichen EG und SMC, in der Regel 3 große Fläschchen der EG, 1 große Flasche mit SMC.
	<ol><li>Primärzellen im unteren Passagen verwenden und verwenden Sie nicht vorbei Durchgang 10. Wählen Sie die Kultur Medien basierend auf Zellen, Co kultiviert werden. Verwenden Sie für primäre menschliche Koronararterie EG EBM-2 EG basale Medien mit EGM2 MV Wachstumsfaktoren. Verwenden Sie für primäre menschlichen koronare SMC SmBM SMC basale Medien mit Wachstumsfaktoren SmGM-2. Vor dem Einsatz mit kultivierten Zellen Wachstumsfaktoren zu Medien hinzufügen.</li>
	</ol></li> <li>Bau der VCCC Tag1: Petrischalen groß (150 mm) und Deckel mit einem Desinfektionsmittel (z.B. Cavicide) sprühen und wischen Sie mit einem Papiertuch oder fusselfreien Wischtücher. Dann sprühen Sie die Petrischalen mit 70 % Ethanol (EtOH) und legen Sie sie in die Haube an der Luft trocknen.</li>
	<li>Öffnen die Platte der Filtereinsätze (siehe die Tabelle der Materialien) unter sterilen Bedingungen und Mantel die SMC-Seite (Unterseite des Filters) des Einsatzes mit Fibronektin-Lösung. Halten die Einlage in die vorgesehenen 6-Well-Platte, Pipettieren der Fibronektin-Lösung durch die Seite Schlitze an der Unterseite der Platte, die dafür sorgen, dass die untere Hälfte des Filters ist (nicht mehr als 1 mL) bedeckt.</li>
	<li>Nach 30 min Behandlung mit Fibronektin Lösung bei Raumtemperatur in der Zelle-Kultur-Haube, Einsätze aus dem Blech nehmen, Vakuum überschüssige Lösung und invertieren, Platzierung in der unteren Hälfte der sauberen Petrischale. Beiseite stellen. Achten Sie darauf, nicht die Filtermembran einfügen zu stören, wenn überschüssige Lösung Absaugen; Dies kann durch sanft die Platte kippen und Staubsaugen die Lösung über den Rand des Einsatzes vermieden werden.</li>
	<li>Trypsinize 225 cm 2 Kolben des SMC mit 3 mL vorgewärmten 2 X Trypsin-EDTA-Lösung, und sobald die Zellen aus der Platte gehoben haben hinzufügen 9 mL SMC Medien, Trypsin (3:1, Medien: Trypsin) zu neutralisieren. Übertragen auf eine konische Rohr, mischen Sie gut und Pipettieren 10 µL auf eine Hemocytometer Anzahl von Zellen zu bestimmen.
	<ol><li>Count die Anzahl der Zellen in 5 x 5 Felder (d. h., 18), multiplizieren Sie diese mit 10.000, die Anzahl der Zellen in 1 mL (180.000) erhalten. Multiplizieren Sie dann mit 12 mL (Gesamtvolumen der Zellsuspension, 2,16 Millionen SMC). Sicherzustellen, dass es genügend SMC auf die gewünschte Anzahl von Brunnen Platte. 
		Hinweis: Z. B. 1 gut 75.000 SMC haben sollte und somit 18 Vertiefungen 1,35 Millionen insgesamt SMC. Dividieren von 1,35 Millionen Zellen von 180.000 Zellen pro 1 mL benötigt, und dies führt zu 7,5 mL Zellsuspension, die für die Beschichtung benötigt werden. Berechnen Sie dann das endgültige Volumen benötigt (18 Brunnen X 750 µL = 13,5 mL). So nehmen Sie 7,5 mL Zellsuspension, bringen das Volumen bis zu 13,5 mL vorgewärmten SMC Medien und gut mischen.</li>
	</ol></li> <li>Platte 750 µL Zellsuspension mit ca. 75.000 SMC auf der Unterseite jedes Filters, wobei Sie darauf achten, keines der Medien und Zelle Lösung zu verschütten. Setzen Sie den Deckel an der Spitze und sorgfältig zu übertragen, die Petrischale mit den Einsätzen in den Brutschrank bei 37 ° C über Nacht. 
	Hinweis: Die optimale Zelldichte für andere Zelltypen müssen empirisch ermittelt werden.</li>
	<li>Am 2. Tag, saubere 6-Well Tellern mit 2 mL frisches, vorgewärmten SMC Medien. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator. Die Einsätze aus einzeln nacheinander und entfernen Sie das Medium durch Absaugen, dann setzen Sie die 6-Well-Platte mit den SMC Medien.</li>
	<li>Mantel die gegenüberliegende Seite des Filters (EG-Seite) mit 1 mL einer 0,5 % bovine Gelatine-Lösung für mindestens 30 min bei 37 ° c</li>
	<li>Trypsinize 225 cm 2 Flask(s) EG mit 3 mL vorgewärmten 2 X Trypsin-EDTA (10-fach verdünnt in sterilen Dulbecco &#39; s PBS) Lösung mit sanften Klopfen des Kolbens um die Zellen aus der Platte zu heben. 
	Hinweis: Es möglicherweise notwendig, um die Kolben zurück in den Brutschrank bei 37 ° C für 1-3 min zu platzieren.
	<ol><li>Einmal die Zellen aus der Platte gehoben haben hinzufügen 9 mL EG Medien zu neutralisieren die Trypsin (3:1). Transfer zu einem konischen Rohr, Pool gemeinsam, mischen Sie gut und Pipettieren 10 µL auf eine Hemocytometer Anzahl von Zellen zu bestimmen.
		<ol><li>Count die Anzahl der Zellen in 5 x 5 Felder (d. h. 60), multiplizieren Sie diese mit 10.000, die Anzahl der Zellen in 1 mL (600.000) erhalten. Multiplizieren Sie dann mit 12 mL (Gesamtvolumen der Zellsuspension, 7,2 Millionen EG). Sicherzustellen, dass es genügend EG auf die gewünschte Anzahl von Brunnen Platte. 
			Hinweis: Ca. 360.000 EG sind pro Bohrloch erforderlich. Beispielsweise erfordern 18 Brunnen 6,48 Millionen EC Dividieren von 6,48 Millionen Zellen von 600.000 EC pro 1 mL benötigt, und dies führt zu 10,8 mL Zellsuspension, die für die Beschichtung benötigt werden. Berechnen Sie dann das endgültige Volumen benötigt (18 Brunnen x 1 mL = 18 mL). So nehmen Sie 10,8 mL Zellsuspension, bringen das Volumen bis zu 18 mL mit EG Medien vorgewärmt und sanft Aufschwemmen.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Platte 1 mL 360.000 EG auf der Oberseite der einzelnen Filter einfügen. Lassen Sie die Zellen, die bei 37 ° C für 24 Std. ersetzen Medium am 4. Tag ungestört brüten. Ernte am Tag 5.</li>
</ol> 2. Ernte-Fraktionen aus der VCCC <ol><li>führen die Isolation in einem Raum von 4 ° C und halten alle Instrumente im Ice.</li>
	<li>Denken Sie daran, die Anzahl der einzelnen Einfügungen, isoliert und eine 50 mL-Tube MEJ (für die isolierte Filter) beschriftet Lyse Puffer hinzu. Bezeichnen Sie zwei 10 mm Schalen; eins für EG und eins für SMC.</li>
	<li>Stellen Sie die Lautstärke der Lyse Puffer je nachdem, wie konzentriert die lysate muss sein; für 15 Einsätze, 500 µL Lyse Puffer für die MEJ-Röhre und 250 µL pro Petrischale werden empfohlen.</li>
	<li>Arbeiten mit einem 6-Well-Platte von Einsätzen zu einem Zeitpunkt. Saugen Sie das Medium in die Zelle Kultur Kapuze und dann Verkehr in einen kalten Raum auf Ice 
	Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für 1 Isolation einfügen.</li>
	<li>Pipettieren 10 µL 1 X PBS auf der SMC-Seite des Einschubs.</li>
	<li>Verwenden den Zelle Lifter zu kratzen an den Zellen an einem Ende des Einsatzes, und übertragen Sie die Zellen aus der Lifter, der SMC Petrischale mit Lyse Puffer in it.</li>
	<li>Sobald die Zelle Heber den Lyse-Puffer in der Schale berührt hat es darf nicht den einfügen-Filter zu berühren, bis es vollständig abgewischt und abgetrocknet auf Küchenpapier. Wiederholen Sie das Kratzen der SMC Filter mindestens ein bis zwei Mal, um vollständig zu entfernen, die restlichen SMC-Zellenrückstand.</li>
	<li>Drehen Sie den Einsatz über und Pipettieren 10 µL 1 X PBS in der oberen/EG-Seite des Filters einfügen. Wiederholen Sie die Schritte 2.6 und 2.7 mit Schabeisen Zelle und der EG-Petrischale.</li>
	<li>Sammeln die noch verbleibende Zelle und PBS Gülle aus der EG-Seite des Filters mit einer Pipette und Übertragung der EG Petrischale mit Lyse Puffer. Seien Sie sehr gründlich in Schaben die Zellen an beiden Seiten des Filters, minimale EG/SMC-Kontamination in der MEJ-Fraktion verlassen.</li>
	<li>Verwenden Sie Vorsicht das Skalpell schneiden Sie die Filter aus den Kunststoffeinsatz. Zu diesem Zweck schneiden 70-80 % davon weg von Kunststoff und Zange den Filter komplett von den Kunststoffeinsatz Struktur ziehen. Setzen Sie den Filter in der 50 mL konische Röhre MEJ mit Lyse Puffer beschriftet, und sicherzustellen, dass es sitzt in der Lyse-Puffer und bleibt feucht.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Isolation, in Gruppen von 6, bis alle Einsätze abgearbeitet wurden.</li>
	<li>Sorgen dafür, dass die verschiedenen Behandlungsgruppen in getrennten Röhren und Gerichte gehalten werden.</li>
	<li>Vortex 50 mL MEJ konischem Rohr auf voller Stärke für 15 s oder bis alles gut vermischt. Entfernen Sie die Filter aus dem konischen MEJ mit Zangen, ziehen sie entlang der Seitenwände des Rohres, die maximale Menge an Proteinen und Flüssigkeit im Rohr lassen. Nach diesem Zeitpunkt die Filter verwerfen.</li>
	<li>Sobald die Filter aus der MEJ konischem Rohr entfernt wurden tun ein schnelle Runde (10-15 s bei max. Drehzahl ~ 16.000 x g) in einer Zentrifuge, die Flüssigkeit und die Proteine an der Unterseite des Rohres zu ziehen. Übertragen Sie den Inhalt des Rohres MEJ und die EG und SMC Petri Gerichte in separate, kleinere Zentrifuge Röhren.</li>
	<li>Optional: beschallen den Inhalt der MEJ/SMC/EG Rohre auf Stufe 4 für drei 10 s-Pulse auf Eis oder sanft mit der Hand zu homogenisieren.</li>
	<li>Zentrifugieren bei max. Geschwindigkeit (~ 16.000 x g) 15 min bei 4 ° C. Pipettieren aus der Überstand und assay lysate für den Eiweißgehalt unter Verwendung der Methode Bicinchoninic Assay.</li>
</ol> 3. Ernte der VCCC für En Face Immunfluoreszenz <ol><li>auf den Tag 5 der VCCC Inkubation, entfernen Sie die Einsätze aus dem Inkubator. Arbeiten in der Zelle-Kultur-Haube, Absaugung von SMC Medien aus jedem der unteren Brunnen des Insert Filters und spülen zweimal mit 1 X PBS. Wiederholen Sie dies mit der EG-Seite.</li>
	<li>Halten die Einsätze, intakt und in der Platte, 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 10-20 min in einem begehbaren 4 ° C Raum auf einem sanften Shaker hinzufügen. Beide Seiten des Insert Filters mit 1 X PBS für 5 min waschen und zwei Mal wiederholen. 
	Achtung: PFA ist giftig und müssen sorgfältig behandelt werden.</li>
	<li>Führen die blockierende, primäre und sekundäre Antikörper Inkubationen in die Platte, um sicherzustellen, dass beide Seiten des Filters in der Antikörper beibehalten werden + blockiert Lösung (9 mL PBS, 25 µL Triton X100, 50 mg Rinderserumalbumin, 500 µL normal Serum)</li>
	<li>Montieren Sie den Filter auf einer Folie, die Filter aus den Kunststoffeinsatz mit einem Skalpell schneiden montiert auf einen Griff und auf einen Objektträger mit Eindeckmedium.</li>
</ol> 4. Ernte der VCCC für transversale Immunfluoreszenz <ol><li>auf den Tag 5 der VCCC Inkubation, entfernen Sie die Einsätze aus dem Inkubator. Saug-aus den Medien von beiden Seiten des Filters in der Zelle Kultur Haube einfügen und spülen Sie jede Seite des Filters zwei Mal mit 1 X PBS.</li>
	<li>Halten die Einsätze, intakt und in der 6-Well-Platte hinzufügen 4 % PFA und inkubieren Sie über Nacht in einem begehbaren 4 ° C Raum auf einem sanften Shaker. 
	Achtung: PFA ist giftig und müssen sorgfältig behandelt werden.</li>
</ol> 5. Einbettung der VCCC für transversale Immunfluoreszenz <ol><li>nach Filter Einsätze wurden behoben, etwa für 24 h in 4 % PFA, Übertragung auf 70 % EtOH für mindestens 24 Stunden, aber bis zu mehreren Wochen.</li>
	<li>Verarbeiten die Filter auf eine lange (über Nacht) auf einem automatisierten Gewebe-Prozessor laufen. Verwenden Sie das Programm wie folgt: 70 % EtOH für 30 min, 85 % EtOH 30 min, 95 % EtOH 30 min, 100 % EtOH 30 min, 100 % EtOH 45 min, 100 % EtOH 45 min, Xylol 30 min, Xylol 30 min, Xylol 45 min, 60 ° C paraffin 30 min, 60 ° C 30 min paraffin , 60 ° C 45 min. paraffin</li>
	<li>Nach der Verarbeitung der geernteten Filter transfer zum Einbetten in flüssigem Paraffin, halten Sie die Filter in der Kassette.</li>
	<li>Entfernen Sie den Filter aus der Kassette vorsichtig mit einer Pinzette es nur am Rande zu halten. Halbieren Sie mit einer Schere den Filter, bilden zwei halbrunde Hälften geformt. Lag der 2 Hälften auf der Kühlplatte Teil der einbettenden Station gerade lange genug, um die Einbettung füllen Schimmel mit flüssigem Paraffin.</li>
	<li>Einmal gefüllt mit flüssigem Paraffin, ganz kurz berühren die einbettende Form, um die kalte Platte, dann jeweils die Hälfte des Filters in Form (Schnittseite nach unten) einbetten einzubetten; dies wird sichergestellt, dass beim Schneiden, einer aus der Mitte des Filters gegen den Rand schneiden wird .</li>
	<li>Nutzungszeit einbetten, Pinzetten, halten Sie den Filter im Ort, um zu verhindern, dass die Hälften ineinander fallen, bis das Paraffin kühl genug für sie ist, allein zu stehen. Bewegen Sie den Einbetten von Schimmel auf einen kalten Teller bis völlig erstarrt. 
	Hinweis: Kühlung Blöcke auf Eis Tabletts, um faltige Abschnitte zu verhindern hilft.</li>
</ol> 6. -Schnitt und Färbung der VCCC für transversale Immunfluoreszenz <ol><li>für die Paraffin-Blöcke schneiden und schieben, Montage: 5 µm Abschnitte schneiden, legen Sie die Abschnitte in ein Wasserbad 42 ° C und nehmen Sie in den Abschnitten mit positiv geladenen Folien. Dann halten Sie Dias über Nacht in einem 42 ° C Ofen trocknen.</li>
	<li>Vor Beginn der Rehydratation Schritte, backen die Folien bei 60 ° C das Paraffin schmilzt und helfen die VCCC Abschnitte auf der Folie haften. Kurz abkühlen, dann rehydrieren die Folien durch zwei Änderungen von Xylol, 100 % EtOH, 95 % EtOH, eine Änderung von 70 % EtOH und zwei Änderungen von destilliertem Wasser.</li>
	<li>Antigen Abrufmethoden, bei denen Mikrowelle oder Heizung wie Abschnitte, aus der Folie fallen können zu vermeiden.</li>
	<li>Führen die standard Sperrung für 1 h bei Raumtemperatur, dann die Nacht Inkubation mit dem primären Antikörper bei 4 ° C, gefolgt von Wasch-Schritte und Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur. Montieren Sie mit der Montage Medien- und Deckgläschen.</li>
</ol>

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<li>Heberlein, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor-1+regulates+myoendothelial+junction+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation.</a> Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).</li>
<li>Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+protein+on+actin+bridges+between+endothelium+and+smooth+muscle+in+arterioles+demonstrates+heterogeneous+connexin+expression+and+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die VCCC hat eine Reihe von Vorteilen in Bezug auf die Rekapitulation MEJs in Vitro, aber es gibt Punkte der Diskussion beim festlegen, ob die VCCC für spezifische Anwendung genutzt werden kann. Beispielsweise, wenn verschiedene Zelltypen sind bei diesem Modell verwendet werden, es müssen optimiert werden. Wir haben primären humanen Zellen verwendet, aber es ist möglich, Zellen aus bovine Hauptschlagadern24oder Wildtyp oder Knockout-Mäusen zu isolieren, und verwenden sie in der VCCC<sup c...

In kleinem Durchmesser Widerstand Arterien trennt eine dünne internen elastischen Lamina (IEL) Endothelzellen (EG) und glatten Muskelzellen (SMC). Die Zellen können durch Löcher in dieser elastischen Matrix Projekt und zytoplasmatischen Direktverbindungen über Gap Junction Kanäle1,2. Diese einzigartige Struktur ist die Myoendothelial-Kreuzung (MEJ) bezeichnet. Die MEJ ist eine kleine (ca. 0,5 µm x 0,5 µm, je nach dem vaskulären Bett), zelluläre Projektion besteht überwiegend aus Endothelzellen aber möglicherweise stammen aus glatten Muskulatur sowie3,4. Eine Reihe von Forschern haben gezeigt, die immense Komplexität von Netzwerken, die selektiv auf die MEJ, wodurch es einen besonders wichtigen Standort zur Erleichterung der Bi-direktionale Signalisierung zwischen Endothel und glatten Muskulatur5 auftreten-Signalisierung ,6,7,8,9,10.
Eine mechanistische Dissektion der Signalwege in der MEJ ist jedoch schwierig in einer intakten Arterie. Da die MEJ eine zelluläre Projektion ist, ist es nicht aktuell möglich, eine in Vivo MEJ aus der Gefäßwand zu isolieren. Aus diesem Grund wurde die VCCC Modell1 entwickelt. Wichtig ist, die VCCC repliziert, physiologische endotheliale Morphologie11 und Polarisierung der Signalisierung zwischen der apikalen und MEJ Teile der Zelle12. Es war dieses einzigartige Modell, das die Entdeckung erleichtert, die alpha Hämoglobin in den Endothelzellen polarisiert, die MEJ ist. Dies steht im Gegensatz zu konventionell kultivierten Endothelzellen die alpha Hämoglobin13nicht ausdrücken. Für Forscher mikrovaskulären Endothel interessiert ist es möglicherweise sinnvoller, Endothelzellen, die in der VCCC kultiviert worden verwenden, besonders wenn Sie beabsichtigen, Signalwege zu zergliedern, die in kleinem Durchmesser Widerstand Arterien auftreten.
Kokultur zwei verschiedene Zelltypen eine robuste Kunststoff-Einlage, enthält einen Filter mit kleinem Durchmesser Poren (0,4 µm im Durchmesser) mit wird verhindert, dass die Zellen die Migration zwischen den Schichten. Es ergibt sich ein 10 µm-Abstand zwischen den Zellen, die deutlich länger als in Vivo, aber immer noch viele der in Vivo -Eigenschaften der MEJs, einschließlich Protein Lokalisierung und second Messenger Signalisierung1 repliziert , 14. Darüber hinaus ermöglicht die VCCC für die Ausrichtung der Zelle typspezifische Signalisierung über die Zugabe von ein Agonist oder Antagonist zu den spezifischen zellulären Fach. Z. B. laden die EG mit BAPTA-AM, Kalzium Chelat und Stimulierung der SMC mit Phenylephrin14. Im Gegensatz zu anderen Beschreibungen von Kokulturen Modelle15,16,17,18,19,20,21stellt dies Hinweise auf die unterschiedlichen Fraktionen mRNA und Protein, einschließlich den ausgeprägten MEJ Bruch innerhalb der Poren des Filters zu isolieren. Diese Technik, um die VCCC können für spezifische Untersuchung von Veränderungen der mRNA Lokalisierung oder Transkription22, Protein Phosphorylierung12,23und Protein Aktivität12. Dieser Artikel beschreibt Beschichtung der EG auf dem Filter und SMC auf dem Boden, obwohl es möglich ist, die zwei Zelltypen in verschiedenen Konformationen11,18,24Kultur.

<table><tbody><tr><td>24 mm Durchmesser, 0,4 &Mikro; m Transwell Polyester-Membranfiltereinsatz</td><td>Corning</td><td>3450</td><td>Dies ist eine 6-Well-Platte mit Einsätzen</td></tr><tr><td>225 cm Kolben</td><td>Corning</td><td>431082</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten (ohne Filtereinsätze)</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Primäre menschliche Endothelzellen der Koronararterien</td><td>Lonza</td><td>CC-2585</td><td></td></tr><tr><td>Primäre glatte Muskelzellen der menschlichen Koronararterien</td><td>Lonza</td><td>CC-2583</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 EC Basalmedien</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EC Wachstumsfaktoren (EGM2 MV Single Quots)</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td>Vor Gebrauch zu Basalmedien hinzufügen</td></tr><tr><td>SmBM SMC Basalmedien</td><td>Lonza</td><td>CC-3181</td><td></td></tr><tr><td>SMC Wachstumsfaktoren (SmGM-2 SingleQuot)</td><td>Lonza</td><td>CC-4149</td><td>Vor Gebrauch zu Basalmedien hinzufügen</td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA 10X</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>Mit sterilem dPBS-Hämozytometer auf 2X verdünnen</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>große Petrischalen für die SMC-Beschichtung (150 mm)</td><td>Corning</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Rindergelatine</td><td>Sigma</td><td>G-9382</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Fibronektin</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>5&micro; g/ml Fibronektin und bei -20 lagern</td></tr><tr><td>10x Hanks' gepufferte Salzlösung (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td>1x mit sterilem Wasser verdünnen</td></tr><tr><td>10x Dulbecco's Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (dPBS)</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td>1x mit sterilem Wasser verdünnen</td></tr><tr><td>Einweg-Gebogenes Skalpell (30 mm Schneide) mit Griff</td><td>Amazon</td><td>MDS15210</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fisher</td><td>17-467-201</td><td></td></tr><tr><td>Zellheber</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>BD Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Röhrchen</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>10 mm Petrischalen</td><td>Falcon</td><td>35-1008</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini-Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Lysereagenz</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Herstellung einer 4%igen Lösung mit dPBS</td></tr><tr><td>70%igem Ethanol</td><td>Fisher</td><td>04-355-305</td><td></td></tr><tr><td>Kavizid-Desinfektionsmittel</td><td>Fisher</td><td>131000</td><td></td></tr><tr><td>RIPA-Proteinlysepuffer</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Schalldismembranator</td><td>Fisher</td><td>Modell 50</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS für die Ernte von EC/SMC und Immunzytochemie</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>muss nicht steril sein</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Katalognummer</td><td><>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Einbetten/Schneiden/Färben</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Fisher</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierter Gewebeverarbeiter</td><td>Excelsior</td><td>ES</td><td></td></tr><tr><td>Einbettstation + Kühlplatte</td><td>Leica</td><td>HistoCore Arcadia</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek Accu-Edge Mikrotomklinge</td><td>VWR</td><td>25608-961 oder 25608-964</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Eindeckmittel</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Andere Lösungen<</td><td></td><td></td><td>strong>**Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen durch, wenn Sie die Lösung auf lebenden Zellen verwenden</td></tr><tr><td>Steriles dPBS-Autoklavierwasser</td><td></td><td></td><td>zum Sterilisieren. Mit dem sterilen Wasser DPBS (450 ml steriles Wasser: 50 ml 10X DPBS) herstellen, mischen und filtrieren, sterilisieren (0,2 &; Mikro; m Filter). Endkonzentration: 1X</td></tr><tr><td>steriles HBSS-Autoklavenwasser</td><td></td><td></td><td>zum Sterilisieren. Mit dem sterilen Wasser HBSS (450 ml steriles Wasser: 50 ml 10X HBSS) herstellen, mischen und filtrieren, sterilisieren (0,2 & Mikro; m Filter). Endkonzentration: 1X</td></tr><tr><td>Fibronektin-Stammlösung</td><td></td><td></td><td>Verwenden Sie 50 ml steriles Wasser zu Fibronektin, um 1 ml Aliquote herzustellen, und frieren Sie dann ein, bis es benötigt wird Endkonzentration: 100 μm; g/mL</td></tr><tr><td>Fibronektin zur Beschichtung der SMC-Seite von VCCC,</td><td></td><td></td><td>tauen Sie ein Aliquot auf und fügen Sie 1 ml Fibronektin hinzu (100 μm; g/mL) auf 19 ml 1X HBSS, um eine Endkonzentration von 5&micro zu erreichen; g/mL. Endkonzentration: 5&micro; g/mL</td></tr><tr><td>2x Trypsin EDTA-Lösung</td><td></td><td></td><td>Verdünnen Sie das 10X 0,5% Trypsin-EDTA auf 2X mit 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Endkonzentration: 2X</td></tr><tr><td>Blocking/Antikörperlösung</td><td></td><td></td> <td>(9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg Rinderserumalbumin, 500ml normales Serum)</td></tr><tr><td>Rindergelatine zur Beschichtung EC VCCC</td><td></td><td></td><td>Mischen Sie 0,5 g Rindergelatine in 100 ml destilliertes Wasser. Vor dem ersten Gebrauch autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern. Steril aufbewahren. Endkonzentration: 0,50%</td></tr><tr><td>1x PBS für die Entnahme von Zellen</td><td></td><td></td><td>muss nicht steril sein</td></tr></tbody></table>

eine kultur zellmodell der widerstand arterien

A Cell Culture Model of Resistance Arteries 

Die Myoendothelial Kreuzung (MEJ), eine eindeutige Signalisierung Microdomain in kleinem Durchmesser Widerstand Arterien, Exponate Lokalisierung von spezifischen Proteinen und Signalisierung Prozesse, die Gefäßtonus und Blutdruck steuern können. Es ist eine Projektion von entweder der Endothelzellen und glatten Muskelzellen Zelle, und aufgrund seiner geringen Größe (durchschnittlich eine Fläche von ~ 1 µm2), die MEJ ist schwierig, isoliert zu studieren. Jedoch entwickelten wir ein Zelle-Kultur-Modell namens die vaskulären Co Zellkultur (VCCC), die für in-vitro- MEJ Bildung, Endothelzellen Polarisation und Dissektion der Signalisierung Proteine und Prozesse in der Gefäßwand der Widerstand ermöglicht Arterien. Die VCCC hat eine Vielzahl von Anwendungen und kann verschiedene Zelltypen angepasst werden. Das Modell besteht aus zwei Zelltypen gewachsen auf gegenüberliegenden Seiten eines Filters mit 0,4 µm-Poren, in denen die in-vitro- MEJs bilden können. Hier beschreiben wir, wie erstelle ich die VCCC über Beschichtung von Zellen und Isolierung von Endothelzellen, MEJ, und glatte Muskulatur Brüche, die dann für Protein isoliert oder Aktivität verwendet werden können Assays. Der Filter mit intakten Zellschichten kann eingebettete und geschnittenen immunofluorescent Analyse fixiert werden. Wichtiger ist, wurden viele der Entdeckungen von diesem Modell bestätigt, mit intakten Widerstand Arterien, unterstreicht seine physiologische Bedeutung.

Die Filtereinsätze für die VCCC verwendet haben kleine, 0,4 µm Löcher. Abbildung 1A, ein En Flächenansicht des VCCC Filter Einschub zeigt die Poren, in denen die MEJ in Vitrobilden kann. Der Schaltplan zeigt die glatten Muskelzellen vergoldet auf der unteren Seite des Filters einen Tag vor der Endothelzellen auf der gegenüberliegenden Seite (Abbildung 1 b) überzogen sind. Sobald die Zellen überzogen sind, kann d...

Eine Kultur Zellmodell der Widerstand Arterien wird beschrieben, so dass für die Zerlegung der Signalwege im Endothel, glatte Muskulatur, oder zwischen Endothel und glatte Muskulatur (der Myoendothelial-Kreuzung). Die selektive Anwendung des Agonisten oder Protein isoliert, Elektronenmikroskopie oder Immunfluoreszenz kann mit diesem Handy-Kultur-Modell genutzt werden.

Eine Kultur Zellmodell der Widerstand Arterien

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, Endothel- und glatte Muskelzellen in vitro gemeinsam zu kultivieren, um Myoendotheljunctionen zu erzeugen, wie sie in kleinen Widerstandsarterien vorkommen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im kardiovaskulären Bereich zu beantworten, beispielsweise zur Proteinlokalisation und Aktivierung von Signaltransduktionskaskaden in der Arterienwand. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass man spezifisch Myoendotheljunction-Fraktionen aus Endothel und glatter Muskulatur isolieren kann, was mit einer echten Arterie nicht möglich ist.Die visuelle Demonstration einer Paraffineinbettung ist besonders wichtig, da die Einbettungsschritte ohne Anschauung des Verfahrens schwer zu erlernen sind. Beginnen Sie mit dem Aufbau der vaskulären Zell-Kokultur oder VCCC, indem Sie 150-Millimeter-Petri-Schalen und -Deckel mit Desinfektionsmittel besprühen und anschließend mit einem Papiertuch oder fusselfreien Tüchern abwischen. Danach besprühen Sie die Petri-Schalen mit 70 % Ethanol und stellen sie in die Haube, um sie lufttrocknen zu lassen.Öffnen Sie die Platte mit den Filtereinsätzen unter sterilen Bedingungen. Beschichten Sie die Unte

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Die Funktion der vaskulären Zellen hängt von der Aktivität der intrazellulären Botenstoffe ab.  Beschrieben wird hier ein ex vivo Zwei-Photonen-Bildgebungsverfahren, das die Messung des intrazellulären Calcium- und Stickoxidspiegels als Reaktion auf physiologische und pharmakologische Reize in einzelnen endothelialen und glatten Muskelzellen einer isolierten Aorta ermöglicht.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Die vaskulären Endothelzellen spielen eine bedeutende Rolle bei vielen wichtigen Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode, um Endothelzellen aus der Aorta der Maus zu isolieren und zu erweitern, ohne spezielle Geräte zu verwenden. Unser Protokoll bietet ein wirksames Mittel zur Identifizierung von Mechanismen in der Physiopathologie von Endothelzellen.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

Dieses Protokoll repliziert physiologische oder pathologische Blutfluss in vitro zur Bestimmung Zellantwort bei Krankheitspathologien unterstützen. Durch Einführung einer Druckdämpfungskammer stromabwärts von einer Blutpumpe, kann die Blutströmung durch die Vaskulatur rekapituliert und auf einer Monoschicht von Gefäßendothel oder eines Mimetikums Kokultur auferlegt.

In-vitro-Modell von physiologischen und pathologischen Blutfluss mit Anwendung auf Untersuchungen der Gefäßzell Remodeling

Gefäßverkalkung ist ein wichtiger Prädiktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen beim Menschen und trägt dazu bei. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Induktion der Verkalkung von kultivierten primären vaskulären glatten Muskelzellen und zur Quantifizierung der Verkalkung und Makrophagenbelastung in tierischen Aorten mittels Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung.

Die Verkalkung der glatten Gefäßmuskelzellen und Imaging von Aortic Kalzifizierung und Entzündung

Restenose nach Herz-Kreislauf-Verfahren (Bypass-Chirurgie, Angioplastie oder Stenting) ist ein wichtiges Problem der Verringerung der Haltbarkeit dieser Verfahren. Eine ideale Therapie würde die Proliferation der glatten Muskelzelle (VSMC) hemmen und gleichzeitig die Regeneration des Endothels fördern. Wir beschreiben ein Modell zur gleichzeitigen Beurteilung der VSMC-Proliferation und Endothelfunktion in vivo.

Murine Aortic Crush Injury: Eine effiziente<em&gt; In vivo</em&gt; Modell der glatten Muskelzellproliferation und Endothelfunktion

Hier präsentieren wir eine neuartige Anwendung der Aorta Ring-Test, wo sind prelabelled mesenchymale Zellen Co kultiviert mit Ratte Aorta abgeleitet endotheliale Netzwerke. Diese neuartige Methode ermöglicht die Visualisierung von mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) Homing und Integration mit endothelialen Netzwerken, Quantifizierung der Netzwerkeigenschaften und Auswertung von MSC Immunophenotypes und gen-Expression.

Die Aorta Ring Kokultur Assay: Ein komfortables Werkzeug, um angiogenen Potenzial des mesenchymaler Stromazellen Zellen In Vitro zu bewerten

Dieses Manuskript beschreibt in Vitro Videomikroskopie Protokolle für die Bewertung der Gefäßfunktion in Ratte zerebralen Widerstand Arterien. Das Manuskript beschreibt auch Techniken für die Bewertung der kapilläre Dichte mit Gewebekulturen beschrifteten Lektine und Gewebe Perfusion mit Laser-Doppler-Flowmetry.

Bewertung der vaskulären Kontrollmechanismen Nutzung Videomikroskopie der isolierten Widerstand Arterien von Ratten

In-vitro-Modelle der koronaren Angiogenese können für die Entdeckung der zellulären und molekularen Mechanismen der koronaren Angiogenese verwendet werden. In-vitro-Explantationskulturen von Sinusvenosus und Endokardgewebezeigen weisen als Reaktion auf VEGF-A ein robustes Wachstum auf und weisen ein ähnliches Muster der COUP-TFII-Expression auf wie in vivo.

In Vitro Modell der koronaren Angiogenese

Hier stellen wir ein neues Protokoll vor, um die gezielte Ablagerung von Wirkstoffträgern an Endothelzellen in fabrizierten, realen, dreidimensionalen menschlichen Arterienmodellen unter physiologischem Fluss zu untersuchen und abzubilden. Die vorgestellte Methode könnte als neue Plattform für die Gezielter von Wirkstoffträgern innerhalb des Gefäßsystems dienen.

In vitro 3D-zellkulierte arterielle Modelle zur Untersuchung des vaskulären Wirkstoff-Targetings unter Flow

Hier haben wir ein Organ-on-a-Chip-Modell für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta entwickelt, um die in vivo biomechanische Belastung von glatten Muskelzellen in der menschlichen Aortenwand zu replizieren.

Konstruktion eines Organ-on-A-Chip-Modells für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta zur Rekapitulation biomechanischer Dehnungen in der Aortenwand

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erhaltung der menschlichen arteriellen Architektur vor, indem gewebestabilisierendes Gel in das Gefäßlumen infundiert wird, bevor es für die molekulare oder histopathologische Analyse geschnitten wird.

In vitro Intraluminale Gelinfusion: Ein fortschrittlicher Ansatz für die mikroskopische Analyse menschlicher Widerstandsarterien

Lernen Sie die etablierte Zellkulturmethode zur Untersuchung myoendothelialer Verbindungen in Widerstandsarterien. Dieses Modell ermöglicht die spezifische Isolierung von Zellfraktionen zur Analyse von Signalwegen.

Eine Kultur Zellmodell der Widerstand Arterien

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