Live Cell Imaging von Pilzzellen Modi des Eintrags und subzelluläre Lokalisation der antimykotische Pflanze Defensine zu untersuchen

Pflanzlichen Defensine spielen eine wichtige Rolle in der Verteidigung der Pflanze gegen Krankheitserreger. Für effektive Nutzung dieser antimykotische Peptide als Antimykotika, verstehen ihre Wirkungsweisen (MOA) entscheidend ist. Hier ist eine live-Cell-imaging-Methode beschrieben, um kritische Aspekte der MOA dieser Peptide zu studieren.

Das übergeordnete Ziel dieser Lebendzell-Bildgebungsmethode ist es, kritische Aspekte der Wirkmechanismen von antimykotischen Pflanzendefensinen in Pilzzellen zu untersuchen. Mit dem Aufkommen fortschrittlicher konfokaler Mikroskopietechniken ist die Bildgebung lebender Zellen zu einem leistungsfähigen Werkzeug geworden, um die Wirkungsweisen von antimykotischen Pflanzendefensinen zu untersuchen. Unter Verwendung dieser Technologie stellen wir hier eine Methode vor, die hilft, Schlüsselfragen zum Verständnis der Wirkungsweisen von antimykotischen Pflanzendefensinen zu beantworten.

Unsere Schwerpunkte liegen darin, wie diese Peptide in die Pilzzellen internalisiert werden und wie diese Peptide in den Zellorganellen lokalisiert oder im Zytoplasma diffundiert werden. Um eine konidiale Suspension des PH-1-Stammes von Fusarium graminearum herzustellen, werden zunächst Kulturen des Stammes auf Platten mit vollständigem Medium eingerichtet. Kultivieren Sie sie fünf Tage lang bei 28 Grad Celsius.

Um Konidien herzustellen, inokulieren Sie vier Pfropfen der fünf Tage alten Kultur mit einem Durchmesser von 10 Millimetern in 50 Milliliter Carboxymethylcellulosemedium. Kultivieren Sie diese Plugs vier bis sieben Tage lang bei 28 Grad Celsius auf einem Rotationsschüttler mit 180 U/min. Wenn die Kulturen eine rote Farbe haben, haben sich die Konidien gebildet.

Um die Konidien in einer Suspension zu sammeln, wirbeln Sie die Flüssigkultur und filtrieren Sie einen Milliliter davon durch zwei Schichten Filtermaterial in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Die Suspension wird zwei Minuten lang zentrifugiert, und der Überstand wird verworfen. Waschen Sie dann das Pellet mit einem Milliliter sterilem Wasser und wiederholen Sie die Zentrifugation.

Als nächstes resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 2x SFM. Zählen Sie dann die Konidien mit einem Hämozytometer und stellen Sie die Dichte der Suspension auf 100.000 Konidien pro Milliliter ein. Um eine konidische Suspension von Neurospora crassa herzustellen, werden Konidien aus Stammkulturen in ein schräges Röhrchen mit Vogel-Agar-Medium überführt und die Röhrchen fünf Tage lang bei Raumtemperatur unter konstantem Licht inkubiert.

Nach fünf Tagen wird eine kleine Menge der wachsenden Kultur mit einer Impfschlaufe in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern Flüssigmedium von Vogel's überführt. Achten Sie darauf, die Konidien aus der Schlaufe zu mischen. Filtrieren Sie dann die Suspension, zentrifugieren Sie sie und resuspendieren Sie das Konidienpellet in Vogel's Medium ohne Waschschritt.

Stellen Sie schließlich die endgültige Suspension auf 100.000 Konidien pro Milliliter ein. Um eine Keimvorbereitung für die konfokale Mikroskopie herzustellen, pipettieren Sie 50 Mikroliter Konidiensuspension auf eine 35-Millimeter-Kulturschale und lassen Sie die Konidien drei bis sechs Stunden lang bei Raumtemperatur keimen. Pipettieren Sie für die konfokale Mikroskopie 50 Mikroliter Konidiensuspension in eine 10-Millimeter-Mikrovertiefung mit Glasbodenschale.

Geben Sie dann bei der vorgegebenen minimalen Hemmkonzentration 50 Mikroliter fluoreszenzmarkierte Defensine in die Suspension und inkubieren Sie die Konidien mit den markierten Defensinen für 2,5 Stunden bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation fügen Sie zwei Mikroliter des membranselektiven Farbstoffs FM4-64 hinzu, um eine Endkonzentration von fünf Mikromolaren zu erreichen. Inkubieren Sie die Kultur dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie die Konidien untersuchen.

Um das konfokale Mikroskop einzurichten, wählen Sie den Weißlichtlaser aus. Verwenden Sie die 488-Nanometer- und 550-Nanometer-Laser, um die mit Rhodamin markierten Defensine bzw. den FM4-64-Farbstoff anzuregen. Stellen Sie diese Laser auf eine Intensität von 1 % ein. Stellen Sie dann die Detektionswellenlängen auf 580 bis 700 Nanometer für das mit Rhodamin markierte Defensin und auf 690 bis 800 Nanometer für den Farbstoff FM4-64 ein.

Sammeln Sie nun die Bilder. Für die Zeitraffer-Bildgebung geben Sie 50 Mikroliter konidiale Suspension in eine Mikrotiterschale mit Glasboden. Montieren Sie als Nächstes die Mikrotiterschüssel am Mikroskop und suchen Sie die Zellen mit geringer Leistung.

Wechsle dann zu einem 100x, 1,44 Ölobjektiv. Um die mit DyLight550 markierten Defensine zu beobachten, stellen Sie die Laserlinie auf 550 Nanometer für die Anregung und auf 560 bis 600 Nanometer für die Detektion ein. Stellen Sie als Nächstes den Scan-Modus auf xyzt ein.

Legen Sie dann die Z-Position, den Zoom, die Häufigkeit der Bildaufnahme usw. nach Bedarf fest. Fügen Sie nun der konidischen Suspension 50 Mikroliter fluorophormarkierte Defensine in der minimalen inhibitorischen Konzentration von drei Mikromolaren hinzu und fügen Sie zwei Mikroliter des membranselektiven Farbstoffs FM4-64 für eine Endkonzentration von fünf Mikromolaren hinzu. Fokussieren Sie dann die Optik bei Bedarf neu.

Legen Sie vor der Bildaufnahme kleine Stücke nasses Filterpapier in die Mikrotiterschale, um eine Verdunstung zu verhindern. Fahren Sie dann fort mit der Aufnahme eines Bildes alle 3,5 Minuten über 2,5 Stunden. Es wurde eine Bildgebung der lebenden Zellen durchgeführt, um die Internalisierung und subzelluläre Lokalisation von zwei Defensinen aus Medicago truncatula zu verfolgen und zu vergleichen.

Chemisch synthetisiertes, mit Rhodamin markiertes Defensin vier wurde in Neurospora crassa und Fusarium graminearum unterschiedlich gehandelt. FM4-64 markierte die Plasmamembranen beider Pilze. In Fusarium ist Defensin vier jedoch im Zytoplasma diffundiert.

In Neurospora hingegen wird es zu vesikulären Körpern transportiert. Zum Vergleich wurde Defensin fünf mit einer DyLight550-Markierung in Neurospora crassa zusammen mit der Plasmamembranmarkierung durch FM4-64 visualisiert. Die Bildgebung im Zeitraffer zeigt, dass dieses Defensin innerhalb von 30 bis 40 Minuten in die Zellen gelangt und dann durch das Zytoplasma diffundiert.

Dies unterscheidet sich vom Transport von Defensin vier, das in die Zellen eindringt und auch nach drei Stunden noch in den vesikulären Körpern eingeschlossen bleibt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Bildgebung lebender Zellen ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um unser Verständnis der Wirkungsweisen von antimykotischen Pflanzenunterschieden zu verbessern. Zusammen mit anderen lebenswichtigen Fluoreszenzfarbstoffen und zellulären Markern hat es die Flexibilität, für andere antimikrobielle Peptide modifiziert zu werden.

Letztendlich kann diese Technik dazu beitragen, neue Strategien für den Einsatz von antimikrobiellen Peptiden als Antimykotikum in Landwirtschaft und Medizin zu entwickeln.