Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Live-Bildgebung und einfache Quantifizierungsmethoden zur Analyse der embryonalen Epithelzellmorphologie zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zuerst alle Werkzeuge und Apparate bereit gemacht werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, X explan aus Froschembryonen zu entfernen und sie für die Langzeitkultur in Kammern unterzubringen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, hochauflösende Bilder von Epithelzellen in Echtzeit zu sammeln. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Quantifizierung morphologischer Details von Epithelzellen mit Hilfe von Image J. Letztendlich können durch hochauflösende konfokale Mikroskopie Ergebnisse erzielt werden, die verfolgte Zellbereiche und Membranintensitäten zeigen. Hallo, ich bin Sagar Joshi vom Davidson Laboratory im Department of Bioengineering an der University of Pittsburgh.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Lebendzellbildgebung und quantitativen Analyse von embryonalen Epithelzellen von Xenos lavia. Wir verwenden dieses Verfahren, um Veränderungen des Zell-Zytoskeletts in Echtzeit zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Um Kammern für die Kultivierung von Tierkappen vorzubereiten, verwenden Sie Silikonfett, um eine spezielle Acrylkammer oder eine kleine Nylonscheibe auf einem großen 45 x 50 Millimeter großen Deckglas abzudichten. Geben Sie einen Milliliter 1 % BSA in einem Drittel XMBS in die Kammer. Beschichten Sie kleine Deckglasfragmente mit der gleichen Lösung, inkubieren Sie sie zwei bis vier Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius.

Um die Haftung des X-Explans am Glas zu verringern, spülen und füllen Sie die Kammer mit DFA-Medium bis kurz vor dem Einfüllen des XS, spülen Sie die Deckglasfragmente auf die gleiche Weise. Tauchen Sie sie dann in eine Schale mit DFA-Kulturembryonen, die im Ein- bis Vierzellstadium mit dem gewünschten MR NA in das gewünschte Stadium in einem Drittel XMBS mikroinjiziert wurden. Verwenden Sie eine Transferpipette mit einer schrägen Öffnung, um die Embryonen unter einem Präparier-Stereomikroskop in eine Schale mit DFA zu übertragen.

Verwenden Sie eine Pinzette, um die Embryonen zu formen, um eine tierische CapEx-Pflanze zu entfernen. Verwenden Sie eine Haarschlaufe, um einen Embryo in einer Position zu stützen. Mache mit einem Haarmesser einen kleinen Schnitt in die Tierstange.

Machen Sie wiederholte glatte Schnitte, um den Schnitt zu verlängern und das Kappenektoderm zu entfernen. Excise three oder four x explan auf die gleiche Weise. Und befördern Sie sie mit einer Transferpipette in die vorbereitete Kulturkammer.

Positionieren Sie mit der Haarschlaufe jedes X so, dass das Epithel zum Boden der Kammer zeigt. Mit einer Pinzette. Halten Sie ein Deckglasfragment in der Mitte.

Tauchen Sie die Enden in Silikonfett. Platzieren Sie ein Fragment über jedem X-Plan. Fixiere jedes Fragment leicht mit kleinen Tupfern Silikonfett.

Achten Sie darauf, den X Explan nicht mit übermäßiger Wucht vollständig zu zertrümmern. Füllen Sie die Kammer mit DFA, bestreichen Sie die oberen Ränder der Kammer mit Silikonfett. Versiegeln Sie dann die Oberseite mit einem 24 x 40 Millimeter großen Deckglas.

Passen Sie den Pegel des DFA in der Kammer an, um Luftblasen zu reduzieren, und verwenden Sie Taschentuch, um Überläufe abzutupfen. Die X-Pflanzen können nun in der verschlossenen Kammer einen Tag lang bei Raumtemperatur kultiviert werden, schieben Sie das 20-fach-Objektiv eines konfokalen Mikroskops an seinen Platz. Positionieren Sie die Kammer mit dem X-Explan auf dem Mikroskoptisch und platzieren Sie kleine Ausgleichsgewichte auf der Kammer, um sie unter dem Hellfeld in Position zu halten.

Passen Sie den Fokus an und verwenden Sie die Kurspositionierung, um die apikalen Enden der oberflächlichen Zellen zu visualisieren. Wechseln Sie zu Fluoreszenz und einem Objektiv mit höherer Leistung. Um Einzelbilder oder Zeitrafferfilme des Explan-Epithels zu sammeln, stimmen Sie die Aufnahme ab, um das bestmögliche Bild zu erhalten.

Im schriftlichen Teil dieses Protokolls finden Sie Tipps zur Abstimmung und Bildgebung. Die Laserleistung so gering wie möglich halten. Nehmen Sie Bilder oder Zeitrafferfilme des x explan-Epithels auf.

Vorschläge zur Datenerfassung finden Sie im schriftlichen Teil des Protokolls. Konfokale Bilddateien können auf verschiedene Weise nach Daten durchsucht werden. Hier sind zwei Beispiele für die Analyse von Datendateien mit der Analysesoftware Image J mit dem Plugin für Bioformate.

Um die Zellfläche einer Epithelzelle zu messen, ziehen Sie das Menü "Analysieren" herunter und klicken Sie auf "Messungen festlegen". Wählen Sie das Auswahlwerkzeug aus der Symbolleiste aus und umreißen Sie die Zelle im Menü "Analysieren", wählen Sie "Werkzeuge" und dann "ROI-Manager" aus. Um den Manager für Interessenbereiche zu öffnen, drücken Sie die Strg-Taste t.

Um die Gliederung zum ROI-Manager hinzuzufügen, wählen Sie so viele Gliederungen aus dem Bild aus und fügen Sie sie hinzu. Klicken Sie dann auf Speichern, um den im ROI-Manager festgelegten ROI zu speichern. Klicken Sie auf Messen.

Das Ergebnisfenster zeigt nun die gemessenen Bereiche jedes ROI an. Um die Intensität einer Zellmembran zu messen, wählen Sie das Werkzeug für gerade Linien aus der Symbolleiste von Bild J aus. Zeichnen Sie eine senkrechte Linie über die Membran.

Drücken Sie STRG T wie im vorherigen Beispiel. Um die Auswahl zum ROI-Manager hinzuzufügen, ziehen Sie das Analysemenü herunter und klicken Sie auf Diagrammprofil, um ein Diagramm der relativen Intensitäten über die Linie zu erstellen. Um das Diagramm als Bild zu speichern, klicken Sie im neuen Zeichnungsfenster, das angezeigt wird, auf Speichern.

Ziehen Sie das Listenmenü nach unten, um zu speichern, da Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie ein Live-Image und eine Quantifizierung embryonaler Epithelzellen aus herausgeschnittenen tierischen CapEx erklären. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dem DFA ein Antibiotikum und ein Antibiotikum hinzuzufügen. Um das Wachstum von Bakterien und Pilzen zu verhindern, seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie Explantate unter die Deckgläser drücken, da mehr als der erforderliche Druck den Explan zerschlagen kann.

Es ist auch wichtig, daran zu denken, optimale Einstellungen am konfokalen Mikroskop vorzunehmen, um Bilddaten von maximaler Qualität zu erhalten. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.