Name: Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Lernen Sie Live-Cell-Imaging und quantitative Analyse embryonaler Epithelzellen in Xenopus laevis. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellmorphologie und -dynamik in Echtzeit mittels Konfokalmikroskopie.

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Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (R01-HD044750), ein Career-Stipendium der National Science Foundation und unterstützt von der American Heart Association (Beginning Grant-in-Aid) unterstützt. Die Autoren danken Davidson Lab Mitglieder: HY Kim, M. von Dassow und J. Zhou (für Hilfe bei den täglichen Aufgaben lab) und Lin Zhang für ihre Unterstützung in der Molekularbiologie und der Synthese von mRNA. Wir erkennen an experimentellen Anstrengungen aller Frosch Labors (insbesondere Ray Keller und Doug DeSimone ist), die bis zu einem gewissen Teil dieses Protokolls beigetragen haben, durch die Entwicklung und Erprobung verschiedener Methoden im Laufe der Jahre. Wir danken Richard Harland und John Wallingford für die freundliche Gaben der MEM-gfp und Moesin-gfp Plasmide jeweils.

<ol><li>Ninomiya, H., Winklbauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+coating+controls+mesenchymal+shape+change+through+tissue-positioning+effects+and+reduction+of+surface-minimizing+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial coating controls mesenchymal shape change through tissue-positioning effects and reduction of surface-minimizing tension.</a> Nat Cell Biol. 10 (1), 61-61 (2008).</li>
<li>Kay, B. K., Peng, H. B. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1991).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Cohen, S., Au, S., Pante, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Tables of Xenopus laevis (Daudin). , Elsevier North-Holland Biomedical Press. Amsterdam. (1967).</li>
<li>Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+wound+healing+by+apical+contraction+and+ingression+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 53 (3), 163-163 (2002).</li>
<li>Joshi, S. D., Dassow, M. von, Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+control+of+excitable+embryonic+tissues%3A+three+stimuli+induce+rapid+epithelial+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental control of excitable embryonic tissues: three stimuli induce rapid epithelial contraction.</a> Exp Cell Res. 316 (1), 103-103 (2010).</li>
</ol>

Wir haben experimentelle Protokolle regelmäßig in unserem Labor zu Bild dynamisch verändernden Zytoskeletts in der apikalen Zell-Kortex und oszillierenden Zellmembranen von Epithelzellen in Xenopus Embryonen verwendet präsentiert. Man sollte diese Protokolle als Ausgangspunkt für die Live-Darstellung von Epithelzellen Formen verwenden; Optimierung dieses Protokoll ist wichtig, und einige der Einstellungen ändern, abhängig von der Art des Mikroskop-System man hat und die Art der Proteine ​​ist man in der Bildgeb...

live-cell-imaging und quantitative analyse der embryonalen epithelzellen in xenopus laevis</em

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonale Epithelzellen dienen als ideales Modell, um Morphogenese Studie, in der multi-Zellgewebe Veränderungen in ihrer Geometrie, wie Veränderungen in der Zelle Oberfläche und Zellenhöhe unterziehen, und wo Zellen durchlaufen Mitose und Migration. Darüber hinaus können Epithelzellen regulieren auch morphogenetischen Bewegungen in benachbarte Gewebe<sup&gt; 1</sup&gt;. Eine traditionelle Methode zur epithelialen Zellen und Geweben Studie beinhalten chemische Fixierung und histologische Methoden, um Zellmorphologie oder Lokalisierung bestimmter Proteine ​​von Interesse zu bestimmen. Diese Ansätze weiterhin nützlich zu sein und bieten &quot;Schnappschüsse&quot; von Zellformen und Gewebe-Architektur, aber es bleibt noch viel zu überlegen, wie Zellen erwerben spezifische Formen, wie verschiedene Proteine ​​oder verschieben zu lokalisieren, um bestimmte Positionen, und welche Wege Zellen zu ihrer endgültigen folgen verstanden werden differenzierte Schicksal. Hochauflösende Live-Bildgebung ergänzt herkömmliche Methoden und erlaubt auch mehr direkte Untersuchung der Dynamik zellulärer Prozesse bei der Bildung, Wartung und Morphogenese vielzelliger epithelialen Blatt beteiligt. Hier zeigen wir experimentelle Methoden aus der Isolation des Tieres Kappe Gewebe aus<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen konfokale Bildgebung von Epithelzellen und einfache Messung Ansätze, die zusammen molekularen und zellulären Studien der epithelialen Morphogenese erweitern können.

Xenopus embryonalen Epithelien sind ein ideales Modellsystem, um die Zelle Verhaltensweisen wie Polarität Entwicklung und Formänderung beim epithelialen Morphogenese zu studieren. Traditionelle Histologie des festen Proben wird zunehmend durch Live-Cell-konfokale Bildgebung ergänzt. Hier zeigen wir Methoden, um Frosch Gewebe zu isolieren und zu visualisieren leben Epithelzellen und deren Zytoskelett mit Live-cell konfokalen Mikroskopie.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonale Epithelzellen dienen als ideales Modell zur Untersuchung der Morphogenese, bei der mehrzellige Gewebe Änderungen in ihrer Geometrie durchlaufen, wie zum Beispiel Veränderungen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Live-Bildgebung und einfache Quantifizierungsmethoden zur Analyse der Morphologie embryonaler epithelialer Zellen zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst alle Werkzeuge und Geräte bereitgestellt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, X explan aus Froschembryonen zu entnehmen und sie in Kammern für eine Langzeitkultur unterzubringen.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, hochauflösende Bilder von Epithelzellen in Echtzeit aufzunehmen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Quantifizierung morphologischer Details von Epithelzellen mithilfe von ImageJ. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die verfolgte Zellareale und Membranintensitäten mittels hochauflösender konfokaler Mikroskopie zeigen. Hallo, ich bin Sagar Joshi vom Davidson Laboratory am Department für Bioingenieurwesen der University of Pittsburgh.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Live-Cell-Bildgebung und quantitativen Analyse embryonaler epithelialer Zellen von Xenos lavia. Wir verwenden dieses Verfahren, um Echtzeit-Veränderungen des Zellzytoskeletts zu untersuchen. Beginnen wir also.Um Kammern für die Kultivierung von Animal-Cap-Explanten vorzubereiten, verwenden Sie Silikonfett, um eine benutzerdefinierte Acrylkammer oder eine kleine Nylonunterlegscheibe auf einem großen Deckglas mit den Maßen 45 mal 50 Millimeter abzudichten. Geben Sie ein Milliliter 1 % BSA in einem Drittel XMBS in die Kammer. Beschichten Sie kleine Deckglasstücke mit derselben Lösung und inkubieren Sie sie zwei bis vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Um die Adhäsion des X-Explanten an dem Glas zu verringern, spülen und füllen Sie die Kammer mit DFA-Medium, kurz bevor die Xs übertragen werden. Spülen Sie die Deckglasfragmente auf dieselbe Weise ab. Tauchen Sie sie dann in eine Schale mit DFA-Kultur-Embryonen, die im Ein- bis Vierzellstadium mit der gewünschten MRNA bis zum gewünschten Stadium in einem Drittel XMBS mikroinjiziert wurden. Verwenden Sie eine Transferpipette mit schrägem Öffnungsende, um die Embryonen unter einem Stereomikroskop in eine Schale mit DFA zu überführen.Verwenden Sie eine Pinzette, um die Embryonen zu fixieren, um eine tierische CapEx-Anlage zu entnehmen. Benutzen Sie eine Haarschleife, um einen Embryo in einer Position zu stützen. Nutzen Sie ein Haarmesser, um eine kleine Inzision am animalen Pol vorzunehmen.Führen Sie wiederholte, gleichmäßige Schnitte aus, um den Einschnitt zu verlängern und das Kappektoderm zu entfernen. Entfernen Sie drei oder vier x explan auf die gleiche Weise und verwenden Sie eine Transferpipette, um sie in die vorbereitete Kulturkammer zu bringen.Platzieren Sie mithilfe der Haarschleife jedes X-Explan so, dass das Epithel zur Kammerunterseite weist. Halten Sie ein Deckglasfragment mit der Pinzette in der Mitte fest.Tauchen Sie die Enden in Silikonfett. Legen Sie ein Fragment über jedes X-Explan. Befestigen Sie jedes Fragment leicht mit kleinen Tupfern Silikonfett an seiner Stelle.Darauf achten, den X-explan nicht mit übermäßiger Kraft vollständig zu zerquetschen. Die Kammer mit DFA füllen und die oberen Kanten der Kammer mit Silikonfett beschichten. Anschließend die Oberseite mit einem 24 x 40 Millimeter großen Deckglas versiegeln.Stellen Sie den Pegel des DFA in der Kammer ein, um Luftblasen zu reduzieren, und tupfen Sie mit einem Tuch jeglichen Überlauf ab. Die X-Pflanzen können nun langfristig für einen Tag bei Raumtemperatur in der verschlossenen Kammer kultiviert werden; bringen Sie das 20×-Objektiv eines konfokalen Mikroskops in Position. Platzieren Sie die Kammer mit dem X-Explant auf dem Mikroskopständer und legen Sie kleine Ausgleichsgewichte auf die Kammer, um sie unter Hellfeldbedingungen festzuhalten.Stellen Sie den Fokus ein und verwenden Sie die grobe Positionierung, um die apikalen Enden der oberflächlichen Zellen sichtbar zu machen. Wechseln Sie zur Fluoreszenz und einem Objektiv mit höherer Vergrößerung. Um Einzelbilder oder Zeitrafferaufnahmen des explantierten Epithels aufzunehmen, optimieren Sie die Aufnahme, um das bestmögliche Bild zu erhalten.Beziehen Sie sich auf den schriftlichen Teil dieses Protokolls für Hinweise zur Justierung und Bildgebung. Halten Sie die Laserleistung so niedrig wie möglich. Nehmen Sie Bilder oder zeitraffende Filme des x explan Epithels auf.Beachten Sie den schriftlichen Teil des Protokolls für Vorschläge zur Datensammlung. Konfokale Bilddateien können auf verschiedene Weisen zur Datenanalyse genutzt werden. Hier sind zwei Beispiele, wie man Datendateien mithilfe der Bildanalyse-Software ImageJ mit Bio-Formats-Plugin analysiert.Um die Zellfläche einer epithelialen Zelle zu messen, ziehen Sie das Menü „Analyze“ herunter und klicken Sie auf „Set Measurements“. Wählen Sie das Auswahlwerkzeug aus der Symbolleiste und umranden Sie die Zelle. Gehen Sie im Menü „Analyze“ auf „Tools“ und anschließend auf „ROI Manager“. Um den Manager für interessierende Bereiche zu öffnen, drücken Sie Strg+T.Um die Konturen dem ROI-Manager hinzuzufügen, wählen Sie beliebig viele Konturen aus dem Bild aus und fügen Sie sie hinzu. Klicken Sie dann auf „Speichern“, um den ROI-Satz im ROI-Manager zu speichern. Klicken Sie auf „Messen“.Das Ergebnisfenster zeigt nun die gemessenen Flächen jeder ROI an. Um die Intensität einer Zellmembran zu messen, wählen Sie das Linienzeichentool aus der ImageJ-Symbolleiste aus. Zeichnen Sie eine senkrechte Linie über die Membran.Drücken Sie STRG+T wie im vorherigen Beispiel. Um die Auswahl dem ROI-Manager hinzuzufügen, öffnen Sie das Analyse-Menü und klicken Sie auf Profil plotten, um ein Diagramm der relativen Intensitäten entlang der Linie zu erzeugen. Um das Diagramm als Bild zu speichern, klicken Sie im neu erscheinenden Plot-Fenster auf Speichern.Klappen Sie das Listenmenü nach unten auf „Datei“ und dann auf „Speichern unter“. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man lebende Bilder von embryonalen epithelialen Zellen aus ausgeschnittenen Animal-Cap-Explantaten aufnimmt und quantifiziert. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, Antibiotikum und Antibiotikum dem DFA hinzuzufügen. Um bakterielles und pilzliches Wachstum zu verhindern, achten Sie besonders darauf, die Explantate unter den Deckgläsern vorsichtig zu drücken, da ein zu starker Druck das Explantat zerquetschen kann.Es ist außerdem wichtig, daran zu denken, am konfokalen Mikroskop optimale Einstellungen zu wählen, um Bildergebnisse von maximaler Qualität zu erhalten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mit feiner Spitze Mikropipetten spritzen wir Plasmid-DNA in Subdomains Huhn Somiten oder neuronale Röhren. Die Konzentration der Plasmid wird angepasst, um einzelne transfizierten Zellen zu generieren. Dann erlauben wir die Zellen in klonalen Populationen zu entwickeln.

Single Cell Transfektion in Hühnerembryonen

Imaging embryonalem Gewebe in Echtzeit wird über längere Zeit eine Herausforderung. Hier präsentieren wir Ihnen einen Test zur Überwachung der zellulären und subzellulären Veränderungen im Rückenmark Küken für längere Zeit mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Diese Technik kann für andere Regionen des Nervensystems und sich entwickelnden Embryo angepasst werden.

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

Xenopus laevis bietet ein ideales Modellsystem zur Untersuchung von Zell Schicksal Spezifikation und physiologische Funktion der einzelnen Zellen der Netzhaut in primären Zellkulturen. Hier stellen wir eine Technik zum Präparieren Netzhautgewebe und Erzeugen primären Zellkulturen, die für Calcium-Aktivität abgebildet und analysiert werden durch in situ-Hybridisierung.

Dissection, Kultur und Analyse der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Netzhautgewebe

Hier entwickeln wir die notwendigen Werkzeuge...

Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

Das Manuskript hier bietet eine einfache Reihe von Methoden für die Sekretion und Verbreitung von fluoreszierend markierten Liganden in Xenopus-Analyse. Dies bietet einen Rahmen für die Prüfung der Fähigkeit von anderen Proteinen zu Ligand Verteilung ändern und erlaubt Experimente, die Einblick in die Mechanismen, die Morphogen Gradienten geben kann.

Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

Dieses Protokoll zeigt eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Vaskulatur und zur Quantifizierung ihrer Komplexität in Xenopus tropicalis . Blutgefäße können nach der Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das schlagende Herz eines Embryos nach genetischen und / oder pharmakologischen Manipulationen abgebildet werden, um die kardiovaskuläre Entwicklung in vivo zu untersuchen.

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Wir präsentieren ein zweiteiliges Protokoll, das fluoreszierende Calcium-Bildgebung mit In-situ-Hybridisierung kombiniert, so dass der Experimentator Muster der Calciumaktivität mit Genexpressionsprofilen auf einzelzelligem Niveau korrelieren kann.

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Wir beschreiben ein einfaches Protokoll zur Entwicklung von mukociliären Epithelorganoiden aus tiefen Ektodermzellen, die aus Xenopus laevis Embryonen isoliert sind. Die multipotenten Vorläufer regenerieren epitheliale Kelchenzellvorläufer und ermöglichen eine Live-Tracking der Initiation und Progression der Zellübergänge auf der Oberfläche von Organoiden.

Mukociliäre Epithelorganoide aus Xenopus Embryonal cells: Generation, Culture und High-Resolution Live Imaging

Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie ist das wertvollste Werkzeug in der Entwicklungsbiologie. Ein wichtiges Thema in vergleichenden Studien ist die Varianz der Umgebung. Unser Protokoll beschreibt ein experimentelles Framework für die gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Proben und befasst sich daher proaktiv mit diesem Problem.

Gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Insektenembryonen in probenkammerbasierten Lichtbogenfluoreszenzmikroskopen

Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung und Live-Bildgebung von unverdünnten zytoplasmatischen Extrakten aus Xenopus laevis-Eiern .

Xenopus laevis Ei-Extrakt-Zubereitung und Live-Bildgebungsverfahren zur Visualisierung der dynamischen zytoplasmatischen Organisation

In dieser Arbeit beschreiben wir eine massenspektrometriebasierte proteomische Charakterisierung von Zelllinien mit bekannten Gewebeschicksalen im Embryo von Xenopus laevis im Wirbeltier.

Zellliniengesteuerte Massenspektrometrie-Proteomik im sich entwickelnden (Frosch-)Embryo

Lernen Sie Live-Cell-Imaging und quantitative Analyse embryonaler Epithelzellen in Xenopus laevis. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellmorphologie und -dynamik in Echtzeit mittels Konfokalmikroskopie.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis

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