Eine morphometrische und zelluläre Analysemethode für das Murine mandibulares Kondylus

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Auswirkungen der Druckbelastung im Unterkieferkondylenknorpel von Mäusen mit Hilfe morphometrischer Messungen in Röntgenaufnahmen und histologischen Analysen zu beobachten. Diese Metriken können helfen, wichtige Fragen zu den strukturellen und zellulären Veränderungen im Unterkieferkondylus von Nagetieren zu beantworten. Der Hauptvorteil der hier gezeigten Technik besteht darin, dass sie zur Analyse anderer kleiner geborener oder beteiligter Tiere verwendet werden können.

Halten Sie für dieses Protokoll isolierte, präparierte Mausmandibeln zur Verwendung bereit. Auf einer Petrischale werden die Mandibeln in ein Röntgenschranksystem überführt. Nehmen Sie dann fünf Sekunden lang Röntgenaufnahmen bei 26 Kilovolt auf.

Öffnen Sie nun die Bilder in der Analysesoftware, um morphometrische Messungen durchzuführen. Verwenden Sie zunächst die Einheitentaste, um die Maßstabsleiste einzurichten. Wählen Sie als Nächstes sechs anatomische Punkte mit dem Markierungsstil 2 aus.

Wählen Sie zunächst die hintersten Punkte des Unterkieferkondylus als Punkt eins aus. Wählen Sie als Nächstes den inzessierten Prozess für Punkt zwei aus. Wählen Sie dann den tiefsten Punkt an der Sigmakerbe für Punkt drei aus.

Wählen Sie als nächstes den tiefsten Punkt in der Konkavität des Unterkieferastes, Punkt vier, und wählen Sie dann den vordersten Punkt der Gelenkfläche des Kondylen, Punkt fünf. Wählen Sie nun den hintersten Punkt der Kondylengelenkfläche als Punkt sechs aus und fahren Sie mit der Längenmessung mit dem Längenwerkzeug fort. Verwenden Sie als Nächstes das Werkzeug für die senkrechte Linie von den Punkten drei bis vier, um die Länge des Kondylenkopfes zu messen, d. h. die Länge der Senkrechten von Punkt eins bis zur Linie zwischen den Punkten drei und vier.

Messen Sie dann die Länge des Unterkiefers zwischen den Punkten eins und zwei. Messen Sie abschließend die Breite des Kondylenkopfes, die zwischen den Punkten fünf und sechs liegt. Um die Daten zu speichern, kopieren Sie die Messliste auf der rechten Seite des Bildschirms.

Bevor Sie die festen, aber nicht entkalkten Mandibeln einbetten, weichen Sie sie über Nacht in 30 Prozent Saccharose in PBS ein. Präparieren Sie am nächsten Tag überschüssiges Weichgewebe und schneiden Sie den Unterkieferkondylus vorsichtig ab. Legen Sie nun die Proben in Kunststoffformen, wobei die mediale Oberfläche des Kondylus gegen den Boden der Form und die Probe parallel zum Boden der Form verläuft.

Tauchen Sie sie dann in Einbettungsharz und kühlen Sie das Harz mit einem Stück Trockeneis. Füllen Sie als Nächstes die Formen mit mehr Einbettungsharz auf. Übertragen Sie sie in kaltes zwei Methylbutan, gekühlt durch einen Gefrierschrank oder durch Trockeneis.

Nach dem Abkühlen werden die Proben bei minus 20 Grad Celsius oder bei minus 80 Grad Celsius gelagert, um sie zu schneiden. Um die Col10a1-Expression in der MCC von sagittalen Abschnitten von Kondylen zu quantifizieren, öffnen Sie die histologischen Bilder in einem Bildanalyse-Softwarepaket und wählen Sie den interessierenden Bereich mit dem Lasso-Werkzeug aus. In diesem Fall wird die MCC-Region ausgewählt.

Notieren Sie sich die Anzahl der Pixel in dem Bereich, die im Histogrammfeld angegeben ist. Wählen Sie als Nächstes die roten Pixel Col10a1 aus, indem Sie den Farbbereich anpassen. Wählen Sie mit der Pipette ein rotes Pixel aus dem Bild aus und klicken Sie auf OK. Notieren Sie dann die Anzahl der roten Pixel in dem Bereich, wie im Histogrammfeld angegeben.

Der Anteil der roten Pixel in diesem Bereich stellt die Menge der Col10a1-Expression dar. Quantifizieren Sie nun mit der gleichen grundlegenden Technik die TRAP-Aktivität im MCC und im subchondralen Knochen. Wählen Sie zunächst den Knorpel in subchondralen Knochenregionen als zu analysierende Bereiche aus und notieren Sie sich die Gesamtpixel

Wählen Sie dann die gelben Pixel aus, die vom ELF97-Substrat generiert werden. Notieren Sie sich die Anzahl der positiven Pixel und berechnen Sie den Anteil der positiven TRAP-Pixel. Quantifizieren Sie nun die EDU-positiven Zellen, die von DEPI blau gegengefärbt wurden.

Wählen Sie erneut den Interessenbereich aus und quantifizieren Sie dann die blauen Pixel darin. Verwenden Sie diese Methode auch, um die Anzahl der EDU-positiven Pixel in derselben Region zu bestimmen. Morphometrische Messungen an Mäusen, die einer kompressiven Kiefergelenksbelastung ausgesetzt waren, zeigten, dass die Belastung die Länge des Unterkiefer- und Kondylenkopfes signifikant erhöhte.

Dennoch führte die Belastung nicht zu einer signifikanten Veränderung der Kondylenbreite. Die Quantifizierung der Kollagenverteilung ergab einen signifikanten Anstieg der Col10a1-Expression und des MCC der Kondylen der beladenen Tiere. Auf der anderen Seite unterschied sich die Col2a1-Expression nicht wesentlich von der Kontrolle.

TRAP-Aktivität nahm in der subchondralen Region von Kondylen und beladenen Mäusen zu, ebenso wie die Subproliferation. Die EDU-Färbung gibt die Anzahl der proliferativen Zellen an. Die Proteoglykanverteilung im MCC wurde durch Auswertung des mit Toluidinblau gefärbten Bereichs und der Entfernungskarte quantifiziert.

Es gab eine signifikante Zunahme der Distanzkartierung in der MCC von Kondylen der belasteten Gruppe. Die mit Proteoglykanen gefärbte Fläche unterschied sich jedoch statistisch nicht zwischen den Gruppen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die zellulären und strukturellen Veränderungen im Unterkieferkondylus von Nagetieren analysieren können.