Eine morphometrische und zelluläre Analysemethode für das Murine mandibulares Kondylus

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Auswirkungen mechanischer Druckbelastung im knorpeligen Kiefergelenkköpfchen von Mäusen mithilfe morphometrischer Messungen in Röntgenaufnahmen und histologischer Analysen zu untersuchen. Diese Messgrößen können helfen, zentrale Fragen zu strukturellen und zellulären Veränderungen im Kiefergelenkköpfchen von Nagetieren zu beantworten. Der Hauptvorteil der hier gezeigten Methode liegt darin, dass sie auch zur Analyse anderer kleiner Säugetiere oder teilnehmender Tierarten verwendet werden kann.

Für dieses Protokoll sollten isolierte, präparierte Mausmandibeln bereitliegen. Übertragen Sie die Mandibeln in eine Petrischale und anschließend in ein Röntgensystem. Erstellen Sie dann fünf Sekunden lang Röntgenaufnahmen bei 26 Kilovolt.

Öffnen Sie nun die Bilder in der Analyse-Software, um morphometrische Messungen durchzuführen. Verwenden Sie zuerst die Einheitsschaltfläche, um die Maßstabsleiste einzurichten. Wählen Sie anschließend sechs anatomische Punkte mithilfe des Markierungsstils 2 aus.

Wählen Sie zuerst die am weitesten posterior liegenden Punkte des Kiefergelenkfortsatzes als Punkt eins. Wählen Sie anschließend den Incisorenfortsatz als Punkt zwei. Danach wählen Sie den tiefsten Punkt der Sigmoidkerbe als Punkt drei.

Wählen Sie als Nächstes den tiefsten Punkt der konkaven Fläche des Mandibularastes, Punkt vier, und danach den vordersten Punkt der kondylären Gelenkfläche, Punkt fünf. Wählen Sie nun den hintersten Punkt der kondylären Gelenkfläche als Punkt sechs aus und nehmen Sie anschließend Längenmessungen mit dem Längenmesswerkzeug vor. Verwenden Sie danach das Werkzeug für senkrechte Linien von Punkt drei zu Punkt vier, um die Länge des Kondylenkopfes zu messen, also die Länge der Senkrechten von Punkt eins zur Verbindungslinie zwischen Punkt drei und Punkt vier.

Danach messen Sie die Unterkieferlänge zwischen den Punkten eins und zwei. Zuletzt messen Sie die Breite des Kondylenkopfes, die zwischen den Punkten fünf und sechs liegt. Um die Daten zu speichern, kopieren Sie die Messwertliste auf der rechten Seite des Bildschirms.

Bevor die fixierten, aber nicht entkalkten Unterkiefer eingebettet werden, über Nacht in 30 Prozent Saccharose in PBS einweichen. Am nächsten Tag überschüssiges Weichgewebe sorgfältig entfernen und den Unterkiefergelenkköpfchen vorsichtig durchtrennen. Danach die Proben in Kunststoffformen geben, wobei die mediale Fläche des Köpfchens an der Basis der Form anliegen und die Probe parallel zum Boden der Form ausgerichtet sein sollte.

Danach in Einbettungsharz geben und das Harz mit einem Stück Trockeneis abkühlen. Anschließend die Formen mit weiterem Einbettungsharz auffüllen. Danach in kaltes Dimethylbutan überführen, das durch einen Gefrierschrank oder durch Trockeneis gekühlt wurde.

Nach dem Abkühlen die Proben bei minus 20 Grad Celsius oder bei minus 80 Grad Celsius zum Schneiden lagern. Um die Expression von Col10a1 im MCC von sagittalen Schnitten der Condyle zu quantifizieren, öffnen Sie die histologischen Bilder in einer Bildanalyse-Software und wählen mithilfe des Lasso-Werkzeugs den interessierenden Bereich aus. In diesem Fall wird der MCC-Bereich ausgewählt.

Notieren Sie die Anzahl der Pixel im Bereich, die im Histogrammfenster angegeben wird. Wählen Sie anschließend die roten Col10a1-Pixel aus, indem Sie den Farbbereich anpassen. Verwenden Sie den Pipettenwerkzeug, um einen roten Pixel aus dem Bild auszuwählen, und klicken Sie auf „OK“. Notieren Sie dann die Anzahl der roten Pixel im Bereich, wie sie im Histogrammfenster angegeben wird.

Der Anteil roter Pixel in der Fläche repräsentiert die Menge der Col10a1-Expression. Quantifizieren Sie nun mit derselben grundlegenden Technik die TRAP-Aktivität im Knorpel-Knochen-Übergang (MCC) und im subchondralen Knochen. Wählen Sie zunächst den Knorpel in den subchondralen Knochenregionen als zu analysierende Bereiche aus und notieren Sie die Gesamtanzahl der Pixel.

Danach die gelben Pixel auswählen, die durch das ELF97-Substrat erzeugt wurden. Die Anzahl der positiven Pixel notieren und den Anteil der TRAP-positiven Pixel berechnen. Anschließend die EDU-positiven Zellen quantifizieren, die durch DEPI blau gegengefärbt wurden.

Wählen Sie erneut den Bereich von Interesse aus und quantifizieren Sie dann die blauen Pixel innerhalb dieses Bereichs. Verwenden Sie diese Methode ebenfalls, um die Anzahl der EDU-positiven Pixel in derselben Region zu bestimmen. Morphometrische Messungen von Mäusen, die einer kompressiven TMJ-Belastung unterzogen wurden, zeigten, dass die Belastung die Länge des Unterkiefers und des Kondylenkopfes signifikant erhöhte.

Trotzdem führte die Belastung nicht zu einer signifikanten Veränderung der Kondylenbreite. Die Quantifizierung der Kollagenverteilung zeigte eine signifikante Zunahme der Col10a1-Expression und der MCC der Kondylen belasteter Tiere. Andererseits unterschied sich die Col2a1-Expression kaum von der Kontrolle.

Die TRAP-Aktivität stieg in der subchondralen Region der Condyle und belasteter Mäuse an, ebenso wie die Proliferation im subchondralen Bereich. EDU-Färbung zeigt die Anzahl proliferierender Zellen an. Die Proteoglykandistribution im MCC wurde durch Auswertung des mit Toluidinblau gefärbten Bereichs und der Distanzkarte quantifiziert.

Es gab eine signifikante Zunahme der Distanzabbildung im MCC der Kondylen der belasteten Gruppe. Der mit Proteoglykanen angefärbte Bereich zeigte jedoch keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man zelluläre und strukturelle Veränderungen im Kiefergelenkkondyl von Nagetieren analysiert.