Semi-automatische Analyse von Maus Skelettmuskulatur Morphologie und Fasertyp Zusammensetzung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, modernste Immunhistochemie zu verwenden, um Skelettmuskelfasertypen genau und schnell zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Muskelbiologie zu beantworten, z. B. ob Veränderungen des Fasertyps durch den Verlust funktioneller Proteine ausgelöst werden. Obwohl diese Methode Einblicke in viele Modelle von Muskelerkrankungen geben kann, kann sie auch in Systemen wie Knock-in- und Knock-out-Modellen verwendet werden, um den größeren Einfluss eines einzelnen Moleküls auf die grundlegende Muskelfunktion aufzudecken.

Trocknen Sie zunächst gefrorene Abschnitte von Mausmuskeln etwa eine halbe Stunde lang an der Luft auf geladenen Objektträgern. Zeichnen Sie nach dem Trocknen mit einem hydrophoben Barriere-PAP-Stift einen Rand um die Abschnitte auf jedem Objektträger. Um die unspezifische Antikörperbindung zu blockieren, laden Sie anschließend etwa 250 Mikroliter 5%BSA in PBS innerhalb der gezogenen Grenzen und inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Verdünnung des Primärantikörpers von eins zu 50 in 5%BSA PBS vor. Stellen Sie etwa 250 Mikroliter pro Objektträger her und lagern Sie die Antikörperverdünnung auf Eis. Nach der Blockphase aspirieren Sie die Blocklösung aus den Objektträgern und fügen Sie 250 Mikroliter Aliquots der Antikörperverdünnung hinzu.

Für eine Negativkontrolle wenden Sie 5%BSA in PBS ohne primären Antikörper an. Beladen Sie anschließend die Petrischale mit angefeuchtetem Filterpapier und decken Sie sie mit Alufolie für eine Inkubationskammer ab. Dann inkubieren Sie die Objektträger bei vier Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden in der Kammer oder in einer ähnlichen Umgebung mit der gleichen Luftfeuchtigkeit.

Nach der Inkubation des Primärantikörpers aspirieren Sie die Lösung aus den Objektträgern und waschen Sie die Objektträger dreimal. Tragen Sie bei jeder Wäsche etwa 250 Mikroliter 5%BSA in PBS für etwa 10 Minuten auf. Bereiten Sie beim Waschen der Objektträger eine bis 200 Verdünnungen der gereinigten Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper vor.

Bereiten Sie mindestens 250 Mikroliter pro Objektträger vor und bewahren Sie die Lösung im Dunkeln und auf Eis auf. Nach der dritten Wäsche geben Sie 250 Mikroliter der Sekundärantikörperverdünnung in die Objektträger. Dann inkubieren Sie die Objektträger 90 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer dunklen, feuchten Umgebung.

Nach der Inkubation aspirieren Sie die Antikörperlösung und waschen die Objektträger wie zuvor dreimal. Nachdem Sie alle überschüssigen Sekundärantikörper abgewaschen haben, spülen Sie die Objektträger mit PBS aus und lassen Sie sie 10 Minuten lang an der Luft trocknen. Zum Schluss montieren Sie die Objektträger mit einem nicht permanenten wässrigen Einbettmedium mit niedriger Viskosität.

Nachdem das Medium getrocknet ist, versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Nagellack und geben Sie die Dias in eine undurchsichtige Aufbewahrungsbox. Reinigen Sie vor der Abbildung eines Objektträgers den Deckglas mit 70 % Ethanol. Anschließend erhalten Sie digitale Bilder mit einem Epifluoreszenzmikroskop.

Wählen Sie bei geringer Vergrößerung einen Interessenbereich von einem Quadratmillimeter aus. Um Alexa 488-konjugierte Antikörper anzuzeigen, verwenden Sie einen 505-Nanometer-Langpassfilter. Um Alexa 594-konjugierte Antikörper anzuzeigen, verwenden Sie einen 595-Nanometer-Langpassfilter.

Wenn die Filter richtig eingestellt sind, können Sie mit dem Sammeln digitaler Bilder beginnen. Achten Sie darauf, einen Maßstabsbalken für die nachfolgende Analyse einzuschließen. Installieren Sie für die Analyse Fiji in dem Makro, das mit dieser Veröffentlichung bereitgestellt wird.

Speichern Sie die Makrodatei in einem leicht zugänglichen Verzeichnis. Laden Sie nun ein Hellfeldbild eines ausgewählten Abschnitts und navigieren Sie zur trainierbaren Weka-Segmentierungsoption. Um die zellularen Bereiche des Abschnitts festzulegen, zeichnen Sie eine Linie auf einer Faser und klicken Sie auf Zur ersten Klasse hinzufügen.

Um dann die extrazellulären Domänen zu markieren, zeichnen Sie eine Linie auf den Abstand zwischen den Fasern und klicken Sie auf Zur zweiten Klasse hinzufügen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis fünf bis 10 Bezeichnungen jeder Klasse definiert wurden. Es kann schwierig sein, die interstitiellen Grenzen zu markieren.

Mit der Zoomfunktion können diese Grenzen präziser markiert werden. Wählen Sie als Nächstes die Option train classifier aus. Fügen Sie auf der resultierenden roten und grünen Überlagerung manuell weitere Beschriftungen zu allen Teilen des Bildes hinzu, die durch den automatisierten Prozess falsch segmentiert wurden.

Führen Sie diesen Vorgang so lange aus, bis die rot markierten Fasern ordnungsgemäß von den grün markierten Zwischenräumen getrennt sind. Klicken Sie dann auf Wahrscheinlichkeit abrufen und speichern Sie das Bild in einem neuen Dateiordner. Wiederholen Sie nun den gesamten Vorgang mit dem Fluoreszenzbild, das aus demselben Feld aufgenommen wurde.

Markieren Sie die immungefärbten Fasern als Klasse eins und alle nicht fluoreszierenden Bereiche als Klasse zwei. Speichern Sie schließlich die resultierende Wahrscheinlichkeitskarte in demselben Ordner, in dem das verarbeitete Hellfeldbild gespeichert wurde. Öffnen Sie nun eine der zuvor gespeicherten Wahrscheinlichkeitskarten in Fidschi.

Zeichnen Sie eine gerade Linie auf der Maßstabsleiste, die von der Imaging-Software bereitgestellt wird. Wählen Sie Skalierung festlegen und geben Sie die korrekten Werte basierend auf der Skalenleiste ein. Schalten Sie dann die globale Option um, um den Maßstab für jedes Bild zu standardisieren.

Führen Sie nun das Tyagi-Makro für die Faserquantifizierung aus, und der Navigationsbereich wird angezeigt. Öffnen Sie dann den Hostordner images. Ändern Sie im zugehörigen Dialogfeld den Wert der Dropdown-Liste für den Hintergrund in hell.

Mit der Funktion "Messwerte einstellen" kann definiert werden, welche Parameter gemessen werden sollen. CSA und Fußdurchmesser sind die wichtigsten Messungen zur Quantifizierung der Fasermorphologie. Nach dem Ausführen des Makros wird der Ordner mit Bildern der Faserumrisse und Tabellenkalkulationen mit den Messungen gefüllt, die von der schlechten Analysefunktion durchgeführt wurden.

Tibialis, Musculus anterior und Musculus soleus wurden mit den beschriebenen Methoden analysiert, da sie meist entweder aus schnell zuckenden oder langsam zuckenden Fasern bestehen. Mehrere verschiedene Myosin-Schwerketten wurden mit spezifischen Antikörpern identifiziert. Ein erheblicher Teil der Soleus-Muskelfasern exprimierte schwere Myosin-Ketten vom Typ 1 und Typ 2 A, und ein beträchtlicher Teil der restlichen Fasern war positiv für Typ zwei X.By Gegensatz dazu waren praktisch keine Typ-2-B-Fasern erkennbar.

Im Vergleich dazu bestanden gefärbte Tibialis-Vorderkiefermuskeln hauptsächlich aus schweren Myosin-Fasern vom Typ 2 B und Typ 2 X mit geringeren Beiträgen von Fasern, die Typ-2-A-Ketten exprimierten, und praktisch aus keinen Fasern, die in Typ-1-Ketten exprimiert wurden. Die morphometrische Analyse eines Musculus tibialis anterior, der mit SC-71-Antikörpern untersucht wurde, die gegen die schwere Kette des Typ-A-Myosins gerichtet waren, lieferte mehrere Bildtransformationen, die zur Erstellung von Wahrscheinlichkeitskarten verwendet wurden. Durch diese einfache automatisierte Analyse erwiesen sich die Daten als vollständig vergleichbar mit Daten, die mit viel mühsameren manuellen Berechnungen erstellt wurden.

Insgesamt liefert die Analyse die Daten von insgesamt etwa 6.000 Einzelfasern. Der hohe Datendurchsatz machte die statistische Analyse weitaus praktikabler. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Muskelabschnitte immunfärbt und die mitgelieferte halbautomatische Software verwendet, um die Analyse des Muskelfasertyps und der Muskelfaserzusammensetzung zu erleichtern.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Muskeln regional heterogen sein können und dass die Analyse vieler Muskelfelder für eine rigorose Beurteilung des Muskelfasertyps und der Muskelzusammensetzung erforderlich ist. In Kombination mit diesem Verfahren können andere Methoden wie die Trichomfärbung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob sich die Fibrose parallel zu Veränderungen in der Zusammensetzung der Fasertypen entwickelt.