Name: Semi-automatische Analyse von Maus Skelettmuskulatur Morphologie und Fasertyp Zusammensetzung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Erfahren Sie eine halbautomatisierte Methode zur Analyse von Skelettmuskelfasertypen und Morphologie bei Mäusen mittels Immunhistochemie. Dieses Verfahren ermöglicht Forschern eine schnelle und präzise Klassifizierung von Muskelfasern.

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Wir sind dankbar die Boettcher-Stiftung und die Amyotrophe Lateralsklerose Association (#17-II-344) für ihre Unterstützung dieser Forschung.

alle Verfahren, die Mäuse wurden von der University of Colorado-Anschutz Medical Campus institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt (91813(05)1D).
 1. Tag1: primäre (1°) Immunostaining mit Bovine Serum Albumin (BSA) Blockierung <ol><li>an der Luft trocknen Gefrierschnitte Maus Megalosauridae Muskel (z. B. m. Tibialis anterior, Soleus) montiert auf aufgeladene Folien für ~ 30 min 11. zeichnen Sie einen Rahmen um die Abschnitte, die mit einem Stift hydrophobe Barriere PAP.</li>
	<li>Ort ~ 250 µL 5 % BSA/Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (BSA/PBS) auf jeder Folie, unspezifische Antikörperbindung zu blockieren. Inkubieren Sie Folien bei Raumtemperatur für 1 h</li>
	<li>Beim Blocken, bereiten 01:50 Verdünnungen des 1° Antikörpers Überstand in 5 % BSA/PBS (alle Maus monoklonale Antikörper sind; siehe Tabelle 1- 6 ,- 12) 250 µL vorbereiten Lösung pro Folie. ICE 1° Antikörper Aktien und Verdünnungen behalten</li>
</ol> <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg" /> Tabelle 1: Primärantikörper verwendet, um zu unterscheiden MyHCs.
<ol start="4"> <li>nach Aspiration von 5 % BSA/PBS blockierende Lösung hinzufügen 250 µL 1° Antikörper Verdünnung auf die entsprechenden Folien. Fügen Sie 250 µL 5 % BSA/PBS, sekundäre (2°) Antikörper nur negative Kontrolle gleitet.</li>
	<li>Inkubation bei 4 ° C für 24-48 h in einer feuchten Umgebung. 
	Hinweis: Eine Petrischale in Alufolie mit angefeuchtetes Filterpapier bedeckt als eine geeignete Inkubationszeit Kammer dienen können.</li>
</ol> 2. Tag 2:2 ° Immunostaining mit fluoreszierenden Antikörpern <ol><li>Aspirieren 1° Antikörperlösung oder 5 % BSA/PBS Kontrolllösung. Waschen alle Folien drei Mal 10 min mit 5 % BSA.</li>
	<li>Beim Waschen, vorbereiten 1: 200 Verdünnungen der gereinigten, Fluorophor konjugiert 2° Antikörper in 5 % BSA/PBS (siehe Tabelle 2, alle sind Ziege Anti-Maus). Bereiten Sie 250 µL Lösung pro Folie. Halten Sie 2° Fluorophor-konjugierten Antikörpern im Dunkeln auf Ice</li>
</ol> <img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg" /> Tabelle 2: Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper verwendet, um zu visualisieren primären Antikörper Anerkennung von MyHCs.
<ol start="3"> <li>nach Aspiration der dritten Anwendung von 5 % BSA/PBS blockierende Lösung, 250 µL 2° Antikörper Verdünnung auf alle Folien hinzufügen. 90 min bei Raumtemperatur in einem dunklen, feuchten Umgebung inkubieren.</li>
	<li>Aspirat 2° Antikörperlösung. Waschen alle Folien drei Mal 10 min mit 5 % BSA/PBS.</li>
	<li>Spülen mit PBS. Für 10 min. trocken</li>
	<li>Montieren das Deckglas mit eine befristete, niedrigviskose wässrige Eindeckmedium.</li>
	<li>Nach dem Trocknen die Folie Schnittflächen mit Nagellack versiegeln. Trocknen und bewahren Sie in einem dunklen Slidebox.</li>
</ol> 3. Folien mit Epifluoreszenz Microscopy Imaging <ol><li>reinigen Sie die Folien mit einem kleinen, 70 % Ethanol getränkten Lab-abwischen.</li>
	<li>Erhalten digitale Bilder von Immunostained Muskel Abschnitte mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem fotografischen Apparat (siehe die Tabelle der Materialien) ausgestattet.
	<ol><li>Wählen Sie einen Bereich von ungefähr 1 mm 2 (10 X Objektiv, 1,4 NA).</li>
		<li>Ansicht Alexa 488 konjugiert 2° Antikörper Fluoreszenz über eine 505 nm lang-Pass-Filter. Anzeigen der Fluoreszenz durch Anregung von Alexa 594 konjugiert 2° Antikörper über einen 595 nm lang-Pass-Filter erzeugt. Digitalisieren von Bildern mit einem PC-Computer mit einem kompatiblen imaging-Software ausgestattet. Gehören die Maßstabsleiste von imaging-Software für die spätere Analyse.</li>
	</ol></li></ol> 4. Analyse von Bildern mit Fidschi Hinweis: bevor Sie mit der Analyse, Fidschi (frei von den National Institutes of Health, Bethesda, MD erhältlich) über https://imagej.net/Fiji/Downloads installiert werden muss. Auch, wird das Makro in diesem Prozess verwendet in der Ergänzenden Datei bereitgestellt. Legen Sie die Makrodatei in einem leicht zugänglichen Verzeichnis.
<ol><li>Last ein Hellfeld Bild eines ausgewählten Bereichs in Fidschi. Navigieren Sie zu Plugins &#8594; Segmentierung &#8594; trainierbar Weka Segmentierung.</li>
	<li>Um die zelluläre Bereiche des Abschnitts, vorschreiben zeichnen Sie eine Linie auf einer Faser, und klicken Sie auf &#34; Klasse 1 hinzufügen &#34;. Dann zeichnen Sie eine Linie auf den Raum zwischen den Fasern, und klicken Sie auf &#34; Klasse 2 hinzufügen &#34; anlässlich der extrazellulären Domänen. Wiederholen Sie, bis in jeder Klasse gibt es 5-10 Etiketten.
	<ol><li>Klick Zug Sichter. Auf die daraus resultierenden roten und grünen Overlay mehr Beschriftungen manuell hinzufügen (siehe Punkt 4.2), nicht falsch segmentierte Stücke des Bildes, wenn nötig. Wiederholen Sie, bis die Fasern (rot) aus dem Raum zwischen den Fasern (grün) entsprechend getrennt werden.</li>
	</ol></li> <li>Klicken Sie &#34; erhalten Wahrscheinlichkeit &#34; und speichern Sie das Bild in einem neu beschrifteten Ordner.</li>
	<li>Wiederholen Sie das oben beschriebene Verfahren (Schritte 4.2 4.3) mit dem fluoreszierenden Bild vom gleichen Feld übernommen. Beschriften Immunostained Fasern als &#34; Klasse 1 &#34; und alle nicht-fluoreszierende Regionen als &#34; Klasse 2 &#34;. Speichern Sie die resultierende Wahrscheinlichkeit Karte im selben Ordner wo das verarbeitete Hellfeld-Bild gespeichert.</li>
	<li>Öffnen Sie eine der zuvor gespeicherten Wahrscheinlichkeit Karten in Fidschi. Zeichnen einer geraden Linie auf der Skala von der imaging-Software zur Verfügung gestellt. Gehe zu analysieren &#8594; Maßstab festlegen. Ändern Sie die Parameter (d.h., bekannten Abstand und Einheit der Länge) auf ihre entsprechenden Werte als von der Maßstabsleiste gegeben, dann überprüfen Sie die &#34; Global &#34; Feld, um den Maßstab für jedes Bild zu standardisieren.</li>
	<li>Navigieren zu Plugins &#8594; Makros &#8594; laufen &#8594; Tyagi Et Al. Faser Quantifizierung macro.ijm (siehe die Zusätzliche Datei). Sofort erscheint ein Navigationsbereich. Öffnen Sie das Bild &#39; s Host Ordner; ein Dialogfeld wird angezeigt. Für jedes Dialogfeld ändern Sie die &#34; Hintergrund &#34; Dropdown-Wert zu &#34; Licht. &#34; Hinweis: der Ordner wird nun mit Bildern der Faser Umrisse und Tabellenkalkulationsdateien Software der Ergebnisse (CSA und Feret Durchmesser sind am relevantesten, gefüllt Quantifizierung der Faser Morphologie; gemessenen Parameter gesetzt Messungen analysieren einstellbar). Faser Morphologie Daten generiert durch die Pore-Analysefunktion von Fidschi Tabellenkalkulation Software-Dateien für beide Leuchtstoff- und hellen Bereich Bilder automatisch übertragen werden.</li>
	<li>Berechnet den Anteil der Fasern mit dem Ausdruck einer bestimmten MyHC in einem Feld dividiert die Anzahl der Fluoreszierende Fasern im Feld durch die Anzahl der insgesamt Fasern in das entsprechende Hellfeld Bild.</li>
</ol>

<ol><li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li>
<li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li>
<li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="https://skeletalmusclejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13395-014-0027-1">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li>
<li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li>
<li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li>
<li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254(2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li>
<li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li>
<li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228866300_Skeletal_muscle_fiber_types_in_C57BL6J_mice">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen offenzulegen.

Hier haben wir nützliche Richtung für die Identifizierung des skelettartigen Muskels Fasertypen bereitgestellt. Dabei beschreiben wir einen neuartigen Algorithmus zur Analyse der Daten.
Da unsere Ergebnisse frühere Berichte5,8,10 bestätigen weitgehend und spiegeln unsere eigenen manuellen Messungen, erscheint der Algorithmus um genau zu sein. Allerdings stießen wir auf einige seltene experimentelle Fa...

Es hat seit einiger Zeit bekannt, die Skelettmuskulatur aus Einzelfasern von vielen Arten1besteht. Zunächst wurden zwei Gruppen von Fasern anhand ihrer kontraktilen Eigenschaften charakterisiert und benannt, entsprechend langsam zuckenden (Typ I) und Fast-Twitch (Typ II). Diese Kategorien wurden auf der Grundlage der Faser Stoffwechsel weiter unterschieden. Da Typ-I-Fasern sind reich an Mitochondrien und angewiesen auf oxidativen Stoffwechsel, wurden sie aufgeklärt durch robust positiven Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide-Tetrazolium-Reduktase (NADH-TR) Diaphorase2 oder Succinat Dehydrogenase (SDH)3 Färbung. Im Gegensatz dazu, Typ-II-Fasern weniger ausgestellt und Variablen Grad von NADH-TR Diaphorase oder SDH Färbung und wurden in zwei Fast-Twitch-Untergruppen unterteilt (Typ IIA und IIB Typ) etwas grob anhand ihrer relativen oxidativen Kapazitäten. Diese Unterscheidungen zwischen Fasern haben effektiver durch Myosin-ATPase Färbung visualisiert worden wo Typ I Fasern färben dunkel nach einer Vorinkubation bei pH 4.0 und Typ IIB Fasern absorbieren überstürzten folgende Vorinkubation bei pH 10,0 mit Typ IIA Fasern Färbung immer4.
Immunhistochemische Färbung des Myosin heavy Chain (MyHC) Isoformen hat vor kurzem eine feinere Diskriminator Fasertyp5entwickelt. Typ I, Typ IIA und Typ IIB Fasern können alle identifiziert werden mit Präzision, basierend auf ihrem MyHC Profil. Darüber hinaus eine weitere Fast-Twitch-metabolisch-Intermediate Fasertyp, Typ IIX, identifizierten6wurde. Hybrid-Fasern mit dem Ausdruck mehrere MyHC wurden auch bestätigten5,7,8. Einige Arten wie die Katze und der Pavian sind keine ausdrückliche Typ IIB MyHCs6bekannt. Obwohl MyHC Immunostaining derzeit die State-of-the-Art-Beurteilung der Muskel Zusammensetzung ist, ist die Analyse der Daten über diese Technik umständlich und zeitaufwändig ohne automatisierte Unterstützung. Zu diesem Zweck wurden eine Handvoll semi-automatischen Methoden, um diese Daten zu analysieren entwickelten5,9,10. Hier präsentieren wir Ihnen ein relativ Standardprotokoll für immunhistochemische Identifizierung der Muskelfaser-Typ5,7,8,10, zusammen mit einer teilautomatisierten Roman Algorithmus, der Analyse der Fasertyp und Faser Morphologie mit Genauigkeit beschleunigt.

<table><tbody><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td>5% in PBS</td></tr><tr><td>Hydrophobe Barriere Pap Pen</td><td>Scientific Gerät Labor</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-E</td><td></td></tr><tr><td>Immumount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>L'Oréal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE-200 Inverses Fluoreszenz- und Hellfeldmikroskop</td><td></td><td>Eingestellt SPOT</td><td></td></tr><tr><td>RT/KE</td><td>SPOT Imaging Solutions</td><td>RT940</td><td></td></tr><tr><td>Dell Optiplex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BA-F8 Primary Antikörper</td><td>Developmental Studies Hybridom Bank an der University of Iowa</td><td></td><td>monoklonale Maus IgG2b; 1:50</td></tr><tr><td>SC-71 Primäre</td><td>Antikörper-Entwicklungsstudien Hybridoma Bank an der University of Iowa</td><td></td><td>monklonale Maus IgG1; 1:50</td></tr><tr><td>BF-F3 Primäre</td><td>Antikörper-Entwicklungsstudien Hybridoma Bank an der University of Iowa</td><td></td><td>monoklonale Maus IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>6H1 Primäre</td><td>Antikörper-Entwicklungsstudien Hybridoma Bank an der University of Iowa</td><td></td><td>monoklonale Maus IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Anti-IgG2b</td><td>Invitrogen</td><td>A21145</td><td>Anti-Maus für Ziegen; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 gegen IgG1</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>Anti-Maus für Ziegen; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Anti-IgGM</td><td>Invitrogen</td><td>A21044</td><td>Ziege Anti-Maus; 1:200</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Isopentan</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td>kühl mit flüssigem Stickstoff</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP665-1</td><td>10x, verdünnen auf 1x</td></tr><tr><td>Kim-Tücher</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666A</td><td></td></tr></tbody></table>

semi-automatische analyse von maus skelettmuskulatur morphologie und fasertyp zusammensetzung

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Jahrelang wurden Unterschiede zwischen skelettartigen Muskel Fasertypen am besten durch Myosin-ATPase Färbung sichtbar gemacht. Immunhistochemische Färbung des Myosin heavy Chain (MyHC) Isoformen hat vor kurzem eine feinere Diskriminator Fasertyp entwickelt. Typ I, Typ IIA, Typ IIX und Typ IIB Fasern jetzt mit Präzision, basierend auf ihrem MyHC Profil identifiziert werden können; manuelle Auswertung dieser Daten kann jedoch langsam und unten-rechts langweilig. Schnelle, präzise Bewertung der Fasertyp Zusammensetzung und Morphologie ist in dieser Hinsicht ein sehr wünschenswert Werkzeug. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für State-of-the-Art immunhistochemische Färbung des MyHCs in Gefrierschnitte gewonnenen Maus Megalosauridae Muskel im Konzert mit einem neuartigen semi-automatischen Algorithmus, der Analyse der Fasertyp und Faser Morphologie beschleunigt. Wie erwartet, Musculus soleus angezeigt Färbung für Typ I und Typ IIA Fasern, aber nicht für Typ IIX oder Typ IIB Fasern. Auf der anderen Seite der Tibialis anterior-Muskel setzte sich überwiegend aus Typ IIX und Typ IIB Fasern, ein kleiner Bruchteil der Typ IIA Fasern und wenig oder gar keine Typ-I-Fasern. Mehrere Bildtransformationen wurden verwendet, um die Wahrscheinlichkeit Karten zum Zwecke der Messung der verschiedenen Aspekte der Faser Morphologie (d.h.Querschnittsfläche (CSA), maximale und minimale Feret Durchmesser) zu generieren. Die Werte für diese Parameter dann mit manuell erhaltenen Werten verglichen wurden. Keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Modi der Analyse im Hinblick auf CSA, maximal- bzw. Minimalwert Feret Durchmesser beobachtet wurden (alle p &#62; 0,05), die Genauigkeit unserer Methode angibt. So kann unser Immunostaining Analyse Protokoll zur Untersuchung der Auswirkungen auf die Muskelmasse Zusammensetzung in vielen Modellen des Alterns und Myopathie angewendet werden.

Megalosauridae Muskeln (d.h., m. Tibialis anterior und Soleus) von einer männlichen C57BL/6-Maus des unbekannten Alters seziert wurden Flash-durch das Versenken eines Kunststoff-Formenbau, enthalten die Muskeln im OAT Verbindung in flüssigem Stickstoff gekühlt Isopentane eingefroren. Dann, mit einem Cryotome, 8-10 µm Schnittserien wurden schneiden bei-20 ° C und anderen positiv geladenen Glas-Folien-12übertragen.
<p class="jove_content" fo:keep-togethe...

Immunhistochemische Färbung des Myosin schwere Kette Isoformen als State-of-the-Art-Diskriminator des skelettartigen Muskels Fasertyp entstanden (d.h., Typ I, Typ IIA, Typ IIX, Typ IIB). Hier präsentieren wir Ihnen eine Färbung Protokoll sowie eine neuartige semi-automatischen Algorithmus, der erleichtert die schnelle Beurteilung der Fasertyp und Faser Morphologie.

Semi-automatische Analyse von Maus Skelettmuskulatur Morphologie und Fasertyp Zusammensetzung

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, mit modernster Immunhistochemie Skelettmuskel-Fasertypen genau und schnell zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Muskelbiologie zu beantworten, beispielsweise, ob Fasertyp-Veränderungen durch den Verlust funktioneller Proteine ausgelöst werden. Obwohl diese Methode Einblicke in viele Modelle von Muskelerkrankungen ermöglicht, kann sie auch in Systemen wie Knock-in- und Knock-out-Modellen eingesetzt werden, um die umfassenderen Auswirkungen eines einzelnen Moleküls auf die grundlegende Muskelphysiologie aufzudecken.Als Erstes gefrorene Schnitte von Mausmuskelgewebe auf geladenen Objektträgern etwa eine halbe Stunde lufttrocknen lassen. Nach dem Trocknen mit einem hydrophoben Barrierestift (PAP-Stift) eine Umrandung um die Schnitte auf jedem Objektträger ziehen. Anschließend etwa 250 µL 5 % BSA in PBS innerhalb der eingezeichneten Begrenzung auftragen, um unspezifische Antikörperbindungen zu blockieren, und die Objektträger eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.Unterdessen bereiten Sie eine 1:50-Verdünnung des Primärantikörpers in 5 % BSA in PBS vor. Stellen Sie etwa 250 Mikroliter pro Objektträger her und bewahren Sie die Antikörperverdünnung auf Eis auf. Nach der Blockierzeit saugen Sie die Blockierungslösung von den Objektträgern ab und geben 250 Mikroliter-Aliquote der Antikörperverdünnung hinzu.Verwenden Sie als negativen Kontrollansatz 5 % BSA in PBS ohne primären Antikörper. Anschließend füllen Sie die Petrischale mit angefeuchtetem Filterpapier und bedecken sie mit Aluminiumfolie, um eine Inkubationskammer herzustellen. Danach inkubieren Sie die Objektträger bei vier Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden in der Kammer oder in einer vergleichbaren Umgebung mit gleicher Luftfeuchtigkeit.Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper die Lösung von den Objektträgern abpipettieren und die Objektträger dreimal waschen. Für jede Wäsche jeweils etwa 250 Mikroliter 5 % BSA in PBS etwa 10 Minuten lang zugeben. Während des Waschens die verdünnten sekundären Antikörper, die mit einem Fluorophor konjugiert sind, im Verdünnungsverhältnis 1:200 vorbereiten.Bereiten Sie mindestens 250 Mikroliter pro Objektträger vor und bewahren Sie die Lösung im Dunkeln und auf Eis auf. Nach der dritten Wäsche geben Sie 250 Mikroliter der Verdünnung des sekundären Antikörpers zu den Objektträgern hinzu. Anschließend inkubieren Sie die Objektträger 90 Minuten bei Raumtemperatur in einer dunklen, feuchten Umgebung.Nach der Inkubation die Antikörperlösung abpipettieren und die Objektträger dreimal wie zuvor waschen. Nach dem Abwaschen des überschüssigen sekundären Antikörpers die Objektträger mit PBS spülen und 10 Minuten lufttrocknen lassen. Abschließend die Objektträger mit einem nicht permanenten, wässrigen Montierungsmittel mit niedriger Viskosität eindecken.Nachdem das Medium getrocknet ist, verschließen Sie die Ränder der Deckgläser mit Nagellack und überführen Sie die Objektträger in eine lichtundurchlässige Aufbewahrungsbox. Reinigen Sie vor der Bildaufnahme das Deckglas mit 70 % Ethanol. Anschließend werden digitale Bilder mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen.Wählen Sie unter geringer Vergr&ouml;&szlig;erung einen interessierenden Bereich von einem Quadratmillimeter aus. Um mit Alexa 488 konjugierte Antik&ouml;rper zu betrachten, verwenden Sie einen 505 Nanometer langpass Filter. Um mit Alexa 594 konjugierte Antik&ouml;rper zu betrachten, verwenden Sie einen 595 Nanometer langpass Filter.Wenn die Filter korrekt eingestellt sind, beginnen Sie mit der Aufnahme digitaler Bilder. Achten Sie darauf, eine Maßstabsleiste für die anschließende Analyse einzufügen. Installieren Sie für die Analyse Fiji mit dem Makro, das dieser Veröffentlichung beiliegt.Speichern Sie die Makrodatei in einem leicht zugänglichen Verzeichnis. Laden Sie nun ein Hellfeldbild eines ausgewählten Abschnitts und navigieren Sie zur Option „Trainable WEKA Segmentation“. Um die zellulären Bereiche des Abschnitts festzulegen, zeichnen Sie eine Linie auf eine Faser und klicken Sie auf „Add to Class 1“.Danach zur Markierung der extrazellulären Bereiche eine Linie in den Zwischenraum zwischen den Fasern zeichnen und auf „Klasse zwei hinzufügen“ klicken. Diesen Vorgang wiederholen, bis fünf bis zehn Markierungen jeder Klasse definiert wurden. Die Markierung der interstitiellen Grenzen kann schwierig sein.Mithilfe der Zoomfunktion können diese Grenzen präziser markiert werden. Wählen Sie anschließend die Option „Trainingsklassifizierer“. Fügen Sie auf der resultierenden rot-grünen Überlagerung manuell weitere Beschriftungen an Bildbereiche hinzu, die durch den automatisierten Prozess falsch segmentiert wurden.Führen Sie dies durch, bis die rot markierten Fasern angemessen von den dazwischenliegenden, grün markierten Bereichen getrennt sind. Klicken Sie dann auf „Wahrscheinlichkeit erhalten“ und speichern Sie das Bild in einem neuen Dateiordner. Wiederholen Sie nun den gesamten Vorgang mit dem Fluoreszenzbild desselben Bereichs.Kennzeichnen Sie die immunogefärbten Fasern als Klasse eins und alle nichtfluoreszierenden Bereiche als Klasse zwei. Speichern Sie die resultierende Wahrscheinlichkeitskarte schließlich in demselben Ordner, in dem das verarbeitete Hellfeldbild gespeichert wurde. Öffnen Sie nun eine der zuvor gespeicherten Wahrscheinlichkeitskarten in Fiji.Ziehen Sie eine gerade Linie über die von der Bildgebungssoftware bereitgestellte Maßstabsleiste. Wählen Sie „Skala festlegen“ aus und geben Sie die korrekten Werte basierend auf der Maßstabsleiste ein. Aktivieren Sie anschließend die globale Option, um die Skala für jedes Bild zu standardisieren.Starten Sie nun das Tyagi-Makro zur Faserquantifizierung, und der Navigationsbereich wird angezeigt. Öffnen Sie anschließend den Host-Ordner mit den Bildern. Ändern Sie im zugehörigen Dialogfeld den Wert des Hintergrund-Auswahlfelds auf „hell“.Mit der Funktion „Satzmessungen“ kann festgelegt werden, welche Parameter gemessen werden sollen. Querschnittsfläche (CSA) und Faserdurchmesser sind die wichtigsten Maße zur Quantifizierung der Fasermorphologie. Nachdem das Makro ausgeführt wurde, wird der Ordner mit Abbildungen der Faserumrisse sowie mit Tabellenkalkulationen der durch die Funktionsanalyse ermittelten Messwerte gefüllt.Die Musculus-tibialis-anterior- und Musculus-soleus-Muskeln wurden mit den beschriebenen Methoden analysiert, da sie hauptsächlich aus schnellen oder langsamen Muskelfasern bestehen. Mithilfe spezifischer Antikörper wurden mehrere verschiedene schwere Myosinketten identifiziert. Ein erheblicher Anteil der Fasern im Musculus soleus exprimierte schwere Myosinketten vom Typ I und Typ IIA, und ein beträchtlicher Teil der verbleibenden Fasern war positiv für Typ IIX. Im Gegensatz dazu waren praktisch keine Fasern vom Typ IIB nachweisbar.Im Vergleich bestanden gefärbte Musculus-tibialis-anterior-Muskeln hauptsächlich aus Myosin-Schwerketten-Fasern vom Typ zwei B und Typ zwei X, wobei Fasern, die Typ-zwei-A-Ketten exprimieren, geringer vertreten waren, und praktisch keine Fasern exprimierten Typ-eins-Ketten. Eine morphometrische Analyse eines Musculus tibialis anterior, der mit SC-71-Antikörpern gegen die Myosin-Schwerkette vom Typ zwei A untersucht wurde, lieferte mehrere Bildtransformationen zur Erstellung von Wahrscheinlichkeitskarten. Aus dieser einfachen automatisierten Analyse ergaben sich Daten, die vollständig vergleichbar waren mit Daten, die mithilfe deutlich aufwändigerer manueller Berechnungen gewonnen wurden.Insgesamt liefert die Analyse Daten von etwa 6.000 einzelnen Muskelfasern. Der hohe Durchsatz an Daten machte die statistische Auswertung weitaus machbarer. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Muskelabschnitte immunfärbt und die bereitgestellte halbautomatische Software zur Vereinfachung der Analyse von Muskel-Fasertypen und -zusammensetzung verwendet.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass der Muskel regional heterogen sein kann und dass eine sorgfältige Beurteilung der Muskel-Fasertypen und -zusammensetzung die Analyse zahlreicher Muskelbereiche erfordert. In Kombination mit diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Trichrom-Färbung angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob eine Fibrose parallel zu Veränderungen in der Fasertypzusammensetzung auftritt.

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Forschung

JoVE Journal

Medicine

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Myo-mechanischen Analyse von isolierten Skelettmuskel

Zebrafische sind ein Schwellensystem zur Modellierung menschlichen Erkrankungen der Skelettmuskulatur. Wir beschreiben eine schnelle und effiziente Methode, um Skelettmuskel Muskelfasern aus embryonalen Zebrafisch-Larven und zu isolieren. Dieses Verfahren ergibt eine hohe Dichte myofiber Vorbereitung für Untersuchung von einzelnen Skelettmuskelfasermorphologie, Protein subzelluläre Lokalisierung und Muskelphysiologie.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für schnelle Muskelfaseranalysen, die eine verbesserte Färbequalität ermöglicht und dadurch die automatische Erfassung und Quantifizierung von Faserpopulationen die frei verfügbare Software ImageJ.

Ein schnelles automatisiertes Protokoll zur Muskelfaser Populationsanalyse in Rattenmuskelquerschnitte Mit Myosin Heavy Chain Immunhistochemie

Die Fähigkeit, neuromuskuläre Verbindungskomponenten genau zu erkennen, ist entscheidend für die Bewertung von Modifikationen in ihrer Architektur aufgrund pathologischer oder Entwicklungsprozesse. Hier präsentieren wir eine vollständige Beschreibung einer einfachen Methode, um qualitativ hochwertige Bilder von neuromuskulären Verbindungen ganzer Mounts zu erhalten, die für quantitative Messungen verwendet werden können.

Dissektion einzelner Skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische Analysen von neuromuskulären Verbindungen am ganzen Berg

Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass eine übermäßige Infiltration von Lipiden in der Skelettmuskulatur zu Lipotoxizität und Diabetes führt. Hier präsentieren wir ein vollständiges Protokoll, einschließlich Gewebeverarbeitung, Färbung mit Bodipy, Bildaufnahme und Analyse, um die Größe, Dichte und subzelluläre Verteilung von Lipidtröpfchen auf fasertypspezifische Weise zu quantifizieren.

Fasertyp- und subzellspezifische Analyse des Lipidtröpfchengehalts in der Skelettmuskulatur

Dieses Protokoll demonstriert die Einzelfaserisolierung aus gefriergetrocknetem menschlichem Skelettmuskel und die Klassifizierung von Fasertypen gemäß der Myosin-Schwerketten-Isoform (MHC) unter Verwendung der Dot-Blotting-Technik. Identifizierte MHC I- und II-Faserproben können dann mittels Western Blot weiter auf fasertypspezifische Unterschiede in der Proteinexpression analysiert werden.

Identifizierung des Fasertyps der menschlichen Skelettmuskulatur

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung enzymatisch dissoziierter Fasern unterschiedlicher Länge und Art aus sechs Muskeln erwachsener Mäuse: drei davon bereits beschrieben (Flexor digitorum brevis, Extensor digitorum longus, soleus) und drei von ihnen erstmals erfolgreich dissoziiert (Extensor hallucis longus, Peroneus longus, Peroneus digiti quarti).

Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis

Hier beschreiben wir eine umfassende Methode zur Messung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung in frischen permeabilisierten Skelettmuskelfasern aus menschlichen oder Mausmuskeln. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung der mitochondrialen Atmung und die Beurteilung der Brennstoffpräferenz und der metabolischen Flexibilität unter Beibehaltung bestehender mitochondrialer Netzwerke und der Membranintegrität.

Messung der mitochondrialen Atmung in Skelettmuskelfasern von Mensch und Maus mittels hochauflösender Respirometrie

Lokale Injektionen einer mitochondrialen Farbstoffbeschriftung terminaler Schwann-Zellmitochondrien in vivo zur konfokalen Mikroskopie. Diese Methode nutzt einen Proof of Concept, der im Skelettgewebe von Mäusen mit gesunden oder kranken Muskeln demonstriert wurde, um eine hochauflösende mitochondriale Visualisierung zu ermöglichen.

Methoden zur In-situ-Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie in Muskel- und terminalen Schwannzellen von Mäusen

Eine geradlinige Reihe von Methoden zur Isolierung und Bestimmung der Identität der am häufigsten vorkommenden Proteine ​​in der Skelettmuskulatur exprimiert. Etwa 800 Plätze sind auf einem zweidimensionalen Gel aus 10 mg Muskel zu erkennen, dies ermöglicht die Bestimmung des Geschlechts-spezifische Protein-Expression. Diese Methoden werden gleichwertige Ergebnisse in den meisten Geweben.

Skeletal Muscle Gender Dimorphismus von Proteomics

Erfahren Sie eine halbautomatisierte Methode zur Analyse von Skelettmuskelfasertypen und Morphologie bei Mäusen mittels Immunhistochemie. Dieses Verfahren ermöglicht Forschern eine schnelle und präzise Klassifizierung von Muskelfasern.

Semi-automatische Analyse von Maus Skelettmuskulatur Morphologie und Fasertyp Zusammensetzung

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