Bewertung der vaskulären Kontrollmechanismen Nutzung Videomikroskopie der isolierten Widerstand Arterien von Ratten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, isolierte Widerstandsarterien zu verwenden, um die Reaktivität der Gefäße auf vasoaktive Reize zu testen. Es wird auch gezeigt, wie Veränderungen der Kontrollmechanismen der glatten Muskulatur und der passiven mechanischen Eigenschaften bewertet werden können. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Gefäßbiologie bezüglich der Kontrollmechanismen der endothelialen und vaskulären glatten Muskulatur in kleinen Widerstandsarterien unter verschiedenen Bedingungen zu beantworten.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass kleine Widerstandsarterien aus der parenchymalen Zellumgebung isoliert und auf ihrem normalen Druck gehalten werden können, während die Reaktionen auf vasoaktive Reize getestet werden. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie und Diagnose der vaskulären Dysfunktion. Diese Art der Manipulation ist in vivo nicht möglich.

Obwohl diese Methode Einblicke in die periphere Gefäßerkrankung geben kann, kann sie auch auf die koronare Herzkrankheit angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Mikrokanülierung aufgrund der Empfindlichkeit des Eingriffs und der Notwendigkeit, eine Beschädigung der Arterie zu vermeiden, schwer zu erlernen sind. Am Tag des Versuchs werden zwei Liter einer physiologischen Salzlösung in einem Zweiliter-Erlenmeyerkolben hergestellt.

Achten Sie bei der Zugabe des 20X-Puffers darauf, dass sich die Lösung kontinuierlich mit dem Gasgemisch ausgleicht, und rühren Sie sie mit einem Magnetrührstab um. Beobachten Sie als Nächstes den pH-Wert, während Sie der Mischung 0,28 Gramm Mononatriumphosphat hinzufügen. Bei Bedarf den pH-Wert durch Zugabe von entweder sechs normalen Salzsäure oder 6,5 normalen Natronlauge aus einer Pasteur-Pipette erhöhen, so dass der pH-Wert bei 7,4 bleibt.

Geben Sie dann 1,98 Gramm Glukose in die physiologische Salzlösung. Bereiten Sie als Nächstes 500 Milliliter einer kalziumfreien physiologischen Salzlösung vor, indem Sie die 20X-Stammlösung in deionisiertem Wasser verdünnen. Geben Sie dann 25 Milliliter des 20X-Puffers in einen Erlenmeyerkolben und fügen Sie der Lösung 0,07 Gramm Mononatriumphosphat hinzu, während Sie den pH-Wert der Lösung überwachen und anpassen.

Verwenden Sie einen Tetrafluorethylenschlauch, um einen Gastank mit dem entsprechenden Gasgemisch an das Organbad anzuschließen. Die Lösung wird kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit sprudeln lassen, die ausreicht, um ein kontinuierliches, aber nicht turbulentes Blasen der Lösung zu gewährleisten, die in die Gefäßkammer fließt. Legen Sie außerdem einen kleinen Ausströmer, der mit dem Äquilibrierungsgasgemisch verbunden ist, in die Gefäßkammer, um die Gaszusammensetzung der physiologischen Salzlösung aufrechtzuerhalten.

Geben Sie die physiologische Salzlösung in eine Zwei-Liter-Mariotte-Flasche. Fügen Sie ein zentrales Glasröhrchen zu einem Stopfen hinzu, das als Reservoir dient, das kontinuierlich die physiologische Salzlösung in das pharmakologische Organbad abgibt, das die Lösung der Gefäßkammer zuführt. Platzieren Sie die Öffnung des zentralen Glasrohrs in der Mariotte-Flasche auf der gleichen Höhe wie die Oberseite der physiologischen Salzlösung im Organbad.

Dies gewährleistet einen konstanten hydrostatischen Druckkopf für die Abgabe der physiologischen Salzlösung in das Organbad. Verwenden Sie ein Polyethylenrohr, das mit einem J-förmigen Glasrohr verbunden ist, um die physiologische Salzlösung aus der Mariotte-Flasche in das Organbad zu leiten. Um die Lumenfülle zu erhalten, verwenden Sie einen Polyethylenschlauch, um die Zuflusspipette mit einem physiologischen Salzlösungsreservoir zu verbinden, das aus einer 66-CC-Kunststoffspritze besteht, die in eine Position angehoben ist, die den gewünschten Zuflussdruck aufrechterhält.

Überwachen Sie den Druck, indem Sie einen Druckmessumformer über einen Absperrhahn an das System anschließen. Verbinden Sie dann die Abflusspipette mit einem Polyethylenröhrchen mit einem Reservoir, das dem Zuflussreservoir ähnelt, damit die physiologische Salzlösung als Reaktion auf einen Druckgradienten durch das Gefäß fließen kann. Verwenden Sie außerdem einen ähnlichen Anschluss für Absperrhahn und Druckmessumformer, um den Abflussdruck zu überwachen.

Entnehmen Sie das Gehirn einer Sprague-Dawley-Ratte und legen Sie es in Rückenlage in eine Glas-Petrischale, die mit eiskalter physiologischer Salzlösung gefüllt ist. Stellen Sie dann die Schale unter ein Stereoskop. Verwenden Sie eine Vannas-Schere und eine Dumont-Pinzette mit feiner Spitze Nummer fünf, um die mittleren Hirnarterien aus dem Gehirn herauszuschneiden.

Reinigen Sie dann mit der Pinzette das restliche Hirngewebe aus der mittleren Hirnarterie. Übertragen Sie die Arterie in die Gefäßkammer, indem Sie sie vorsichtig am Ende des herausgeschnittenen Segments halten und vorsichtig in die Kammer einführen. Fädeln Sie dann die Hirnarterie auf die Zufluss-Mikropipette ein, indem Sie sie in Richtung Pipettenbasis ziehen, bis die Spitze in das Lumen der Arterie vorschiebt.

Sichern Sie die Arterie an der Zuflusspipette, indem Sie eine Schlaufe aus einer einzelsträngigen Faser binden, die zuvor aus 10-0-Nähten um die Arterie herum gezogen wurde. Befestigen Sie dann das gegenüberliegende Ende der mittleren Hirnarterie an der Abflusspipette, indem Sie eine zweite Nahtschlaufe um das Gefäß festziehen und das Mikrometer, das mit dem Zuflusspipettenhalter verbunden ist, verwenden, um die Arterie auf ihre In-situ-Länge zu dehnen. Binden Sie alle Seitenäste mit Einzelsträngen ab, die von 10-0-Nähten abgezogen werden, um einen konstanten Druck in der Arterie aufrechtzuerhalten.

Stellen Sie als Nächstes ein Videomikroskop auf, das aus einer Videokamera besteht, die an einem Präpariermikroskop befestigt ist, das mit einem Videomikrometer und einem Fernsehmonitor verbunden ist. Verwenden Sie dieses Setup, um den Innendurchmesser der Arterie zu messen. Beurteilen Sie den myogenen Tonus und die Gefäßreaktionen auf vasodilatatorische Reize, indem Sie vor dem Experiment sicherstellen, dass die Arterie ein geeignetes Maß an aktivem Tonus aufweist.

Entsorgen Sie alle Arterien, denen der aktive Tonus in Ruhe fehlt, mit Ausnahme von Gefäßen wie kleinen Mesenterialarterien, die normalerweise keinen aktiven Ruhetonus aufweisen. Geben Sie anschließend steigende Konzentrationen von Acetylcholin in die Gefäßkammer und messen Sie die Gefäßdurchmesser, um die endothelabhängige Reaktivität der kanülierten Widerstandsarterie zu testen. In diesem Beispiel weist die Arterie eine endotheliale Dysfunktion auf, die sich darin zeigt, dass sie sich als Reaktion auf Acetylcholin nicht erweitert.

Bestimmen Sie am Ende des Experiments den maximalen Durchmesser der Arterie, indem Sie dem Perfusat und Superfusat eine kalziumfreie physiologische Salzlösung hinzufügen. Verwenden Sie diese Messung, um den Prozentsatz des aktiven Ruhetonus zu berechnen. Der Nachweis einer maximalen Dilatation in kalziumfreier physiologischer Salzlösung bestätigt, dass das Versagen der Arterie, sich als Reaktion auf Acetylcholin zu erweitern, auf eine endotheliale Dysfunktion zurückzuführen ist und nicht auf eine Unfähigkeit der Arterie, sich aufgrund eines strukturellen Umbaus des Gefäßes zu entspannen.

Diese Abbildung veranschaulicht die Reaktionen auf den endothelabhängigen Vasodilatator Acetylcholin in isolierten mittleren Hirnarterien von männlichen Dahl-Salz-empfindlichen Ratten in den drei verengten kongenen Stämmen. Dies zeigt, dass eine endothelabhängige Dilatation zu Acetylcholin bei dem salzempfindlichen Elternstamm und bei beiden kongenen Stämmen, die das salzempfindliche Renan-Allel beibehielten, fehlte. Die normale Dilatation wurde in dem kongenen Stamm wiederhergestellt, der das braune Norwegen-Renan-Allel im salzempfindlichen genetischen Hintergrund trägt, was die Hypothese unterstützt, dass die endotheliale Dysfunktion bei SS-Ratten auf eine gestörte Regulation des Renan-Gens zurückzuführen ist.

In diesem Experiment wurden das Versagen der salzreichen Diät, die endothelabhängige Dilatation zu Acetylcholin bei einem bestimmten Rattenstamm zu eliminieren, die Befunde bezüglich der Beiträge zu vaskulärem oxidativem Stress und endothelialer Dysfunktion während einer Erhöhung der Salzaufnahme in der Nahrung untersucht. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis 3 1/2 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die isolierte Arterie sehr vorsichtig zu behandeln, um Schäden an der glatten Muskulatur und insbesondere am Endothel zu vermeiden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie die Zugabe von Vasokonstriktoren und Vasodilatatoragonisten oder Rezeptorantagonisten, durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, einschließlich der Mechanismen, die die vaskuläre Reaktivität auf verschiedene Substanzen beeinflussen, und der Mechanismen der Arzneimittelwirkung auf Blutgefäße. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern aus den Bereichen Gefäßbiologie und Mikrozirkulationsphysiologie den Weg, um die Funktion der glatten Muskulatur und des Endothels in Widerstandsarterien aus verschiedenen Gefäßbetten von Versuchstieren und Menschen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese Methode zur Bewertung der endothelialen und vaskulären Kontrollmechanismen der glatten Muskulatur in Arterien mit kleinem Widerstand aus verschiedenen Gefäßbetten verwenden können.