Name: Bewertung der gerinnungshemmenden und entzündungshemmenden Eigenschaften von Endothelzellen mit 3D Zellkultur und nicht-Antikoagulanzien Vollblut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Lernen Sie die Bewertung gerinnungshemmender Eigenschaften von Endothelzellen mit 3D-Zellkultur und nicht-antikoaguliertem Vollblut kennen. Diese Methode ermöglicht kardiovaskuläre Forschung.

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Diese Studie wurde unterstützt durch den Schweizerischen Nationalfonds (SNF, Grant No. 320030_156193). Die Autoren danken Dr. Benoît Werlen für die Bereitstellung der Biosilon Microcarrier Perlen. Wir danken auch Prof. Hans Peter Kohler und Prof. André Haeberli für Hilfe beim Einrichten der Microcarrier Wulst Modell.

deutsche Landrasse Schweine (Wildtyp gezüchtet in einem lokalen Bauernhof und transgenen gezüchtet am Institut für molekulare Tierzucht und Biotechnologie, Ludwig-Maximilians-Universität München), mit einem Gewicht von 30 kg bis 40 kg, dienten Diese Studie. Alle Tiere wurden unter Standardbedingungen mit Wasser und Nahrung ad libitum untergebracht. Alle Tierversuche wurden nach Großbritannien Animals Act (wissenschaftliche Verfahren) und der NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren sowie das Schweizer Tierschutzgesetz durchgeführt. Alle Tierversuche sind die ARRIVE-Richtlinien einzuhalten. Die Tierversuche des kantonalen Veterinärdienstes (Kanton Bern, Schweiz) gebilligten alle tierischer Verfahren, Erlaubnis nicht. BE70/14. Experimentelle Protokolle wurden nach der 3R verfeinert und State-of-the-Art-Anästhesie und Schmerztherapie wurden verwendet, um die Anzahl der Tiere zu minimieren und reduzieren die Exposition der Tiere, Stress und Schmerzen während der Experimente.
 Blut von gesunden Personen durch geschlossenes System Venenpunktion nach Schweizer Gerichtsbarkeit und Ethik-Richtlinien des Universitätsspitals Bern gezogen wurde. Der Begriff &#34; nicht Anticoagulated Blut &#34; bedeutet, dass das Blut nicht mit jedem Antikoagulans behandelt worden ist.
 die folgenden Schritte sind unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Vertrautheit mit Grundzelle Kultur steriler Technik erforderlich ist.
 1. Isolation von PAEC Hinweis: thorakalen Aorta Segmente von 6 bis 10 cm wurden von euthanasierten deutsche Landrasse-Schweine von 3 bis 6 Monate (für andere in Vivo Experimente verwendet) und sofort erhalten übertragen in einen 500-mL-Glasflasche mit Transportmedium (DMEM + 1 % Penicillin/Streptomycin).
<ol><li>Pre-Mantel eine 6-Well-Platte mit Fibronektin 12,5 µg/mL mit PBS-Puffer 1 X und legen Sie es in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 h</li>
	<li>Vorwärmen sterile PBS 1 X und Zelle Kultur Medium (DMEM).</li>
	<li>Nehmen Sie die Schweine Aorta vom Transportmedium.</li>
	<li>Die Aorta auf eine Styropor Platte zu platzieren.</li>
	<li>Mit warmen PBS vorsichtig vorher spülen.</li>
	<li>Die Aorta Längsrichtung geschnitten und mit Nadeln fixieren.</li>
	<li>Warme Zellkulturmedium auf der Oberfläche der inneren Behälter hinzufügen.</li>
	<li>Aspirieren Fibronektin Zellkulturmedium und fügen Sie frische Zellkulturmedium (DMEM mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 0,4 % der Endothelial Zelle Wachstum Medium Supplement Mix ergänzt).</li>
	<li>Tauchen Sie ein Wattestäbchen in das Zellkulturmedium. Wattestäbchen auf die ganz oben auf der innere Behälter Oberfläche sanft und langsam in die gleiche Richtung Tupfer.</li>
	<li>Der Zellen in einem Brunnen der 6-Well-Platte Runde für Runde reiben.</li>
	<li>Machen Sie dasselbe für den Rest der Brunnen.</li>
	<li>Zellen unter dem Mikroskop zu überprüfen und die 6-Well-Platte in Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO 2.</li>
	<li>Das Medium am zweiten Tag verändern und ändern Sie es noch einmal alle 2-3 Tage.</li>
	<li>Zellen werden sollen konfluierende, trypsinize Zellen und säen sie in einem T75 Kolben (PAEC P1).</li>
</ol> 2. PAEC Charakterisierung <ol><li>Pre-Mantel ein 8-Well-Chamberslide mit Fibronektin 12,5 µg/mL mit PBS-Puffer 1 X und legen Sie es in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 h</li>
	<li>5 x 10 4 Zellen/Well Saatgut und inkubieren Sie über Nacht im Brutschrank bei 37 ° c</li>
	<li>Waschen die Zellen zweimal mit PBS ++ (PBS mit CaCl 2 und MgCl 2 ergänzt), 300 μl/Well.</li>
	<li>Zellen mit 3,7 % Paraformaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur, 200 μl/Well befestigen.</li>
	<li>Waschen Zellen 3 Mal mit PBS ++, 300 μl/Well.</li>
	<li>300 μl PBS 1 X-3_% BSA (blockierende Puffer) hinzufügen und 30 min bei Raumtemperatur zu verlassen.</li>
	<li>Primäre Antikörper (Anti-VE-Cadherin, Anti-CD31, Anti-vWF) in PBS 1x-1%BSA-0.05% Waschmittel, 160 μl/Well verdünnt auftragen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>3 Mal zu waschen mit PBS ++ (200 μl/Well).</li>
	<li>Sekundärantikörper und DAPI in PBS 1x-1%BSA-0.05% Waschmittel, 160 μl/Well, verdünnt auftragen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>3 Mal zu waschen mit PBS ++ (200 μl/Well).</li>
	<li>Folien mit Glycerin basiert Eindeckmittel montieren und Endothelzellen Marker Ausdruck unter dem Fluoreszenzmikroskop zu überprüfen. 
	Hinweis: Kultur porcinen Aorten Endothelzellen in einem T175 Kolben (DMEM niedrige Glukose Medium + 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 0,4 % der Endothelial Zelle Wachstum Medium Supplement Mix) bis zum Zusammenfluss von 90 % erreicht ist. (Aussaat Dichte 1 x 10 6 Zellen, 90 % Zusammenfluss entsprechen etwa 5 x 10 6 Zellen).</li>
</ol> 3. Beschichtung von Microcarrier Perlen <ol><li>7 mL Microcarrier Perlen mit 42 mL Kollagen-Lösung in einem 50-mL-Tube (100 μg/mL, in eine 0,2 % ige Essigsäure Lösung verdünnt) vermischen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen zweimal mit 25 mL PBS pH 7.4 Perlen (25 mL PBS zugeben, mischen Sie gut mit dem Pipettieren und warten, bis die Perlen unten dann verwerfen die überstand und wiederholen Sie vereinbart sind) und einmal mit 25 mL DMEM Medium.</li>
	<li>Decken die Perlen in der 50-mL-Tube mit 10mL Medium 199 ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % L-Glutamin, 0,4 % der Endothelial Zelle Wachstum Medium Supplement Mix und 25 μL des Heparins (5000 IU/mL) und erlauben Gleichgewichtherstellung für 10 min. vor weiterem Gebrauch.</li>
</ol> 4. Sammeln von Zellen <ol><li>das Zellkulturmedium aus der T175 Küvette mit PAEC entfernen und Hinzufügen von 5 mL PBS pH 7.4.</li>
	<li>Entfernen PBS aus der Flasche T175.</li>
	<li>5 mL Trypsin-0.05% EDTA und inkubieren 3-4 min bei 37 ° c</li>
	<li>Der Zellen durch Spülen der Flasche mit 15 mL Zellkulturmedium sammeln und übertragen die Suspension in einem 50-mL-Tube.</li>
	<li>Zentrifugieren Zellen bei 1.200 x g für 8 min bei Raumtemperatur, entfernen überschüssige Mittel und das Pellet in 5 mL Zellkulturmedium Aufschwemmen.</li>
</ol> 5. Aussaat von Zellen in den Rührer Kolben <ol><li>die Zellsuspension 20 mL Zellkulturmedium hinzu und Aufschwemmen.</li>
	<li>Fügen Sie 20 mL Zellkulturmedium (w/o-Zellen) in der Magnetrührer 500-mL-Flasche.</li>
	<li>Die Zellen die gewaschenen Microcarrier Perlen aus Schritt 3.3 hinzufügen und mit einer serologischen 25-mL-Pipette vorsichtig vermengen.</li>
	<li>Übertragen die Perlen/Zelle-Mischung in den magnetischen Spinner Kolben.</li>
	<li>Spülen die 50-mL-Tube mit 10 mL Zellkulturmedium, die verbleibenden Zellen sammeln.</li>
	<li>Fügen Sie eine zusätzliche 85 mL Zellkulturmedium in den Spinner Kolben und legen Sie sie in den Brutkasten über Nacht bei 37 ° C auf einem Boston-Shaker (100 X g, mischen Intervall: 3 min alle 45 min).</li>
	<li>Fügen Sie 50 mL Zellkulturmedium (Gesamtvolumen 200 mL) und weiter rühren für weitere 24 h bei 37 ° C auf einem Boston-Shaker (100 X g, mischen Intervall: 3 min alle 45 min).</li>
	<li>Add farblos RPMI Medium (ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % L-Glutamin, 0,4 % der Endothelial Zelle Wachstum Medium Supplement Mix und 25 μl Heparin) bis 320 mL Gesamtvolumen erreicht ist.</li>
	<li>Ersetzen dem Medium alle 48 h: entfernen 100 mL des alten Mediums und 100 mL frische ergänzt farblos RPMI.</li>
	<li>Kultur der Zellen für 5 bis 7 Tagen. Die Zeit hängt vom Zusammenfluss Zustand der Zelle-beschichtete Perlen.</li>
</ol> 6. Überprüfung der Zusammenfluss <ol><li>200 μL der Zelle-beschichtete Perlen mit einer Pipette zu sammeln und übertragen Sie sie in ein Polypropylen Röhrchen.</li>
	<li>Waschen die Perlen 3 Mal mit 600 μl PBS 1 X (hinzufügen, PBS, kippen die Rohr- und Mischung sanft zur Loslösung der Zellen zu vermeiden, warten die Perlen um niederlassen, die PBS zu verwerfen und wiederholen).</li>
	<li>Die Perlen für 10 min durch Zugabe von 200 μl der Parapicric Säure zu beheben.</li>
	<li>Wash 3 Mal mit 600 μl PBS 1 x.</li>
	<li>Fügen Sie DAPI verdünnt mit PBS-Puffer 1 X und inkubieren Sie für 10 min.</li>
	<li>Die Perlen auf einen Objektträger übertragen und anwenden ein Deckglas mit Glycerin basiert Eindeckmittel.</li>
	<li>Visualisieren die Perlen unter einem confocal Mikroskop.</li>
</ol> 7. Experimentelle Verfahren <ol><li>die Zelle-beschichtete Perlen aus der Magnetrührer Flasche (Verfahren müssen nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden) mit einer serologischen 10-mL-Pipette entfernen und in 12 mL Rundboden Polypropylenröhrchen überführen.</li>
	<li>Lassen Sie die Perlen (ca. 1-2 min) niederzulassen und entfernen überschüssige Mittel.</li>
	<li>Die Rohre mehr Perlen hinzufügen, bis jedes Rohr genau 2 mL Perlen enthält.</li>
	<li>Jedes Röhrchen 5 mL klar RPMI hinzu und mischen Sie sorgfältig mit einer serologischen 10-mL-Pipette.</li>
	<li>Lassen Sie die Perlen niederzulassen und entfernen überschüssige Mittel.</li>
	<li>Waschen wiederholen noch einmal mit RPMI und entfernen alle überschüssige Mittel.</li>
</ol> 8. Inkubation mit Non-Anticoagulated Blut <ol><li>vorsichtig und langsam (mit Jet weder Vacutainer) Blut von gesunden Freiwilligen und sammeln es in 9 mL neutral Polypropylenröhrchen (ohne Antikoagulans).</li>
	<li>Transfer langsam 8 mL Blut mit einer serologischen 10-mL-Pipette in jede der Polypropylen Röhrchen mit 2 mL der Zelle-beschichtete Perlen (das Gesamtvolumen werden 10 mL). Vermeiden Sie grobe Behandlung von Blut oder Perlen, vorzeitige EG-Aktivierung zu vermeiden. Der Eingriff dauert ca. 1-2 min.</li>
	<li>Sorgfältig kippen die Blut/Perle Mischung sorgen gleich mischen und versiegeln die Kappe mit Paraffin Film.</li>
	<li>Legen die Rohre auf eine horizontale Kipptisch (mit sanften kippbaren Einstellungen nur) in einem Inkubator 37 ° C und Rekord Gerinnung Zeiten.
	<ol><li>In festgelegten Zeitabständen, z. B. nach 10, 20, 30, 50, 70, 90 min, entfernen mindestens 1,5 bis 2 mL Blut-Korn-Mischung für Serum oder Plasma Analyse. 
		Hinweis: für 6 Zeitpunkten empfehlen wir mit mehr als 3 Wiederholungen innerhalb einer Gruppe von Zellen, wie die Blutentnahme in verschiedenen Röhren erfolgt.</li>
		<li>Für die Sammlung von Serum, lassen das Blut zu gerinnen. Um das Plasma zu sammeln, EDTA oder Citrat 2 mL Röhrchen vor dem Hinzufügen hinzufügen von Blutproben.</li>
		<li>Speichern die Rohre auf dem Eis, 2.500 x g für 10 min bei 4 ° C Zentrifugieren und Serum/Plasma bei 80 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern. 
		Hinweis: Auf Materialien sind Angaben in der Tabelle der Materialien</li></ol></li></ol>

<ol><li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+endothelium+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).</li>
<li>Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+recalcified+citrated+whole+blood+-+a+pragmatic+approach+for+thromboelastography+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Anesthesia%22%5BJournal%5D)">The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children.</a> Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).</li>
<li>Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Suppression+of+the+Coagulation+of+Nonanticoagulated+Whole-Blood+in-Vitro+by+Human+Umbilical+Endothelial-Cells+Cultivated+on+Microcarriers+Is+Not+Dependent+on+Protein-C+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation.</a> Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).</li>
<li>Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+suppress+prothrombin+activation+in+nonanticoagulated+whole+blood+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro.</a> J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).</li>
<li>Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+protection+and+complement+inhibition+in+xenotransplantation%3A+a+novel+in+vitro+model+using+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood.</a> Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).</li>
<li>Cowan, P. J., d'Apice, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+activation+and+coagulation+in+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Complement activation and coagulation in xenotransplantation.</a> Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).</li>
<li>Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx%3A+composition%2C+functions%2C+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization.</a> Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).</li>
<li>Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-coagulation+crosstalk+on+cellular+and+artificial+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces.</a> Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).</li>
<li>Bongoni, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Expression+of+Human+CD46+on+Porcine+Endothelium%3A+Effect+on+Coagulation+and+Fibrinolytic+Cascades+During+Ex+Vivo+Human-to-Pig+Limb+Xenoperfusions%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions.</a> Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).</li>
<li>Miyazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+shear+stress+can+initiate+both+platelet+aggregation+and+shedding+of+procoagulant+containing+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles.</a> Blood. 88, 3456-3464 (1996).</li>
<li>Wuensch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Sequences+of+the+Porcine+THBD+Gene+Facilitate+Endothelial-Specific+Expression+of+Bioactive+Human+Thrombomodulin+in+Single-and+Multitransgenic+Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs.</a> Transplantation. 97, 138-147 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das hier vorgestellte Modell eignet sich für Koagulation Studien erlaubt die Analyse der verschiedenen Aspekte der Koagulation und seine Wechselwirkung mit EG. 8 in der Xenotransplantation Forschung ist es ein nützliches System die gerinnungshemmenden Eigenschaften der verschiedenen gentechnisch veränderte Schweine ECs nach Inkubation mit Menschenblut 9zu testen.
Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind die komplette Netzabdeckung (Konfluenz)...

Das vaskuläre Endothel besteht aus einer Monoschicht von Endothelzellen (EG), die das Lumen der Blutgefäße auskleiden. In einen physiologischen Zustand Ruhestrom EG sind verantwortlich für die Wartung von ein gerinnungshemmendes Mittel und entzündungshemmende Umgebung. 1 dies wird durch den Ausdruck der Antigerinnungsmittel und entzündungshemmende Proteine auf der Oberfläche der EG vermittelt. Z. B. EG Aktivierung verursacht durch Ischämie/Reperfusion Verletzungen oder vaskulären Ablehnung (Xeno-) transplantierten Organe bewirkt eine Änderung der endothelial Oberfläche aus einem Antigerinnungsmittel und Anti-inflammatory State pro- Koagulans und Pro-inflammatorische Zustand. 1
Um die faszinierende und komplexe Wechselwirkungen zwischen Endothel und Koagulation Faktoren, in-vitro- Modelle zu untersuchen, die als imitieren möglichst genau die in-Vivo -Situation sind höchst wünschenswert. Eine allgemeine Einschränkung, die konventionellen in-vitro- Koagulation Assays charakterisiert ist die Verwendung von Anticoagulated Blut, wodurch die Analyse der Koagulation-vermittelten Effekte beschwerliche und sogar Recalcification citrated Vollblut nicht reproduzieren Ergebnisse mit frischen nicht-Anticoagulated Blut erhältlich. 2 Außerdem ist im traditionellen Flachbett-Zellkultursysteme es unmöglich, die gerinnungshemmenden Eigenschaften des Endothels zu nutzen, da eine ausreichende Endothelzellen Oberfläche pro Blutvolumen nicht erreicht werden kann. Das hier vorgestellte Modell überwindet diese Einschränkungen durch Kultivierung EG auf der Oberfläche der kugelförmigen Microcarrier Perlen, so dass ein EG-Oberfläche-zu-Blut-Verhältnis von &#62; 16 cm2/mL kann erreicht werden, das ist vergleichbar mit der Situation in kleinen Arteriolen oder Venen, und die beschrieben wurde, ausreichen, um "natürliche" Gerinnungshemmung des Blutes ermöglichen durch die EG-Oberfläche. 3 , 4 Vollblut kann ohne zusätzlichen Antikoagulantien in dieser Einstellung verwendet werden. Blutproben können gesammelt werden, während das Experiment und Zytokine, Gerinnungsfaktoren und lösliche Ergänzung Aktivierungsmarker erkannt und quantifiziert werden können. Darüber hinaus können EC-beschichtete Microcarrier Perlen für Ergänzung und Immunglobulin Deposition sowie der Ausdruck von EG Aktivierungsmarker konfokalen Mikroskopie analysiert werden. Eine weitere interessante Anwendung umfasst die Prüfung von Medikamenten die um endothelialer Zellaktivierung und damit die Gerinnung zu verhindern sollen. 5 obwohl dieses Modell komplett Tierversuche ersetzen kann, bietet es eine Methode, um bestimmte funktionale Hypothesen ex Vivo mit Zellen zu testen und so reduzieren Sie die Anzahl der Versuchstiere in der Grundlagenforschung auf Ischämie/reperfusion Verletzungen oder (Xeno) Transplantation.
Das beschriebene Modell wurde verwendet, um eine Xenotransplantation in welche Aorten porcinen Endothelzellen (PAEC) sind auf die Microcarrier Perlen gezüchtet und inkubiert mit ganzen, nicht-Antikoagulanzien Menschenblut zu imitieren. Verschiedenen transgenen PAEC, mit mehreren menschlichen Genen wie CD46 für die Regulierung des Komplementsystems bzw. Thrombomodulin (hTBM) für die Regulierung des Systems der Koagulation, wurden wegen ihrer gerinnungshemmenden Eigenschaften analysiert. Endothelzellen Aktivierung, Ergänzung und Koagulation Systeme sind streng kontrolliert und miteinander verbunden. 6 es ist daher wichtig zu verstehen, wie die verschiedenen transgenen Zellen nach Exposition mit menschlichem Blut in Bezug auf Adhäsion Molekül Ausdruck und Cytokine Freigabe, Verhalten der Glycocalyx und Verlust von gerinnungshemmenden Proteine zu vergießen. 7

<table><tbody><tr><td>PAEC</td><td></td><td></td><td>Isoliert aus der Aorta von Schweinen in unserem Labor</td></tr><tr><td>Microcarrier-Kügelchen (Biosilon)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160-250</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, Bovine</td><td>Gibco</td><td>A10644-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma</td><td>M7528</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td></td></tr><tr><td>Neutrale Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>02.1726.001</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen aus Polypropylen</td><td>Simport</td><td>T406-2A</td><td></td></tr><tr><td>Rührkolben</td><td>Tecnomara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biologisches Rührwerk</td><td>Brouwer</td><td>MCS-104S</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti CD31</td><td>R& D Systems</td><td>MAB33871</td><td>Verdünnung 1:100</td></tr><tr><td>Ziege anti Ratte IgG-Cy3</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-166-003</td><td>Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>Ziege anti VE-cadherin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6458</td><td>Verdünnung 1:100</td></tr><tr><td>Kaninchen anti vWF</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>Verdünnung 1:100</td></tr><tr><td>Dk anti Gt IgG &ndash; Alexa 488</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A11055</td><td>Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>Ziege Anti Kaninchen - FITC</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-25MG-F</td><td>Verdünnung 1 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Konzentration: 10% im Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Adapter</td><td>Sarstedt</td><td>14.1205</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Bildanalysesoftware</td><td>Image J</td><td></td><td>Kostenlos erhältlich bei: https://imagej.net</td></tr><tr><td>Endothelzellwachstumsmedium SupplementMix</td><td>PromoCell</td><td>C-39216</td><td>2 mL in 500 mL DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Konzentration: 1% in Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>Konzentration: 1% in Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Heparinun natricum</td><td>Drossa Pharm AG</td><td></td><td>Aktienkonzentration: 5000 U.I./ mL</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Bioswisstec AG</td><td>30108</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 x 2H2O</td><td>Merck</td><td>2382.0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x6 H2O</td><td>Merck</td><td>1.5833.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Axon Lab AG</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Glycergel-Eindeckmittel</td><td>Dako</td><td>C0563</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der gerinnungshemmenden und entzündungshemmenden eigenschaften von endothelzellen mit 3d zellkultur und nicht-antikoagulanzien vollblut

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In Vivo, sind Endothelzellen ausschlaggebend für die natürliche Antikoagulation des zirkulierenden Blutes. Endothelialer Zellaktivierung führt zu Blutgerinnung. Dieses Phänomen ist in vielen klinischen Situationen, wie Organtransplantation im Beisein von vorgeformten Anti-Spender-Antikörper, einschließlich Xenotransplantation, sowie Ischämie/Reperfusion Verletzungen beobachtet. Um Tierversuche gemäß der 3R Normen (Minderung, Ersatz und Verfeinerung), in-vitro- Modelle um die Wirkung von Endothelzellen untersuchen reduzieren wäre Aktivierung auf Blutgerinnung sehr wünschenswert. Allerdings bieten gemeinsame Flachbett Systeme der Endothelzellen Kultur ein Oberflächen-Volumen-Verhältnis von 1-5 cm2 des Endothels pro mL Blut, die für natürliche, endothelial vermittelte Antikoagulation nicht ausreicht. Kultivierung von Endothelzellen auf Microcarrier Perlen kann das Oberflächen-Volumen-Verhältnis zu 40-160 cm2/mL erhöhen. Dieses erhöhte Verhältnis ist ausreichend, um die "natürliche" Antikoagulation von Vollblut, so dass die Verwendung von Antikoagulantien vermieden werden kann. Hier ist ein in-vitro- Microcarrier-basiertes System zur Untersuchung der Auswirkungen der gentechnischen Veränderung von porcinen Endothelzellen auf Koagulation des ganzen, nicht-Antikoagulanzien Menschenblut beschrieben. In der beschriebenen Assay, primäre porcinen Aorten Endothelzellen, entweder Wildtyp (WT) oder transgenen für menschliche CD46 und Thrombomodulin, wurden auf Microcarrier Perlen gezüchtet und dann frisch gezogenen nicht-Antikoagulanzien Menschenblut ausgesetzt. Dieses Modell ermöglicht die Messung und Quantifizierung der Cytokine Freigabe sowie Aktivierung Marker der Ergänzung und Koagulation im Blutplasma. Darüber hinaus wurden Bildgebung des aktivierten Endothelzellen und Ablagerung von Immunglobulinen, Ergänzung und Koagulation Proteine an den endothelialized Perlen konfokalen Mikroskopie durchgeführt. Dieser Test kann auch verwendet werden, um Medikamente zu testen, die um Aktivierung von Endothelzellen und somit, Gerinnung zu vermeiden sollen. Auf ihr Potenzial, die Zahl der Versuchstiere für solche Untersuchungen ist der beschriebenen Test einfach durchzuführen und konsequent reproduzierbar.

Nach 7-10 Tagen Kultur in die Spinner-Kolben (Abb. 1) wurden die Zellen konfluierende, decken die ganze Oberfläche der Microcarrier Perlen (Abbildung 2). Überprüfung des confluency Staates ist ein wichtiger Schritt, denn eine nicht-Zusammenfluss Monoschicht der EG auf die Microbeads führt zu einem deutlichen Rückgang der Gerinnungszeit, angesichts der Microcarrier Perlen Oberfläche ist stark Pro-Gerinnungsmittel (Gerinnungszeit: ...

Wir präsentieren ein in Vitro -Modell ermöglicht die Untersuchung und Analyse der Koagulation im ganzen, nicht-Anticoagulated Blut. Antikoagulation im System hängt die natürliche antikoagulierende Wirkung des gesunden Endothelzellen und endothelialer Zellaktivierung führt zu gerinnen.

Bewertung der gerinnungshemmenden und entzündungshemmenden Eigenschaften von Endothelzellen mit 3D Zellkultur und nicht-Antikoagulanzien Vollblut

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Das übergeordnete Ziel dieses Assays besteht darin, die antikoagulierenden Eigenschaften von Endothelzellen unter Verwendung von vollständigem, nicht antikoaguliertem Blut zu bewerten. Diese Methode kann verwendet werden, um Forschungsfragen zu beantworten, die mit der kardiovaskulären Forschung, dem Transport sowie der chirurgischen Forschung zusammenhängen. Im Wesentlichen eignet sie sich für alle Fragestellungen, die mit Antikoagulation und der Aktivierung von Endothelzellen verbunden sind.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Vollblut ohne Antikoagulanzien verwendet werden kann, da die Antikoagulation durch Endothelzellen gewährleistet ist. Um mit dem Protokoll zu beginnen, mischen Sie sieben Milliliter Mikroträgerkügelchen mit 42 Millilitern Gerinnungslösung in einem 50-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie die Kügelchen eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation waschen Sie die Kügelchen mit 25 Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS und spülen Sie die Kügelchen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Warten Sie, bis die Kügelchen sich am Boden des Röhrchens abgesetzt haben, bevor Sie den Überstand entfernen und den Vorgang wiederholen. Anschließend waschen Sie die Kügelchen einmal mit 25 Milliliter Dulbecco’s modifiziertem Eagle-Medium (DMEM). Danach bedecken Sie die Kügelchen mit 10 Milliliter Medium 199 und lassen sie 10 Minuten lang zur Gleichgewichtseinstellung vor der weiteren Verwendung. Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus dem T175-Fläschchen mit PAEC und geben Sie fünf Milliliter PBS hinzu. Anschließend entfernen Sie das PBS aus dem T175-Fläschchen und ersetzen es durch fünf Milliliter Trypsin mit 0,05 % EDTA. Inkubieren Sie die Zellen drei bis vier Minuten bei 37 Grad Celsius.Sammeln Sie die Zellen, indem Sie die Flasche mit 15 Milliliter Zellkulturmedium ausspülen, und überführen Sie die Suspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen, entfernen Sie nach der Zentrifugation das überschüssige Medium und resuspendieren Sie das Pellet in fünf Milliliter Zellkulturmedium. Geben Sie 20 Milliliter Zellkulturmedium zur Zellsuspension hinzu und resuspendieren Sie die Zellen erneut.Geben Sie 20 Milliliter Zellkulturmedium ohne Zellen in einen 500-Milliliter-Magnetruhrkolben. Fügen Sie die Zellen zu den gewaschenen Mikroträgerperlen hinzu und mischen Sie die Lösung vorsichtig mit einer 25-Milliliter-Serologischen Pipette. Überführen Sie das Perlen-Zell-Gemisch in den magnetischen Rührkolben.Spülen Sie das Reagenzglas mit 10 Milliliter Zellkulturmedium, um die verbleibenden Zellen zu gewinnen. Geben Sie zusätzliche 85 Milliliter Zellkulturmedium in die Spinner-Flasche. Stellen Sie die Flasche über Nacht bei 37 Grad Celsius auf einen Schüttler in den Inkubator.Geben Sie 50 Milliliter Zellkulturmedium hinzu, um ein Gesamtvolumen von 200 Milliliter zu erreichen. Rühren Sie weitere 24 Stunden auf einem Schüttler weiter. Fügen Sie farbloses Rockwell Park Memorial Institute- oder RPMI-Medium hinzu, bis ein Gesamtvolumen von 320 Milliliter erreicht ist.Entfernen Sie alle 48 Stunden 100 Milliliter des alten Mediums und geben Sie 100 Milliliter frisches, supplementiertes, farbloses RPMI hinzu. Kultivieren Sie die Zellen fünf bis sieben Tage lang, abhängig vom Konfluenzzustand der zellbesiedelten Perlen. Entnehmen Sie mithilfe einer 10-Milliliter-Serologiepipette die zellbesiedelten Perlen aus dem Magnetrahrkolben und überführen Sie sie in 12-Milliliter-Rundbodenzentrifugenrohre aus Polypropylen.Nach ein bis zwei Minuten, wenn sich die Kügelchen abgesetzt haben, entfernen Sie das überschüssige Medium. Geben Sie weitere Kügelchen zu den Röhrchen hinzu, bis jedes Röhrchen genau zwei Millimeter Kügelchen enthält. Fügen Sie danach fünf Milliliter klares RPMI zu jedem Röhrchen hinzu und mischen Sie die Lösung vorsichtig mit einer 10-Milliliter-Serologischen Pipette.Lassen Sie die Kügelchen absetzen und entfernen Sie das überschüssige Medium. Wiederholen Sie den Waschvorgang ein weiteres Mal mit RPMI und entfernen Sie das gesamte überschüssige Medium. Ziehen Sie vorsichtig und langsam Blut von einem gesunden Freiwilligen und sammeln Sie es in einem neun Milliliter fassenden neutralen Polypropylenröhrchen ohne Antikoagulans.Überführen Sie langsam acht Milliliter Blut in jede der Polypropylenröhrchen, die zwei Milliliter Zell-beschichtete Perlen enthalten, um ein Gesamtvolumen von 10 Millilitern zu erhalten. Achten Sie darauf, das Blut und die Perlen sorgfältig zu handhaben, um eine vorzeitige EC-Aktivierung zu vermeiden. Kippen Sie das Blut-Perlen-Gemisch vorsichtig, um eine gleichmäßige Durchmischung sicherzustellen, und verschließen Sie die Kappe mit Parafilm.Stellen Sie die Röhrchen auf einen horizontal schwingenden Tisch mit sanfter Einstellung in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator und notieren Sie die Gerinnungszeiten. Entnehmen Sie in festgelegten Zeitabständen mindestens 1,5 bis zwei Milliliter der Blut-Perlen-Mischung zur Serum- oder Plasma-Analyse. Zur Serumgewinnung lassen Sie das Blut gerinnen.Zentrifugieren Sie die Röhrchen abschließend 10 Minuten lang bei 2.500 × g und vier Grad Celsius. Lagern Sie das Serum oder Plasma bis zur Verwendung bei 80 Grad Celsius. Mikroträgerkugeln, die für CD31 und Kerne gefärbt sind, zeigen deutlich die Konfluenz.Die visuelle Beobachtung ergab, dass eine Verlängerung der Gerinnungszeit festgestellt werden konnte, wenn eine Monoschicht aus Endothelzellen auf der Oberfläche der Mikroträgerkügelchen vorhanden war. Eine signifikante Zunahme der Gerinnungszeit wurde beobachtet, wenn porcine aortale Endothelzellen, PAEC GalTKO/hCD46/hTBM, auf den Mikroträgerkügelchen präsent waren, was auf eine erfolgreiche Modulation sowohl des Komplementsystems als auch des Gerinnungssystems hindeutet. Sobald der Vorgang beherrscht ist, kann die Inkubation von mit Endothelzellen beschichteten Kügelchen mit nicht antikoaguliertem menschlichem Blut innerhalb von etwa sechs Stunden durchgeführt werden.Die eigentliche Dauer des Experiments hängt hauptsächlich von der Gerinnungszeit ab, die im Experiment beobachtet wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Mikroperlen vollständig mit endothelialen Zellen bedeckt sind, und eine vorzeitige Aktivierung des menschlichen Blutes zu verhindern.

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Forschung

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Bewertung der gerinnungshemmenden und entzündungshemmenden Eigenschaften von Endothelzellen mit 3D Zellkultur und nicht-Antikoagulanzien Vollblut

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