Generischen Protokoll zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion mit automatisierten Microbioreactor Technologie

Das übergeordnete Ziel dieses iterativen Workflows, der Kringing-basiertes Versuchsdesign und Mikrobioreaktortechnologie für einen ausreichenden Kultivierungsdurchsatz kombiniert, ist es, einen generischen Ansatz für ein maßgeschneidertes Design von mikrobiellen Kultivierungsmedien zu beschreiben. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der mikrobiellen Bioprozessentwicklung zu beantworten, wie z.B. die Optimierung von Kulturmedien, Bioprozessbedingungen sowie die Phänotypisierung von Stämmen. Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir uns die Frage stellten, ob Kultivierungsmedien, die für die Produktion kleiner Metaboliten optimiert sind, auch für die heterologe Proteinproduktion am besten geeignet sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Gesamtentwicklungszeiten durch die intelligente Kombination von Experiment und Modellierung beschleunigt. Dieses Verfahren wird Roman Jansen, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Studienkonzeption und der Definition der Methoden, wie im Textprotokoll beschrieben.

Sterilisieren Sie Deep-Well-Platten für die Lagerung von Stammlösungen auf einem Arbeitstisch, indem Sie die Platten mit 70 Prozent Ethanol abwischen und anschließend in einer Laminar-Flow-Haube trocknen. Beginnen Sie die Samenkultur, indem Sie 50 Milliliter BHI-Medium mit 25 Milligramm Kanamycin pro Liter mit einem Aliquot aus der Arbeitszellbank beimpfen. Legen Sie alle notwendigen Laborgeräte auf den Roboterarbeitstisch und gießen Sie die Stammlösungen in die entsprechenden Laborgeräte.

Starten Sie dann den robotergestützten Arbeitsablauf für die Medienvorbereitung, so dass der letzte Schritt, die Inokulation, rechtzeitig vor dem Start der Saatgutkultur erreicht wird. Nehmen Sie nach etwa zwei Stunden Proben aus der Samenkultur, um das Wachstum zu überwachen, indem Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern oder O-D-600 messen. Überwachen Sie weiterhin das Wachstum zu jeder Stunde.

Nach etwa fünf Stunden erreicht die Kultur einen O-D-600 zwischen drei und vier und wird zur Inokulation der Hauptkulturen verwendet. Legen Sie die Saatgutkultur auf den Arbeitstisch des Liquid Handlers und setzen Sie das Protokoll zur Medienvorbereitung fort. Verschließen Sie die Kultivierungsmikrotiterplatten nach der Inokulation.

Legen Sie anschließend die versiegelte Kultivierung M-T-P in das Biolector-Gerät. Starten Sie dann das vordefinierte Kultivierungsprotokoll. Entsorgen Sie die restlichen Stammlösungen ggf. gemäß den Biosicherheitsvorschriften.

Säen Sie dann die Kultur vom Roboterarbeitstisch aus. Reinigen Sie die wiederverwendbaren Laborgeräte, bevor Sie mit dem Dekontaminationsprotokoll des Liquid Handlers beginnen. Stoppen Sie die Hauptkultur nach einer Laufzeit von 17 Stunden und verarbeiten Sie die Daten wie im Textprotokoll beschrieben.

Um den G-F-P-Titer zu quantifizieren, werden zunächst die Zellsuspensionen aus allen Kultivierungsvertiefungen in vorbeschriftete Reaktionsröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie dann die Zellsuspensionen 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit mit einer Tischzentrifuge, um den zellfreien Überstand zu erhalten. Übertragen Sie anschließend 200 Mikroliter jedes freien Überstands der Zelle in ein schwarzes 96-Well-M-T-P mit transparentem Boden.

Lesen Sie die G-F-P-spezifische Fluoreszenz bei 488 Nanometern für die Anregung und 520 Nanometern für die Emissionswellenlänge mit einem geeigneten Mikroplatten-Reader ab. Nach der Messung der G-F-P-Fluoreszenz kann die Mikroplatte direkt zur Bestimmung des Proteingehalts der zellfreien Überstände mit Standardprotokollen wie einem Bradford- oder B-C-A-Assay verwendet werden. Fahren Sie abschließend mit der Datenanalyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben.

Das demonstrierte Verfahren stellt eine Versuchsrunde dar, die Ergebnisse werden für die Gestaltung weiterer Runden mit maximal erwarteter Verbesserung des G-F-P-Signals verwendet. In jeder Runde werden Referenzexperimente platziert, um die Datenvariabilität zu analysieren und experimentelle Ausreißer zu erkennen. Dieses Konturdiagramm gibt einen Überblick über das Optimierungsverfahren.

Die Analyse des gesammelten Datensatzes durch Iteration drei ergab eine Einschränkung der positiven Wirkung von Magnesium, wodurch ein optimaler Konzentrationsbereich identifiziert wurde. Es wurde daher beschlossen, den Konzentrationsbereich nur für Calcium in Iteration vier weiter zu erweitern. Die Prozedur wurde in der fünften und sechsten Iteration zweimal wiederholt, bis eine Sättigung des G-F-P-Signals festgestellt wurde.

Diese Sättigung wird durch die Ausfällung von Calciumsalz für die applizierten Calciumkonzentrationen erklärt, die der Zelle nicht zur Verfügung stehen. Die siebte Iteration wurde genutzt, um die Grenzen genauer auszuloten. Die optimalen Konzentrationsbereiche von Medienkomponenten für das gesättigte G-F-P-Signal können mit einem statistischen Z-Test zuverlässig identifiziert werden.

Es zeigt das identifizierte Plateau, wie es mit dem Werkzeugkasten des Kringing-Kits bestimmt und visualisiert wurde. Die Kringing-Kit-Toolbox ist kostenlos verfügbar und wird mit einem detaillierten Tutorial geliefert, das die Verwendung der Funktionen erklärt. Der generische Charakter des vorgestellten Protokolls ermöglicht verschiedene Anpassungen, wie z.B. die Untersuchung anderer mikrobieller Expressionswirte oder die Optimierung anderer Eigenschaften des Zielproteins, wie z.B. Glykosylierungsmuster oder Disulfidbindungen.

Die Integration eines Embrion-Systems erhöht den experimentellen Durchsatz, was eine große Zeitersparnis ermöglicht. Beim Ersatz von voll steuerbaren und eingefluften Bioreaktoren durch Amniar-Systeme muss die Skalierbarkeit der Ergebnisse berücksichtigt werden. Die mathematische Modellierung und Planung von Experimenten hilft, den Informationsgehalt der Messdaten in Bezug auf das untersuchte Ziel zu maximieren.