Name: Generischen Protokoll zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion mit automatisierten Microbioreactor Technologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Erfahren Sie, wie Kriging-basierte Versuchsplanung und Mikrobioreaktor-Technologie die heterologe Proteinproduktion optimieren. Diese iterative Methode beschleunigt die Entwicklung mikrobieller Kultivierungsmedien erheblich.

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Die wissenschaftlichen Aktivitäten der Bioökonomie Science Center wurden durch das Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung im Rahmen des NRW-Strategieprojekt BioSC (Nr. 313/323-400-002 13) finanziell unterstützt. Die Autoren danken dem Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen und der Heinrich Heine Universität in Düsseldorf für ein Stipendium für Lars Freier innerhalb der CLIB-Graduate Cluster industrielle Biotechnologie. Weitere Fördermittel erhielt von der Enabling Spaces Programm "Helmholtz-Innovation Labs" der deutschen Helmholtz-Gemeinschaft, die "mikrobielle Bioprocess Lab – A Helmholtz Innovation Lab" zu unterstützen.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die allgemeine Natur des vorliegenden Protokolls ermöglicht verschiedene Anpassungen, z.B.für die Untersuchung andere mikrobielle Ausdruck Gastgeber9,47,48,49,50, 51, oder andere Eigenschaften des Zielproteins, wie Glykosylierung Muster oder umgeformt Anleihen zu optimieren. Das Protokoll müssen auch an die verfügbaren Laborausrüstung angepasst werden. Die Integration eines MBR-Systems ermöglicht es, Erhöhung des experimentellen Durchsatzes, ermöglicht große Einsparungen in der Zeit. Allerdings muss beim Austausch der voll instrumentierter und kontrollierbaren Bioreaktoren von MBR Systems Skalierbarkeit der Ergebnisse8,37,52,53berücksichtigt werden. Die Verwendung von DOE Methoden und mathematische Modellierung hilft, um den Informationsgehalt von Messdaten in Bezug auf die untersuchten Objektive54 durch effiziente experimentelle Planung und Modell-basierten Daten Auslegung15zu maximieren.
Änderungen an der Methode Neben Mehrzweck- und erweiterbare Roboter Liquid handling Systeme wie die in dieser Studie verwendet sollte erwähnt werden, dass gibt es mehrere kleinere Liquid handling Systeme im Handel erhältlich, sind in der Lage, diese Aufgabe zu erfüllen und im Inneren platziert werden können der Laminar-Flow Werkbänke. Wenn kein automatisiertes Pipettierens System verfügbar ist, können unterschiedliche Medien Kompositionen nach dem DOE-Plan auch durch manuelle Pipettieren mit Einzel- und/oder Mehrkanal Pipetten realisiert werden. Da die manuelle Vorbereitung fehleranfälliger ist und hoch konzentriertes Arbeiten für eine lange Zeit benötigen, empfiehlt es sich, eine geringere Anzahl von verschiedenen Medien Kompositionen vorzubereiten.
Abhängig von den Fähigkeiten des eingesetzten MBR Systems wird das entsprechende Protokoll Anbau variieren. Zum Beispiel wenn keine Online-Messung der Biomasse Formation verfügbar ist, kann es ausreichen, um Biomasse Konzentration nach Beendigung des Experiments Wachstum zu messen sein. In Kombination mit der Online-Überwachung der pH-Wert und gelöstem Sauerstoff, die in mehreren MBR-Systemen implementiert wird, die Wachstum Sättigung sicher bestimmt werden kann. Im Prinzip können die Wachstumsversuchen im MTP allein in Inkubatoren, ohne den Einsatz eines MBR Systems schütteln platziert durchgeführt werden. In diesem Fall haben die richtigen Anbaubedingungen sichergestellt werden: (1) Sauerstoff-limitierte Bebauungen mit MTP mit geeigneten Geometrien in Kombination mit richtigen Frequenzen schütteln und schütteln, Durchmesser, z.B., Quadrat 96 oder 24 Tiefe vermieden werden Well-Platten bei 1.000 u/min bei 3 mm werfen oder bei 250 u/min bei 25 mm zu werfen, bzw. betrieben. Wichtig ist, sollte je niedriger die erreichbare maximale Sauerstoff-Übertragungsraten, desto geringer die wichtigsten Kohlenstoffquelle konzentriert werden. Wie bereits erwähnt, für diese Studie war die Verwendung von 10 g/L Glukose geeignet, Sauerstoff-Einschränkung für die Beschäftigten Anbaubedingungen zu verhindern; (2) Sampling der MTP Kulturen für Biomasse und Produkt Quantifizierung sollte auf ein Minimum reduziert werden. Jedes Mal, wenn die MTP aus dem Schütteln Inkubator entfernt wird Sauerstoffzufuhr wird sofort Abbau die ungünstigen Anbaubedingungen führen können; (3) in der Stellungnahme der Autoren ist die Verwendung von MTP Leser als Anbau-Geräte nicht empfohlen, da diese Geräte nicht für diesen Zweck entwickelt wurden. Z. B. Schütteln Mechanik wurden für gelegentliche Vermischung von Mikrotiterplatten nach der Zugabe des Reagenz gebaut und so oft fehlt Robustheit für hohe Auflagen von kontinuierlichen schütteln anhaltende tagelang. Darüber hinaus kann nicht ausreichend Leistungsaufnahme für mikrobielle Kulturen benötigt diese Leser realisiert werden. Die Integration von optischen Dichte Lesungen kurz Zeitintervalle erfordert Beendigung zitternder Bewegung, was zu wiederholten Perioden Sauerstoff Verjährungsfrist. Darüber hinaus wird die Verdunstung in solchen Systemen über lange Anbau Zeiträume Ergebnisse verzerren. Für mehr Details über die überraschend komplexe Thema MTP für mikrobielle Kulturen verwendet wird der Leser auf die zitierte Literatur22,23,24,25,26 bezeichnet. und verweist darin auf.
Weitere Überlegungen Zur iterativen Optimierungsschritte beschleunigen ist es ratsam, die analytische Methode zur Quantifizierung der Produkt sorgfältig auszuwählen. Schnelle und einfache Methoden ist auf Kosten der Präzision und Genauigkeit, vorzuziehen, da die iterative experimentelle Design-Strategie experimentelle Ungenauigkeit toleriert. Jedoch müssen die endgültigen Ergebnisse gegen hinreichend präzise und genaue Produkt Quantifizierungsmethoden überprüft werden, die möglicherweise etwas komplizierter. In der Regel die sorgfältige Auswertung und Entscheidungsfindung über die Abläufe erfordern Aufwand am Anfang der Studie, aber auf lange Sicht auszahlen, nachdem Routineverfahren etabliert haben.
Es wird dringend empfohlen, eine Referenz-Experiment, die ist im Vergleich zu allen Experimenten bei der Optimierung zu definieren. Das heißt, sind angewandte mittlere Komponente Konzentrationen und die gemessene Leistung durch Division durch Referenzwerte normalisiert. Auf diese Weise jede angewendet und Messwert kann als X-Fach des Referenzwerts interpretiert werden. Um Konto Variationen zwischen den Platten zu berücksichtigen, werden fünf Referenz Versuche auf jeder Platte durchgeführt. Der Mittelwert der gemessenen Ergebnisse dient der Normalisierung.
Es kann in der Regel nicht garantiert werden, dass die entwickelten Medium auch optimal für andere Stämme. Aber werden das bessere Medium höchstwahrscheinlich auch geeignet für den Anbau von Ausdruck Stämme mit kleinen genetischen Unterschiede, z.B.bei der Herstellung Enzymvarianten mit Aminosäure Substitutionen Mutagenese Studien (entnommen Obwohl sogar einzelne Punktmutationen Effekt Zellstoffwechsel und heterologen Expression Leistung55,56beschrieben wurden). In diesem Fall kann die vorgestellte Protokoll ein erster Schritt, gefolgt von Protokollen für Hochdurchsatz Ausdruck Vorführungen57. Wenn das Protokoll für mittlere Entwicklung mit nachfolgenden Scale-Up auf fed Batch Kultivierungen verwendet wird, sollte das optimale Medium für die entsprechenden Bioprozess-Bedingungen geprüft werden, das screening-Kampagnen auf die Microscale Klon identifiziert verschiedene top Darsteller für unterschiedliche Fütterung Strategien und Anbau Medien52,58. Darüber hinaus können die eingeführten KriKit36 in der Regel zu verbesserte ganzheitliche Bioprozess-Optimierung beitragen.Erst kürzlich wurden die Werkzeug-Fähigkeiten erweitert, um auch Multi-objektiven Optimierung40, unterstützen was wichtig für die Optimierung der beiden vor- und nachgelagerten Prozesse59,60sein kann.

Moderne rekombinante Gentechnologie ermöglicht die breite Verwendung von technischen Enzymen für verschiedene Anwendungen in der pharmazeutischen Industrie, Tierfütterung, organische Chemie und Lebensmittel-1,2,3. Die Produktion von technischen Enzymen in Großmengen ist ein wichtiges Thema für die industrielle Biotechnologie und für optimierte rekombinante Protein-Produktion, und beide belasten und Bioverfahrenstechnik ist erforderlich. Für die Erzeugung von effizient veränderter Produktionsstämme, verschiedene genetische Bibliotheken stehen zur Verfügung, z.B.für ausgewogene gen Expression4 oder vermehrte Ausschüttung Effizienz5.
Corynebacterium Glutamicum ist ein bedeutender Hersteller von Aminosäuren im industriellen Maßstab6,7 und stellt einen attraktive nichtkonventionellen Ausdruck Host für die sekretorischen Produktion rekombinanter Proteine8 ,9. Die allgemeine sekretorischen (Sec) und Twin-Arginin Translokation (Tat) Weg sind in C. Glutamicum und wurden erfolgreich für rekombinantes Protein Sekretion10angebracht. Umfangreiche Erfahrung in der Bioverfahrenstechnik über Aminosäure-Produktion im industriellen Maßstab sowie die Fähigkeit, Proteine zu g/L beträgt11 und große Robustheit bezüglich Bioprozess Inhomogenitäten in großem Maßstab gefunden absondern Bebauungen12,13, stellen C. Glutamicum einen vielversprechende Plattform Organismus für die sekretorischen Produktion von heterologen Proteinen im industriellen Maßstab.
Mittlere Optimierung Ernährung ist bekannt, rekombinanter Proteinproduktion mit mikrobieller Systeme14,15,16,17 und somit die Anpassung des Mediums zu verbessern Zusammensetzung ist ein lohnender Schritt in Bioprozess Entwicklung in Bezug auf optimale Produktivität18,19,20,21. Intensive Forschung auf der Anwendung von Mikrotiterplatten (MTP) für mikrobielle Kultivierung22,23,24 ebnete den Weg für die Entwicklung und Gestaltung von MTP für mikrobielle Kultivierung25 ,26 und die Entwicklung von MTP-basierte Microbioreactor (MBR) mit online-monitoring und ökologische Steuern27,28. MBRs ermöglichen eine deutliche Zunahme der experimentelle Anbau Durchsatz. Außerdem stehen MBR Systeme aufgrund von anderen Arten von Bioreaktoren, z.B., Blase Spalten oder Rührbehälters Reaktoren für mikrobielle Bioprozess Optimierung29,30,31, 32.
Optimierungsstudien profitieren in der Regel erhöhte experimentelle Durchsatz, der wird noch stärker in Kombination mit DOE-Methoden, beispielsweise zum bewerten Interaktionen zwischen Konstruktionsvariablen oder hochdimensionale Suche Räume reduzieren. Infolgedessen hat die kombinierte Verwendung von MBR-Systemen, Laborautomation und DOE erwies sich als eine leistungsfähige Methode in Biotechnologie8,16,33,34,35.
Ein Protokoll für Media-Optimierung ist Kombination von State-of-the-Art Laborautomation, MBR-Technologie mit Online-Prozessüberwachung und Kriging-basierte Daten-Analyse/experimentelles Design präsentiert. Die Kriging-Methode erfolgt in einer MATLAB Toolbox ("KriKit"), die heruntergeladen und verwendet werden können kostenlos kostenlos36. Maximierung der sekretorischen grüne ﬂuorescent Protein (GFP) Produktion mit C. Glutamicum zeigt als Anwendungsbeispiel Optimierung der Zusammensetzung des CgXII minimaler Medium. GFP-Titer war als Optimierung Ziel gewählt, da es leicht quantifiziert werden kann und es weithin als Modell Protein für Studien auf MBR Systeme37,38,39 gilt.
Die vorgestellte Rahmen gliedert sich in vier Schritte, die in Abbildung 1dargestellt sind. Die Schritte sind gekennzeichnet durch Box-Rahmen und Teile des Protokolls entsprechen. Der erste Schritt (Abbildung 1A) ist um die Projektziele zu definieren und die erforderlichen Methoden zu bestimmen. Die Kombination von DOE Methoden, MBR-Technologie und Laborautomation ermöglicht einen experimentelle Durchsatz, der leistungsstarke Datenverarbeitung erfordert. Der zweite Schritt (Abbildung 1 b) zielt darauf ab, sensibles Design Variablen (d.h.Mittelkomponenten) mit hohen Einfluss auf das Ziel der Optimierung zu erkennen. Dies führt zu einer Reduzierung der Konstruktionsvariablen von Interesse. Der dritte Schritt (Abbildung 1) umfasst eine iterative Optimierung für eine genauere Untersuchung der die funktionale Beziehung zwischen den verbleibenden Entwurfsvariablen und dem Ziel von Interesse. Verwendung des sukzessive erweiterten Datensatzes, ist der Kriging-Ansatz zum Vorhersage der experimentellen Ergebnisse an ungemessenen Standorten eingesetzt. Die iterative Zyklus stoppt, sobald das Kriging-Modell eine optimale oder Plateau mit ausreichender Genauigkeit vorhersagt. Die Ergebnisse werden im vierten Schritt (Abbildung 1), beginnend mit einer weiteren Sensitivitätsanalyse rund um den ermittelten optimalen überprüft. Wenn anfangs unempfindliche Komponenten gefunden werden, auch in den optimalen Bereich unempfindlich sein, ist es vernünftig anzunehmen, dass dies bei der iterativen Optimierung im dritten Schritt gilt. Danach ist es ratsam, Optimierungsergebnisse zu überprüfen durch Anwendung von orthogonalen Methoden, wie eine Aktivität-Assay oder SDS-Page.
Die allgemeine Natur des vorliegenden Protokolls ermöglicht einfache Anpassung an verschiedene Laborgeräte, andere Ausdruck Hosts und Zielproteine Wahl sowie weitere Bioprozess Variablen wie pH-Wert oder Anbau-Temperatur.Darüber hinaus können andere Optimierungsziele wie Protein Produktionsrate, spezifische Ertrag und Qualität des Produkts gewählt werden, in den Rahmen der anderen Optimierungsstudien zu passen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
Abbildung 1 : Workflow der Optimierungsstudie. Die vier Frame-Boxen entsprechen Teile des Protokolls "Konzeption der Studie und Definition of Methods" (Abschnitt 1), "Sensitivitätsanalyse" (Abschnitt 2), "Iterative Optimierung" (Abschnitt 3) und "Validierung" (Abschnitt 4). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>BioLector</td><td>m2p-labs</td><td>G-BL-100</td><td></td></tr><tr><td>Flowerplate</td><td>m2p-labs</td><td>MTP-48-BOH</td><td>Für die Kultivierung im BioLector Gerät</td></tr><tr><td>Siegelfolie</td><td>m2p-labs</td><td>F-GP-10</td><td>Sterile Versiegelung für Flowerplate</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>2016b</td><td></td></tr><tr><td>KriKit</td><td>Forschungszentrum J&uuml; lich</td><td>n/a</td><td>Frei verfügbar, MATLAB-Installation erforderlich</td></tr><tr><td>Janus-Pipettierroboter</td><td>Perkin Elmer</td><td>n/a</td><td>Inklusive "WinPrep"-Softwareinstallation</td></tr><tr><td>12-Säulen-Deep-Well-Mikroplatte</td><td>E& K Scientific</td><td>EK-2034</td><td>Behälter für Lösungen mittlerer Stammqualität</td></tr><tr><td>96 Well Mikrotiterplatten, transparent, F-Boden</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td>Für Bradford Protein Assay</td></tr> <tr><td>& Micro; klare 96-Well-Mikrotiterplatten, schwarzer Körper, transparenter Greiner 655087 mit F-Boden</td><td></td><td></td><td>Für die Fluoreszenzmessung in zellfreien Überständen</td></tr><tr><td>Pipettenforschung plus Mehrkanalpipetten</td><td>Eppendorf</td><td>n/a</td><td>Ermöglicht das manuelle Liquid Handling mit Mikrotiterplatten</td></tr><tr><td>TruPAG&nbsp; Precast</td><td>Gels Sigma</td><td>PCG2002</td><td>Für die SDS-Page-Analyse von zellfreien Überständen</td></tr><tr><td>Bradford Reagenz</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td><td>n/a</td><td>n/a Trägt</td><td>pEKEx2-Plasmid mit Fusion des GFP-Gens und des PhoD-Signalpeptids von B.subtilis als Expressionsinsert. Das Plasmid sorgt für Kanamycin-Resistenz. Beschrieben und veröffentlicht von Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&ndash; Nr. 42 (2007)</td></tr></tbody></table>

generischen protokoll zur optimierung der heterologen proteinproduktion mit automatisierten microbioreactor technologie

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Ein Kerngeschäft in der industriellen Biotechnologie mit mikrobiellen Produktion Zellfabriken ist der iterative Prozess des Stamm-Engineering und Optimierung der Bioprozess-Bedingungen. Ein wichtiger Aspekt ist die Verbesserung der Anbau Mittel um ein optimales Umfeld für mikrobielle Entstehung des Produkts von Interesse. Es wird gut angenommen, dass die Medienkomposition Bioprozess Gesamtleistung erheblich beeinflussen kann. Mittlere Optimierung Ernährung tritt bekanntermaßen rekombinanten Proteins zu verbessern Herstellung mikrobieller Systeme und damit, dies ist ein lohnende Schritt in Bioprozess-Entwicklung. Jedoch sehr oft Standardmedien Rezepte aus Literatur, genommen werden, da maßgeschneiderte Design des Mediums Anbau ist eine mühsame Aufgabe, die Microbioreactor-Technologie für ausreichend Anbau Durchsatz sowie schnelle Produkt-Analysen und Unterstützung verlangt von Labor-Robotik Zuverlässigkeit im Umgang mit Schritte Flüssigkeit zu ermöglichen. Darüber hinaus sind fortschrittliche mathematische Methoden für rational analysieren Messdaten und effiziente Versuchsplanung parallel wie optimale Informationsgehalt zu erreichen.
Die allgemeine Natur des vorliegenden Protokolls ermöglicht einfache Anpassung an verschiedene Laborgeräte, andere Ausdruck Hosts und Zielproteine von Interesse, sowie weitere Bioprozess Parameter. Darüber hinaus können andere Optimierungsziele wie Protein Produktionsrate, spezifische Ertrag und Qualität des Produkts gewählt werden, in den Rahmen der anderen Optimierungsstudien zu passen. Die angewandte Kriging-Toolbox (KriKit) ist ein allgemeines Werkzeug für Design of Experiments (DOE), die zu verbesserten ganzheitliche Bioprozess Optimierung beiträgt. Es unterstützt auch Multi-objektiven Optimierung, die bei der Optimierung von vor- und nachgelagerten Prozesse wichtig sein kann.

Das eingeführte Protokoll wurde für die Maximierung der Titer von sekretierten GFP angewendet. Insbesondere die GFP Titer nach 17 h der Anbau als Optimierung Ziel gewählt wurde. Online-Fluoreszenz-Detektion von GFP erlaubt einfaches Produkt Quantifizierung. Die Normalisierung der GFP Signal mit Daten aus einem Referenz-Anbau ist jedoch unerlässlich, um die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Eine Vorauswahl von Medienkomponenten wurde auf eine rationale Grundlage durchgeführt, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Experimente wurden durchgeführt nach den Anweisungen von Abschnitt 1: die Parameter der nassen Lab Verfahren wurden für die gesamte Studie Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse definiert.
Wie in Abschnitt 2 beschrieben, wurde ein erstes Screening zur Identifizierung von relevanter Komponenten zeigen einen signifikanten Einfluss auf das Ziel der Optimierung für die weitere, detailliertere Studie durchgeführt. Das MTP-basierte MBR-System ermöglicht 48 Experimente parallel ausgeführt werden. Unter Berücksichtigung die maximal mögliche Anzahl von parallelen Experimente an einer MTP (48) und die Gesamtzahl der Medien-Komponenten (11) macht die 2IVentwerfen11-6 gebrochene eine geeignete Wahl. Dieses experimentelle Design umfasst 32 Experimente und erlaubt die Schätzung der Haupteffekt für jede der untersuchten Medienkomponenten. Die restlichen Anbau-Brunnen (16) dienten mehrere Wiederholungen der Experimente mit dem Referenzmedium, um Reproduzierbarkeit und positionelle Auswirkungen zu beurteilen. Das heißt, jedes Experiment wird einmal durchgeführt (keine Wiederholungen), mit Ausnahme des Referenz-Experiments (fünf Wiederholungen).
Tabelle 1 fasst die Ergebnisse des Screening-Analyse. Im betrachteten Konzentrationsbereich zeigen variieren die Mehrheit der Medienkomponenten nicht spürbar auf das Ziel. Komponente NH4+ zeigt eine starke negative Wirkung, während Ca2 + und Mg2 + die stärkste positive Tendenz zeigen. Die Wirkung von Mg2 + kann ist nicht für die aktuelle Konzentrationsbereich jedoch für einen breiteren Konzentrationsbereich. Infolgedessen entschied man, NH4+ vom Medium weglassen und die Wirkung von Ca2 + und Mg2 + in weiteren Experimenten zu untersuchen.
Abschnitt 3 beschreibt die iterative Optimierung Prozedur, die für die Maximierung der GFP-Fluoreszenz-Signal während der unterschiedlichen Konzentrationen von Ca2 + und Mg2 +verwendet wird. In Iteration 1 wurde die Hypothese, dass NH4+ kann weggelassen werden getestet. Der Konzentrationsbereich für Ca2 + und Mg2 + wurde von der Screening-Analyse angenommen. Die Mindestkonzentration von NH4+ wurde auf Null gesetzt und die maximale Konzentration des Screening-Tests angenommen wurde. In den folgenden Experimenten wurden die Komponente-Konzentrationen auf ein 3 x 3 x 3 Raster innerhalb der definierten Konzentrationsbereich, wodurch 27 Experimente verteilt. In allen Kulturen waren fünf Wiederholungen von Referenzmedium enthalten, dienten als interner Standard und sicherzustellen, dass keine positionale Effekte über die MTP aufgetreten. Für die verbleibenden 16 Brunnen wurden die Konzentrationen von NH4+, Ca2 +und Mg2 + nach dem Zufallsprinzip in den angegebenen Bereichen verteilt.
Abbildung 5 A visualisiert die Ergebnisse der ersten Iterationen. Achsenbezeichnungen beziehen sich auf die Komponente-Konzentrationen in der ursprünglichen Referenzmedium verwendet wird durch x Ref. Die blauen Flächen repräsentieren die Kriging-Interpolationen, die mithilfe der KriKit-Software berechnet wurden. Jede Oberfläche ist verbunden mit einer relativen Konzentration für NH4+ (dunkelblau: 0 x Ref, kariert: 1 x Ref, hellblau: 2 x Ref). Diese visuelle Darstellung zeigt, dass es günstig für NH4+weglassen. Interpolation Oberflächen zeigen auch die positiven Effekte der Mg2 + und Ca2 +, da alle Flugzeuge steigen mit zunehmender Konzentration.
Basierend auf den Ergebnissen der Iteration 1, wurde beschlossen, erweitern die Konzentration Palette von Ca2 + und Mg2 + durch eine Verdoppelung der maximalen Konzentrationen und verlagert das experimentelle Design-Fenster in der oberen rechten Ecke, siehe Abbildung 5 B. innerhalb dieses Bereichs wurden die Konzentrationen auf ein 6 x 6-Raster verteilt. Dies sorgt für eine gleichmäßige Verteilung über die volle Konzentrationsbereich, führt zu optimalen Ergebnissen der Kriging-Interpolation. Abbildung 5 B zeigt die Kriging Interpolation Handlung der kombinierten Daten anhand gemessen in beiden Iterationen (rote Punkte und gelbe Quadrate). Für Ca2 + und Mg2 +, setzt die positive Wirkung ihrer Konzentration zu erhöhen. Infolgedessen das Verfahren wurde durch die Verdoppelung der maximalen Konzentration wiederholt und so zog das experimentelle Design-Fenster, die Grenzen von der oberen rechten Ecke zu erkunden.
Abbildung 6 A enthält eine Übersicht über den restlichen Optimierungsverfahren. Die Analyse der gesammelten Daten bis zu Iteration 3 ergab, dass eine Einschränkung der positiven Wirkung von Mg2 +, d.h., eine optimale Konzentration Palette von Mg2 + identifiziert wurde. Es wurde daher beschlossen, den Konzentrationsbereich nur für Ca2 + (Iteration 4) weiter ausbauen. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt (Iteration 5 und 6) bis eine Sättigung der GFP-Signal gefunden wurde. Diese Sättigung wird durch Ausfällung von Ca-Salze für die angewandte Konzentrationen von Ca2 +, erklärt, die nicht zu den Zellen zur Verfügung stehen.
Versuchsergebnisse immer durch Lärm gestört sind, die sich daraus ergebenden Kriging-Interpolation erscheint unregelmäßig und Sichtprüfung kann zu falschen Schlussfolgerungen führen. Jedoch kann die optimale Konzentrationsbereich von Media-Komponenten für die gesättigten GFP Signal zuverlässig mit dem statistischen Z -Test, identifiziert werden, die auch in KriKit umgesetzt wird. Der Z -Test verwendet direkt die intrinsische statistische Angaben der Kriging-Methode, d. h., Vorhersagewerte und Prognose Unsicherheiten. Abbildung 6 B zeigt die identifizierten Plateau als entschlossene und visualisiert die KriKit Toolbox verwenden.Die KriKit Toolbox ist frei verfügbar36 und verfügt über eine ausführliche Anleitung, die erklärt, wie Sie ihre Funktionen nutzen.
Wenn mehr als zwei relevante Komponenten gefunden werden, erreicht 3D-Visualisierung seine Grenze. KriKit bietet mehrere andere mögliche visuelle Darstellung Methoden wie Filme oder "screening-Plot". Wenn das optimale Potential innerhalb der definierten Konzentrationsbereich liegt, sollen neue Experimente automatisch mit der erwarteten Verbesserung40,46. Das experimentelle Design auf der Grundlage der erwarteten Verbesserung ist in der Toolbox KriKit integriert. Detailliertere Informationen finden Sie in der Softwaredokumentation.
Nach dem iterativen Verfahren wurde eine Überprüfung der Ergebnisse durchgeführt, wie beschrieben in Teil D., Die Gültigkeit der ursprünglichen Annahmen wurde durch Ausführen einer zusätzlichen Sensitivitätsanalyse optimale mittlere Zusammensetzung überprüft. Das heißt, alle ursprünglichen Medienkomponenten von Interesse waren vielfältig, aber Ca2 + und Mg2 + wurden eingerichtet, um ihre optimale Konzentrationen. In dieser Studie, die optimalen Konzentrationen <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 x Ref und <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6,8 X Ref wurden ausgewählt. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Validierung Überprüfung. Ähnlich wie die anfängliche Empfindlichkeit screening (vgl. Tabelle 1), NH4+ hat immer noch einen erheblichen negativen Einfluss und übrigen Effekte sind immer noch vernachlässigbar.
Durch einfachen Zugang wurde die GFP Fluoreszenzsignal aus der Anbau-Suspension zur extrazellulären GFP-Titer bei allen Experimenten zu quantifizieren. Aus Gründen der Überprüfung wurde GFP Fluoreszenz gegen andere Messungen validiert. Da GFP über die Tat-Signalweg abgesondert wird, kann nicht das Fluoreszenzsignal zwischen Intra- und extrazellulären GFP unterscheiden. So wurden Kultivierungen wiedergegeben mit der Referenz und der optimierten Medium. Neben der Fluoreszenzmessung von zellfreien Anbau Überstände, Proteingehalt wurde quantifiziert durch die Bradford-Test und (Semi)-qualitative Verbesserung der GFP visualisiert durch SDS-Page15. Alle daraus resultierenden Messung signalisiert wurden etwa verdoppelt für Bebauungen mit optimierten Medium im Vergleich zu Referenzmedium und validiert die ca. 100 % Verbesserung der Leistung der Sekretion von optimierten Medium. Infolgedessen kann GFP spezifische Fluoreszenz der Anbau Aussetzung eine geeignete Metrik für Optimierung Ziel, d. h., die extrazelluläre GFP-Titer betrachtet werden.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Screenshot aus der Lautstärke Pipettieren Liste für Sensitivitätsanalyse. Einträge in der ersten Spalte weisen einen eindeutigen Bezeichner für alle Volumes einer Zeile; Dieser Bezeichner ist das MTP auch Nummer der Ziel-Anbau MTP auf dem liquid Handler Arbeitstisch, vgl. Abbildung 4C. Verbleibende Spalten kodieren Bände für verschiedene Lösungen ("Sln-01" bis "Sln-15") um pipettiert werden. Das Gesamtvolumen einer Zeile entspricht dem endgültigen Anbau Volumen des jeweiligen gut. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Screenshot aus der Flüssigkeit Umgang mit Steuer-Software "WinPREP". Links: Reihe angeordnete Befehle, einschließlich einen Transfer-Befehl für jede Vorratslösung zu pipettiert werden. Vor dem letzten Befehl für Inokulum Zusatz wird eine Benutzereingabeaufforderung eingefügt, um sicherzustellen, dass die Impfkultur just-in-Time am Tisch platziert wird. Rechts: Schematische Darstellung des Arbeitstisches, einschließlich der Quelle Labware für Variation Aktien (zwei Tiefbrunnen Platten mit 12 Spalte wie Brunnen), Reagenz Trog für Rest-Lager, Wasser und Inokulum und den Medien Vorbereitung Ziel Anbau MTP. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
Abbildung 4 : Zusammenstellung von ausführlichen Screenshots zum Einrichten von einer Stammlösung pipettieren. (A) Befehl zum Pipettieren von Fe Lager ausgepackt. Quelle Labware und Quelle gut sind innen auf dem Arbeitstisch lesen Sie Rahmen und rote Säule der entsprechenden Tiefbrunnen Platte geprägt. Reiseziel Labware und Zielort Brunnen innerhalb sind geprägt von den blauen Rahmen um und blauen Brunnen des Ziel-Anbaus MTP. (B) detaillierte Beispielansicht im Auftrag des Pipettierens Bände für diesen Schritt (Fe-Stammlösung). Anzahl der Destinationen wird aus der Pipettier Liste gelesen hat 48 Zeilen. Die Dispensierung Bände für alle Ziel-Brunnen für Fe-Stammlösung in Spalte 4 der Pipettier Liste gefunden wird. Beachten Sie, dass die erste Spalte in der Pipettier Liste enthält Bezeichner und Volumina nicht übertragen werden, siehe Abbildung 2. (C) Informationen über Reiseziel gut Nummerierung. Bände in der Reihe #1 der entsprechenden Pipettieren Liste geschrieben werden in Brunnen als #1 und So weiter gekennzeichnet pipettiert werden. Wells #01, #08, #41 und #48 entsprechen Brunnen A01, A08, F01 und F08 für die Alpha-numerische Codierung, die auch in den Anbau MTP selbst aufgedruckt ist. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
Abbildung 5 : Detaillierte Ergebnisse aus der ersten Iteration. (A) Kriging Interpolation anhand experimenteller Daten Iteration 1. Rote Punkte zeigen den Datensatz. Zum Vergleich: alle drei Interpolation Oberflächen sind in einem Diagramm überlagert (dunkelblau: 0 x Ref, kariert: 1 x Ref, hellblau: 2 x Ref). Eine alternative Darstellung der Ergebnisse finden Sie ebenfalls15. (B) Kriging Interpolation anhand der Experimente in Iteration 1 (rote Punkte) und Iteration 2 (gelbe Quadrate) durchgeführt.Teile der Daten in dieser Abbildung wurden zuvor veröffentlichten15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
Abbildung 6 : Darstellung der iterativ gesammelten Optimierungsergebnisse. (A) endgültige Kriging Modell Vorhersage. (B) statistische Identifikation des optimalen Bereichs (rot) basierend auf den statistischen Z-test, die KriKit bietet. Kästchen zeigen an aufeinander folgenden Schritten des iterativen Design und Durchführung von Experimenten. Teile der Daten in dieser Abbildung wurden zuvor veröffentlichten15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Normalisierter Koeffizient Mittelwert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0,08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>-0,05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI2 +</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0,10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0,03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO-33-</td>
			<td>0,06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Ergebnisse der Sensitivitätsanalyse. Die Werte der Koeffizienten, die durchschnittliche Wirkung darstellt, bei der Erhöhung der jeweiligen Komponente Medienkonzentration aus seiner Mitte Wert auf den maximalen Wert. Für optimalen experimentellen Designs, wie in der Standardliteratur gefunden und verwendet hier die Standardabweichung stellt direkt die experimentelle Variation durch die Replikation des Referenz-Experiments. Koeffizient Werte wurden durch den maximal-Wert (0.0422 für die Komponente Ca2 +) normalisiert. Normalisierte und absolute Koeffizient Standardabweichung beträgt 0,54 bzw. 0.0226.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Normalisierter Koeffizient Mittelwert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI2 +</td>
			<td>0.69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO-33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Ergebnisse der letzten Sensitivitätsanalyse. Die Werte der Koeffizienten, die durchschnittliche Wirkung darstellt, bei der Erhöhung der jeweiligen Komponente Medienkonzentration aus seiner Mitte Wert auf den maximalen Wert. Da eine optimale Versuchsplanung verwendet wurde, hängt die Standardabweichung nur die experimentelle Variante mit der optimierten mittlerer Zusammensetzung. Experimentelle Variante leicht erhöht im Vergleich zu der Variante mit dem Referenzmedium. Koeffizient Werte wurden durch den maximal-Wert (0.0106 für Komponente Mn2 +) normalisiert. Normalisierte und absolute Koeffizient Standardabweichung ist 3,63 und 0.0385, beziehungsweise.

Dieses Manuskript beschreibt einen generischen Ansatz für maßgeschneiderte Gestaltung der mikrobiellen Anbau-Medien. Ermöglicht wird das durch einen iterativen Workflow kombinieren Kriging-basierte experimentelle Design und Microbioreactor Technologie für ausreichend Anbau Durchsatz, gestützt durch Labor-Robotik, Zuverlässigkeit und Schnelligkeit in Flüssigkeit Umgang mit Medien zu erhöhen Vorbereitung.

Generischen Protokoll zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion mit automatisierten Microbioreactor Technologie

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Das übergeordnete Ziel dieses iterativen Workflows, der Kringing-basiertes Versuchsdesign und Mikrobioreaktortechnologie für einen ausreichenden Kultivierungsdurchsatz kombiniert, ist es, einen generischen Ansatz für ein maßgeschneidertes Design von mikrobiellen Kultivierungsmedien zu beschreiben. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der mikrobiellen Bioprozessentwicklung zu beantworten, wie z.B. die Optimierung von Kulturmedien, Bioprozessbedingungen sowie die Phänotypisierung von Stämmen. Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir uns die Frage stellten, ob Kultivierungsmedien, die für die Produktion kleiner Metaboliten optimiert sind, auch für die heterologe Proteinproduktion am besten geeignet sind.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Gesamtentwicklungszeiten durch die intelligente Kombination von Experiment und Modellierung beschleunigt. Dieses Verfahren wird Roman Jansen, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Studienkonzeption und der Definition der Methoden, wie im Textprotokoll beschrieben.Sterilisieren Sie Deep-Well-Platten für die Lagerung von Stammlösungen auf einem Arbeitstisch, indem Sie die Platten mit 70 Prozent Ethanol abwischen und anschließend in einer Laminar-Flow-Haube trocknen. Beginnen Sie die Samenkultur, indem Sie 50 Milliliter BHI-Medium mit 25 Milligramm Kanamycin pro Liter mit einem Aliquot aus der Arbeitszellbank beimpfen. Legen Sie alle notwendigen Laborgeräte auf den Roboterarbeitstisch und gießen Sie die Stammlösungen in die entsprechenden Laborgeräte.Starten Sie dann den robotergestützten Arbeitsablauf für die Medienvorbereitung, so dass der letzte Schritt, die Inokulation, rechtzeitig vor dem Start der Saatgutkultur erreicht wird. Nehmen Sie nach etwa zwei Stunden Proben aus der Samenkultur, um das Wachstum zu überwachen, indem Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern oder O-D-600 messen. Überwachen Sie weiterhin das Wachstum zu jeder Stunde.Nach etwa fünf Stunden erreicht die Kultur einen O-D-600 zwischen drei und vier und wird zur Inokulation der Hauptkulturen verwendet. Legen Sie die Saatgutkultur auf den Arbeitstisch des Liquid Handlers und setzen Sie das Protokoll zur Medienvorbereitung fort. Verschließen Sie die Kultivierungsmikrotiterplatten nach der Inokulation.Legen Sie anschließend die versiegelte Kultivierung M-T-P in das Biolector-Gerät. Starten Sie dann das vordefinierte Kultivierungsprotokoll. Entsorgen Sie die restlichen Stammlösungen ggf. gemäß den Biosicherheitsvorschriften.Säen Sie dann die Kultur vom Roboterarbeitstisch aus. Reinigen Sie die wiederverwendbaren Laborgeräte, bevor Sie mit dem Dekontaminationsprotokoll des Liquid Handlers beginnen. Stoppen Sie die Hauptkultur nach einer Laufzeit von 17 Stunden und verarbeiten Sie die Daten wie im Textprotokoll beschrieben.Um den G-F-P-Titer zu quantifizieren, werden zunächst die Zellsuspensionen aus allen Kultivierungsvertiefungen in vorbeschriftete Reaktionsröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie dann die Zellsuspensionen 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit mit einer Tischzentrifuge, um den zellfreien Überstand zu erhalten. Übertragen Sie anschließend 200 Mikroliter jedes freien Überstands der Zelle in ein schwarzes 96-Well-M-T-P mit transparentem Boden.Lesen Sie die G-F-P-spezifische Fluoreszenz bei 488 Nanometern für die Anregung und 520 Nanometern für die Emissionswellenlänge mit einem geeigneten Mikroplatten-Reader ab. Nach der Messung der G-F-P-Fluoreszenz kann die Mikroplatte direkt zur Bestimmung des Proteingehalts der zellfreien Überstände mit Standardprotokollen wie einem Bradford- oder B-C-A-Assay verwendet werden. Fahren Sie abschließend mit der Datenanalyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben.Das demonstrierte Verfahren stellt eine Versuchsrunde dar, die Ergebnisse werden für die Gestaltung weiterer Runden mit maximal erwarteter Verbesserung des G-F-P-Signals verwendet. In jeder Runde werden Referenzexperimente platziert, um die Datenvariabilität zu analysieren und experimentelle Ausreißer zu erkennen. Dieses Konturdiagramm gibt einen Überblick über das Optimierungsverfahren.Die Analyse des gesammelten Datensatzes durch Iteration drei ergab eine Einschränkung der positiven Wirkung von Magnesium, wodurch ein optimaler Konzentrationsbereich identifiziert wurde. Es wurde daher beschlossen, den Konzentrationsbereich nur für Calcium in Iteration vier weiter zu erweitern. Die Prozedur wurde in der fünften und sechsten Iteration zweimal wiederholt, bis eine Sättigung des G-F-P-Signals festgestellt wurde.Diese Sättigung wird durch die Ausfällung von Calciumsalz für die applizierten Calciumkonzentrationen erklärt, die der Zelle nicht zur Verfügung stehen. Die siebte Iteration wurde genutzt, um die Grenzen genauer auszuloten. Die optimalen Konzentrationsbereiche von Medienkomponenten für das gesättigte G-F-P-Signal können mit einem statistischen Z-Test zuverlässig identifiziert werden.Es zeigt das identifizierte Plateau, wie es mit dem Werkzeugkasten des Kringing-Kits bestimmt und visualisiert wurde. Die Kringing-Kit-Toolbox ist kostenlos verfügbar und wird mit einem detaillierten Tutorial geliefert, das die Verwendung der Funktionen erklärt. Der generische Charakter des vorgestellten Protokolls ermöglicht verschiedene Anpassungen, wie z.B. die Untersuchung anderer mikrobieller Expressionswirte oder die Optimierung anderer Eigenschaften des Zielproteins, wie z.B. Glykosylierungsmuster oder Disulfidbindungen.Die Integration eines Embrion-Systems erhöht den experimentellen Durchsatz, was eine große Zeitersparnis ermöglicht. Beim Ersatz von voll steuerbaren und eingefluften Bioreaktoren durch Amniar-Systeme muss die Skalierbarkeit der Ergebnisse berücksichtigt werden. Die mathematische Modellierung und Planung von Experimenten hilft, den Informationsgehalt der Messdaten in Bezug auf das untersuchte Ziel zu maximieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben ein Verfahren zur affinitätsmarkiert Reinigung von rekombinanten Proteinen unter Verwendung Probenbehandlungstafel Robotik. Dieses Verfahren ist allgemein anwendbar auf die kleinteilige Reinigung von löslichen Proteinen mit His-Tag in einem Hochdurchsatz-Format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

Quelle: Hemmerich, J., et al. Protokoll zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion unter Verwendung automatisierter Mikrobioreaktortechnologie. J. Vis. Exp. (2017).Dieses Video demonstriert den Einsatz eines automatisierten Mikrobioreaktors zur Überwachung des Bakterienwachstums und der Sekretion fluoreszierender Proteine als Reaktion auf unterschiedliche Medienformulierungen. Ein gentechnisch verändertes Bakterium, das ein sekretorisches fluoreszierendes Protein exprimiert, wird unter...

Überwachung des bakteriellen Wachstums in unterschiedlichen Medienformulierungen mit einem automatisierten Mikrobioreaktor

Das Fünf-Tage-Protokoll beschreibt alle Schritte, Geräte und Zusatzsoftware notwendig für die Schaffung und den Betrieb einer effizienten endogenen Escherichia coli basierten TX-TL zellfreien Expressionssystem von Grund auf neu. Mit Reagenzien, nimmt das Protokoll 8 Stunden oder weniger, um das Setup eine Reaktion, sammeln und Prozessdaten.

Protokolle für die Implementierung einer Escherichia coli Basierend TX-TL Zellfreie Expression System für Synthetische Biologie

Wir haben eine kontinuierliche Kultivierungsvorrichtung zur Verwendung mit optogenetische Systeme Kulturen von Mikroben zu beleuchten und regelmäßig Bildzellen in dem Abwasser mit einem umgekehrten Mikroskop. Die Kultivierung, Probenahme, Bildgebung und Bildanalyse sind voll automatisiert, so dass dynamische Reaktionen auf Beleuchtung kann über mehrere Tage gemessen werden.

Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen

Ein detailliertes Protokoll für den gleichzeitigen Betrieb von 48 parallel Zellkulturen unter unterschiedlichen Bedingungen in einem Microbioreactor-System wird vorgestellt. Zellprozess Kultur, Ernte und anschließende Antikörper-Titer Analyse werden beschrieben.

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die Kosten und die notwendige Ausrüstung für E. Colizu generieren-basierte Zellextrakte und in-vitro- Protein Synthesereaktionen innerhalb von 4 Tagen oder weniger zu implementieren. Um die flexiblen Charakter dieser Plattform für breite Anwendungen nutzen zu können, diskutieren wir Reaktionsbedingungen, die angepasst und optimiert werden können.

Escherichia coli-basierte zellfreie Proteinsynthese: Protokolle für eine robuste, flexible und zugängliche Plattform-Technologie

Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Ausführung eines Experimentsentwurfs in einem automatisierten Mikrobioreaktor vor, gefolgt von der Zellernte und der Proteinquantifizierung mit einer Protein-A-Säule.

Prozessoptimierung mit automatisierten Mikro-Bioreaktoren mit hohem Durchsatz in der chinesischen Hamster-Ovarialzell-Kultivierung

Die optogenetische Kontrolle des mikrobiellen Stoffwechsels bietet eine flexible dynamische Kontrolle über Fermentationsprozesse. Das Protokoll zeigt hier, wie man blaulichtregulierte Fermentationen für die chemische und Proteinproduktion auf verschiedenen volumetrischen Skalen aufbaut.

Lichtgesteuerte Fermentationen für die mikrobielle Chemikalien- und Proteinproduktion

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur systematischen globalen Optimierung von genetisch kodierten Biosensoren durch automatisierungsgestützte Generierung und Bewertung genetischer Bibliotheken zur Verfügung. Dies wird mit Design-of-Experiment-Methoden gekoppelt, um Experimente zu rationalisieren und die Auswahl genetischer Komponenten zu ermöglichen, um Biosensoren auf bestimmte Designergebnisse abzustimmen.

Effiziente Probenahme von genetisch kodierten Biosensoren Design Space mit einem Design of Experiment- und Automatisierungs-Workflow

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Hochdurchsatz-Screening-Workflow für industrielle Mikroorganismen. Dabei wird eine mutierte Bibliothek mittels ARTP-Mutagenese erstellt, ein positives Tröpfchenscreening mit automatisierter Mikrofluidik durchgeführt und anschließend die Ergebnisse überprüft. Die Zuverlässigkeit des Workflows wurde durch das Screening von Hochleistungs-B . coagulans-Stämmen bestätigt.

Hochdurchsatz-Screening von L-Milchsäure-hyperproduzierenden Bacillus-Coagulans-Mutanten mittels einer automatisierten tropfen-mikrofluidischen Plattform

Erfahren Sie, wie Kriging-basierte Versuchsplanung und Mikrobioreaktor-Technologie die heterologe Proteinproduktion optimieren. Diese iterative Methode beschleunigt die Entwicklung mikrobieller Kultivierungsmedien erheblich.

Generischen Protokoll zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion mit automatisierten Microbioreactor Technologie

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