Name: Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Lernen Sie die Erzeugung und Bearbeitung von feeder-freien iPSCs aus menschlichen Bauchspeicheldrüsenzellen mit CRISPR-Cas9-Ribonukleoproteinen. Diese Methode ermöglicht zuverlässige kloniale Linien ohne Mosaizismus.

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Arbeit im Labor wurde unterstützt von Postdoc Fellowship-Stipendium an Dr. Anjali Nandal und explorative Grant aus Maryland Stem Cell Research Fund zu BT (TEDCO).

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<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
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<li>Macarthur, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+by+a+nonintegrating+RNA+Sendai+virus+vector+in+feeder-free+or+xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions.</a> Stem cells Int. , 564612(2012).</li>
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<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Jpn.+Acad.+Ser.+B%2C+PhysBiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
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<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 169, 559(2017).</li>
<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 168, 20-36 (2017).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).</li>
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<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FHDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> BioTechniques. 59, (2015).</li>
<li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA%2C+Cas9+nuclease%2C+and+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotech%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> J Biotech. 241, 136-146 (2017).</li>
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BT ist ein Gründungsmitglied der renovieren Biosciences Inc.

Umprogrammierung der menschlichen Körperzellen zu iPSCs hat einen wichtigen Impuls für die Felder der Grundlagenbiologie Forschung, personalisierte Medizin, Krankheit Modellierung, Arzneimittelentwicklung und regenerative Medizin16zur Verfügung gestellt. Viele aktuelle und am weitesten verbreitete Methoden der menschlichen iPSC Generation erfordern den Einsatz von Virus mit dem Risiko einer Integration in das Wirtsgenom oder episomal Vektoren mit geringer Effizienz Umprogrammierung. Hier präsentie...

Die Neuprogrammierung der menschlichen Körperzellen zu pluripotenten Zustand durch Überexpression der Neuprogrammierung Faktoren hat Stammzellenforschung mit Anwendungen in der Krankheit Modellierung, regenerative Medizin und Arzneimittelentwicklung revolutioniert. Mehrere nicht-viralen Neuprogrammierung Methoden sind lieferbar Umprogrammierung Faktoren und iPSCs zu generieren, aber der Prozess ist Arbeit intensiv und nicht sehr effizient1. Die virale Methoden sind zwar effizienter, mit Problemen der Virus Integration und Tumorigenität2,3,4. In diesem Manuskript berichten wir über die Verwendung von zytoplasmatischen Sendai-Virus für liefernde Umprogrammierung Faktoren und iPSC-Fußabdruck-freie Linien, die Integration von einer viralen Vektoren Sequenzen in ihre Genome5fehlt. Sendai-Virus ist ein RNA-Virus, wird aus der Zelle Zytoplasma ~ 10 Passagen nach Infektion verdünnt und produziert Neuprogrammierung Faktoren in Hülle und Fülle, führt zu schnellen und effizienten Umprogrammierung6,7. Die etablierten iPSCs können dann ohne weiteres Feeder-freies Medium zu vermeiden die Verwendung von Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) als Feeder Zellen8umgestellt werden.
In dieser Publikation neben umreißt das Sendai-Virus vermittelt Neuprogrammierung erläutern wir im folgenden eine verbesserte Protokoll zur Bearbeitung iPSCs, hat das Potenzial, unbegrenzte menschliche Zellen mit gewünschten genetischen Veränderungen für die Forschung zu liefern. Wir haben CRISPR/Cas9 Technologie zur Modifikation der iPSCs, verwendet, die nun für eine breite Palette von Anwendungen, einschließlich Knock-ins und Knockouts, groß angelegte genomische Deletionen, gepoolte Bibliothek screening für gen-Entdeckung, Gentechnik verwendet wird zahlreiche Modellorganismen, und Gen-Therapie9,10,11. Diese Technik beinhaltet die Bildung von komplexen von Streptococcus Pyogenes-abgeleitete Cas9 Nuklease und 20-Mer guide RNAs, die Zielerfassung über Basis-Paarung mit genomischen Zielsequenz angrenzend an 3' Nukleotid Protospacer angrenzenden erreichen Motiv (PAM) Sequenz. Die Cas9-Nuklease induziert eine gestrandete Doppelunterbrechung ~ 3 Nukleotide aus der PAM-Website, die vorwiegend durch nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) Weg Insertionen oder Deletionen in den offenen Leserahmen anschließend repariert und damit funktionsfähig ist Ko von Genen12.
Unsere verbesserte Protokoll enthält die Details für die Kultur der menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse, deren Neuprogrammierung auf mitotically inaktiviert Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) höheren Wirkungsgrad der Neuprogrammierung, nachträgliche Anpassung an Feeder-freie Kultur auf Matrigel, Charakterisierung von etablierten iPSCs geführte CRISPR RNA Design und Vorbereitung, Lieferung in iPSCs als RNP-komplexe, einzelne Zelle Sortierung klonale Linien des bearbeiteten iPSCs generieren, einfach screening und Identifizierung von Bearbeitungen und Charakterisierung der einzelne Zelle klont. Genomische Deletionen wurden in dieser Studie effizient erzeugt, durch die Einführung von Cas9 Protein und zwei CRISPR SgRNA RNP komplexe induzieren doppelte gestrandete Pausen (DSB) und segmentieren Sie löschen die einzugreifen. Diese Methode nutzt die Verwendung von zwei Guides zur Erzeugung von Löschungen in den offenen Leserahmen, hohe Leistungsfähigkeit des NHEJ führt zu geringen Anzahl von Klone dieser Notwendigkeit charakterisiert werden und einfache Vorauswahl der Klone durch automatisierte Kapillar Elektrophorese-Einheit, Fragment Analyzer. Diese effektive Genom Bearbeitungsmethoden um menschliche stammzellbasierte Krankheitsmodelle generieren werden bald ein standard und Routine Ansatz in jedem Stammzell-Labor. Zu guter Letzt präzise Genom-Bearbeitung machen es möglich, über Stammzellen Krankheit Modellierung und potenziell könnte helfen, zellbasierte Therapien zu katalysieren.

<table><tbody><tr><td>Sendai virale Vektoren - CytoTune-iPS 2.0 Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A16517</td><td>Auftauen auf Eis; S Nr.: 1</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Gibco Life Tech</td><td>25300-054</td><td>0,05%, 100 ml; S Nr.: 2</td></tr><tr><td>Gesteinsinhibitor (Y-27632)</td><td>Milipore</td><td>SCM075</td><td>Verwendung 10 &mu; M; S Nr.: 3</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td>S Nr.: 4</td></tr><tr><td>Serumersatz (KSR)</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>S Nr.: 5</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960069</td><td>1X; S Nr.: 6</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Aliquot; S Nr.: 7</td></tr><tr><td>L-Glutamin (Glutamax, 100X), flüssig</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050061</td><td>1/100; S Nr.: 8</td></tr><tr><td>nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>1/100; S Nr.: 9</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>55 mM, 1/1.000; S Nr.: 10</td></tr><tr><td>Hausser Hämazytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>S Nr.: 11</td></tr><tr><td>0,1% Gelatinelösung</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7903</td><td>Inkubieren bei 37&ordm; C für 1 Stunde; S Nr.: 12</td></tr><tr><td>SSEA-4 Antikörper</td><td>Santacruz</td><td>sc-21704</td><td>1/100; S Nr.: 13</td></tr><tr><td>TRA-1-81</td><td>Antikörper-Zell-Signalisierung</td><td>4745S</td><td>1/200; S Nr.: 14</td></tr><tr><td>OCT4 Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1/1.000; S Nr.: 15</td></tr><tr><td>Kollagen I, Rat Tail</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td>Kalt halten; S Nr.: 16</td></tr><tr><td>Alexa Fluor fluoreszierend 488/ 568 (Sekundärantikörper)</td><td>Invitrogen</td><td>A21202/A10042</td><td>1/2.000; S Nr.: 17</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028LS</td><td>1X; S Nr.: 18</td></tr><tr><td>100-mm-Gewebekulturschale</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>S Nr.: 20</td></tr><tr><td>96-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td>S Nr.: 21</td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>S Nr.: 22</td></tr><tr><td>Präparierzielfernrohr&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>S Nr.: 23</td></tr><tr><td>Zupfhaube</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td>S Nr.: 24</td></tr><tr><td>15&nbsp; ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>S Nr.: 25</td></tr><tr><td>50&nbsp; ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>S Nr.: 26</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td>S Nr.: 28</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>S Nr.: 29</td></tr><tr><td>Prigrow III medium</td><td>ABM</td><td>TM003</td><td>S Nr.: 31</td></tr><tr><td>Countess&trade; Zellzähler</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>S Nr.: 32</td></tr><tr><td>Faxitron Röntgensystem</td><td>Faxitron</td><td>CellRad</td><td>S Nr.: 33</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>S Nr.: 34</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>1mg/ml Lagerbestand; S Nr.: 35</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td>S Nr.: 36</td></tr><tr><td>hESC qualifiziertes Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Zum Verdünnen kaltes DMEM/F-12 verwenden; S Nr.: 37</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R & D</td><td>233-FB</td><td>Schaft 10 μg/ml; S Nr.: 38</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% Lagerbestand an PBS; S Nr.: 39</td></tr><tr><td>TRA-1-60</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21705</td><td>1/100; S-Nr.: 40</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0004P-F</td><td>1/100; S Nr.: 41</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td>S Nr.: 42</td></tr><tr><td>Alkalisches Phosphatase-Kit</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td>S Nr.: 43</td></tr><tr><td>Cas9-Protein</td><td>PNA Bio</td><td>CP01-50</td><td>Auftauen und Aliquot; S Nr.: 44</td></tr><tr><td>Ziegen- oder Eselserum</td><td>Sigma</td><td>D9663/G9023</td><td>S Nr.: 45</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td>S Nr.: 46</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td>S Nr.: 47</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>9285-100ML</td><td>S Nr.: 48</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td>S Nr.: 49</td></tr><tr><td></td><td>EDTA Sigma</td><td>BP2482-500</td><td>S Nr: 50</td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td>S Nr.: 51</td></tr><tr><td>Mega Shortscript T7 Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1354</td><td>S Nr.: 52</td></tr><tr><td>Mega Clear Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1908</td><td>S Nr.: 53</td></tr><tr><td>SMC4</td><td>BD Biosciences</td><td>354357</td><td>S Nr.: 54</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7159</td><td>S Nr.: 55</td></tr><tr><td>CloneJET Klonierungskit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1232</td><td>S Nr.: 56</td></tr><tr><td>FragmentanalysatorTM</td><td>Advanced Analytical</td><td></td><td>S Nr.: 57</td></tr><tr><td>mTeSR1 Medium Kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td>Warm bis Raumtemperatur; S Nr.: 58</td></tr><tr><td>Gefriermedium mFreSR&trade;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5855</td><td>S Nr.: 59</td></tr><tr><td>Gefriermedium CryoStor&reg;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7930</td><td>S Nr.: 60</td></tr><tr><td>MEFs</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6301G</td><td>S Nr.: 61</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>S Nr.: 62</td></tr><tr><td>Menschliche Pankreaszellen</td><td>ABM</td><td>T0159</td><td>S Nr.: 63</td></tr><tr><td>STEMdiff&trade; Neuronales Induktionsmedium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5835</td><td>S Nr.: 64</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermofisher</td><td>11875-093</td><td>S Nr.: 65</td></tr><tr><td>2% B27-Insulin</td><td>Thermofisher</td><td>A1895601</td><td>S Nr.: 66</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72052</td><td>S Nr.: 67</td></tr><tr><td>IWP4</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72552</td><td>S Nr.: 68</td></tr><tr><td>2% B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>S Nr.: 69</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372019</td><td>Nr.: 70</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761-100ML</td><td>S Nr.: 71</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td>S Nr.: 72</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Proliant</td><td>68700</td><td>S Nr.: 73</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>Pepro-Tech</td><td>120-00</td><td>S Nr.: 74</td></tr><tr><td>TUJ1 Antikörper</td><td>EMD Milipore</td><td>AB9354</td><td>S Nr.: 75</td></tr><tr><td>NKX2-5 Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-14033</td><td>S Nr.: 76</td></tr><tr><td>SOX17 Antikörper</td><td>R & D systems</td><td>AF1924</td><td>S Nr.: 77</td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Thermo Scientific</td><td>P3566</td><td>S Nr.: 78</td></tr><tr><td>Amaxa 4D-Nukleofektor&trade;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002</td><td>S Nr.: 79</td></tr><tr><td>FACSAria II (Zellsortierer)</td><td>BD biosciences</td><td>SORP UV</td><td>S Nr.: 80</td></tr></tbody></table>

effiziente erzeugung und bearbeitung von feeder-freie ipscs aus menschlichen zellen der bauchspeicheldrüse mit dem crispr-cas9-system

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Embryonalen und induzierte pluripotente Stammzellen können selbst zu erneuern und in mehreren Zelltypen des Körpers differenzieren. Die pluripotenten Zellen sind somit für die Forschung in der regenerativen Medizin begehrt und werden derzeit in klinischen Studien für Augenerkrankungen, Diabetes, Herzkrankheiten und anderen Erkrankungen. Das Potential, sich in spezialisierte Zelltypen, gekoppelt mit der jüngsten Fortschritte im Genom Bearbeitung Technologien einschließlich der CRISPR/Cas-System differenzieren haben zusätzliche Möglichkeiten für die Anpassung des Genoms des iPSC für die verschiedensten Anwendungen zur Verfügung gestellt einschließlich der Krankheit Modellierung, Gentherapie, und Vorspannen Wege der Differenzierung, um nur einige zu nennen. Unter den verfügbaren Bearbeitungen Technologien hat CRISPR/Cas9 von Streptococcus Pyogenes als ein Werkzeug der Wahl für die standortspezifische Bearbeitung des eukaryotischen Genoms entstanden. Das CRISPR sind leicht zugänglich, kostengünstig und höchst effizient in technische gezielte Bearbeitungen. Das System benötigt einen Cas9-Nuklease und ein Führer-Sequenz (20-Mer) spezifisch für die genomische Ziel anschlagenden ein 3-Nukleotid "NGG" Protospacer-neben-Motiv (PAM) für die Ausrichtung der Cas9 auf die gewünschte genomischen Locus, neben einem universellen Cas9 Bindung Tracer RNA ( zusammengerufen einzelne Führer RNS oder SgRNA). Hier präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die effiziente Erzeugung von Feeder-unabhängig und frei von Fußabdruck iPSC und beschreiben Methoden für die Genom-Bearbeitung der iPSC mit Cas9 Ribonucleoprotein (RNP) komplexe. Das Genom Bearbeitung Protokoll ist effektiv und kann leicht durch Pre-Komplexbildner SgRNAs für mehr als ein Ziel mit dem Cas9 Protein und gleichzeitig in die Zellen liefern gemultiplext werden. Schließlich beschreiben wir einen vereinfachten Ansatz zur Identifizierung und Charakterisierung von iPSCs mit gewünschten Bearbeitungen. Zusammengenommen dürften die skizzierten Strategien zur Erzeugung und Bearbeitung von iPSC für vielfältige Anwendungen zu optimieren.

In dieser Publikation haben wir eine einfache, aber effiziente Protokoll für die Generation der iPSC aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit Integration oder Fußabdruck-kostenlose Sendai Virus Vektoren verfolgt. Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung dieses Neuprogrammierung Protokolls. Die menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüsen waren kommerziell, erworben in Prigrow III Medium kultiviert und ausgestrahlt mit Sendai-Virus wie oben be...

Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Generation der Fußabdruck-freie induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse in den Feeder-freien Bedingungen, gefolgt von Bearbeitung mit CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins und Charakterisierung der geänderten einzellige Klone.

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fußabdruckfreie induzierte pluripotente Stammzellen oder IPSCs aus menschlichen Pankreaszellen unter konservenfreien Bedingungen zu erzeugen, anschließend die Zellen mittels CRISPR-Cas9-Ribonukleoproteinen zu bearbeiten und schließlich die modifizierten Einzelzellklone zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Genomeditierung menschlicher Stammzellen zu beantworten, beispielsweise die Erzeugung fußabdruckfreier IPSCs und die Bearbeitung mittels CRISPR-Cas9-Ribonukleoproteinen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass klonale Linien editierter IPSCs mit hoher Zuverlässigkeit erzeugt werden können und keine Hinweise auf Mosaikbildung vorliegen.Nachdem eine 6-Loch-Platte mit kaltem Kollagen beschichtet wurde, am Tag 2 humane primäre Pankreaszellen aus frühen Passagen in Prigrow-III-Medium ansäen, um am Tag der Transduktion (Tag Null) etwa 2,5 × 10⁵ Zellen oder zumindest eine Konfluenz von 60 % pro Loch zu erreichen. Am Tag der Transduktion, nachdem die Zellen gemäß dem Textprotokoll geerntet und gezählt wurden, ein Set Sendai-Vektor-Röhrchen auf Eis auftauen und die berechneten Volumi

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Genom-Editing-Tools wie das CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) haben die Effizienz des Gen-Targetings in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) erheblich verbessert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Generierung eines linienspezifischen hiPSC-Reporters unter Verwendung der CRISPR/Cas-System-unterstützten homologen Rekombination.

Effiziente Erzeugung von hiPSC Neural Lineage Spezifische Knockin Reporter Mit den CRISPR / Cas9 und Cas9 Doppel Nickase-System

Genom-Editierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) kann schnell und effizient durchgeführt werden. Hier wird ein robustes experimentelles Verfahren zur genetischen Veränderung von hPSCs vorgestellt, wie es am Beispiel der Editierung des AAVS1-Safe-Harbor-Locus zur Expression von EGFP und zur Einführung von Antibiotikaresistenzen veranschaulicht wird.

Einrichtung von Genom bearbeitet humanen pluripotenten Stammzelllinien: Von Targeting zur Isolation

Protokolle HPSC Mutantenlinien mit der iCRISPR Plattform und zu differenzieren hPSCs in Glukose-responsive β-ähnlichen Zellen beschrieben zu erzeugen. Genom Bearbeitungstechnologie mit HPSC gerichtete Differenzierung Die Kombination bietet eine leistungsfähige Plattform für die systematische Analyse der Rolle von Lineage Determinanten in der menschlichen Entwicklung und Progression der Erkrankung.

Genome Editing und gerichteten Differenzierung von hPSCs zur Abfrage Lineage Bestimmungsfaktoren im Bereich Human Pancreatic Entwicklung

Ein Protokoll für schnelle CRISPR/Cas9-vermittelte gen Störung bei Maus und humane primäre hämatopoetische Zellen wird in diesem Artikel beschrieben. Cas9-SgRNA Ribonucleoproteins sind über Elektroporation mit SgRNAs erzeugt durch in-vitro- Transkription und kommerzielle Cas9 eingeführt. Hohe Wirkungsgrade Bearbeitung werden mit wenig Zeit und finanziellem Aufwand erreicht.

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Unter Verwendung einer vormontierten Cas9 ist Ribonucleoprotein Komplex (RNP) eine leistungsfähige Methode für präzise und effiziente Genom-Bearbeitung. Hier heben wir ihre Nützlichkeit in einem breiten Spektrum von Zellen und Organismen, einschließlich der primären humanen Zellen und sowohl klassische und neue Modellorganismen.

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Hier beschrieben ist, dass ein Protokoll für die Markierung von endogen Proteine mit fluoreszierenden Tags in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9 ausgedrückt. Vermeintlich bearbeitete Zellen werden bereichert durch Fluoreszenz aktiviert Zellsortierung und klonale Zell-Linien entstehen.

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

Hier wird ein Protokoll zur effizienten CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-vermittelten Genbearbeitung in Säugetierzellen mittels Röhrenelektroporation vorgestellt.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-vermittelte präzise Genbearbeitung durch Tube Electroporation

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Erleichterung der Erzeugung definierter heterozygoter oder homozygoter Nukleotid-Änderungen mit CRISPR-CAS9 in menschlichen pluripotenten Stammzellen.

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur nahtlosen Genbearbeitung in humanen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines piggyBac-basierten Donorplasmids und der Cas9-Nickase-Mutante. Zwei Punktmutationen wurden in Exon 8 des Hepatozyten-Kernfaktor-4-alpha-Locus (HNF4α) in humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) eingeführt.

Einführung von Punktmutationen in humane pluripotente Stammzellen durch nahtlose Genom-Editierung

Die vorgestellte Methode beschreibt die Erzeugung eines CRISPR-vermittelten Gen-Knockouts in der humanen embryonalen Stammzelllinie (hESC) H9, die sgRNAs, die auf das L2HGDH-Gen abzielen, unter Verwendung eines hocheffizienten lentiviralen Gentransfersystems stabil exprimiert.

CRISPR-Cas9-vermittelte Gendeletion in humanen pluripotenten Stammzellen, die unter feederfreien Bedingungen kultiviert wurden

Lernen Sie die Erzeugung und Bearbeitung von feeder-freien iPSCs aus menschlichen Bauchspeicheldrüsenzellen mit CRISPR-Cas9-Ribonukleoproteinen. Diese Methode ermöglicht zuverlässige kloniale Linien ohne Mosaizismus.

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System (Video) | JoVE Journal

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

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