Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Generation der Fußabdruck-freie induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse in den Feeder-freien Bedingungen, gefolgt von Bearbeitung mit CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins und Charakterisierung der geänderten einzellige Klone.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, fußabdruckfreie induzierte pluripotente Stammzellen oder IPSCs aus menschlichen Pankreaszellen unter feederfreien Bedingungen zu erzeugen, dann die Zellen mit Hilfe von CRISPR-Cas9-Ribonukleoproteinen zu editieren und schließlich die modifizierten Einzelzellklone zu charakterisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Genom-Editierung von humanen Stammzellen zu beantworten, wie z. B. die Generierung von fußabdruckfreien IPSCs und die Editierung mit CRISPR-Cas9-Ribonukleoproteinen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass klonale Linien von editierten IPSCs mit hoher Zuverlässigkeit erzeugt werden können und es keine Hinweise auf Mosaizismus gibt.

Nach der Beschichtung einer Sechs-Well-Platte mit kaltem Kollagen wird die frühe Passage der primären Pankreaszellen am Tag 2 in Prigrow III Medium plattiert, um am Tag der Transduktion oder am Tag Null etwa 2,5 x 10 zu den 5 Zellen oder mindestens 60 % Konfluenz pro Vertiefung zu erreichen. Am Tag der Transduktion nach der Ernte und Zählung der Zellen gemäß dem Textprotokoll einen Satz Sendai-Vektorröhrchen auf Eis auftauen und die berechneten Volumina jedes Röhrchens vorsichtig zu 1 ml vorgewärmtem Prigrow III-Medium hinzufügen. Pipettieren Sie vorsichtig, um die Lösung zu mischen.

Aspirieren Sie das Prigrow III aus den Zellen und geben Sie langsam das Reprogrammierungsvirusgemisch in die Vertiefungen. Anschließend werden die Zellen über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator inkubiert. Vierundzwanzig Stunden nach der Transduktion entsorgen Sie das Virusgemisch vorsichtig auf den Zellen und ersetzen es durch frisches Prigrow III-Medium.

Geben Sie am sechsten Tag 1 ml Zellablösungslösung zu den Zellen und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang. Dann werden mit Prigrow III mit Gesteinsinhibitor alle Zellen auf Schalen mit MEFs plattiert, die am Vortag zubereitet wurden. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Beobachten Sie die Platten regelmäßig auf das Auftreten von Zellklumpen oder Kolonien, die auf reprogrammierte Zellen hinweisen, die klonale Aggregate mit einer Kopfsteinpflaster-Morphologie und einem großen Kern und Nukleolen bilden. Markieren Sie die wahrscheinlichen IPSC-Völker und kontrollieren Sie sie regelmäßig auf Wachstum. Fast vier Wochen nach der Transduktion nach der Vorbereitung von 24-Well-MEF-Platten bereiten Sie die Matrixmembran vor, indem Sie sie basierend auf dem Verdünnungsfaktor auf dem Analysezertifikat aliquotieren.

Entnehmen Sie 24-48 Kolonien und übertragen Sie sie auf mit Matrixmembran beschichtete 24-Well-Platten mit mTeSR1. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang und wechseln Sie das Medium täglich. Weitere Informationen finden Sie im Textprotokoll.

Fügen Sie 500 mcL Dispase hinzu, um die robusten Kolonien zu lösen, die auf der Matrixmembran plattiert sind. Nachdem Sie die Zellen 20 Minuten lang inkubiert haben, plattieren Sie sie erneut auf 12-Well-Platten mit Matrixmembran. Erweitern und charakterisieren Sie die Klone durch alkalische Phosphatase-Färbung, Immunfärbung und FACS-Analyse gemäß dem Textprotokoll.

Um HIPSCs nach der Synthese von SGRNAs gemäß dem Textprotokoll zu transfizieren, bereiten Sie für jede Probe einen Nukleofaction-Mastermix vor, indem Sie 0,5 μg Cas9-Protein und 0,5 μg jedes SGRNA in einem Reaktionsvolumen von 22 μl kombinieren. Nach dem Aspirieren des Mediums, das den Gesteinsinhibitor enthält, verwenden Sie 2 ml RTPBS, um jede Vertiefung von ISPCs zu waschen. Aspirieren Sie dann das PBS und fügen Sie 1 ml Zellablösungslösung hinzu.

Inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml mTeSR1-Medium und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Die dissoziierten Zellen werden in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5 ml mTeSR1-Medium überführt.

Fügen Sie dem Nukleofections-Mastermix 16,4 μl P3-Primärzellergänzung und 3,6 μl Ergänzungsmittel eins aus dem Nucleofector-Kit hinzu. Nach dem Zählen und Spinnen der Zellen resuspendieren Sie jede Einheit von 0,5 x 10 in die 6. Zellen in 22 mcL des zuvor vorbereiteten Transfektions-Mastermixes. Übertragen Sie die Zellen schnell in die zentrale Kammer einer Vertiefung eines Nucleocuvette-Streifens.

Legen Sie dann den Streifen in ein Nucleofector-Gerät und nukleofizieren Sie die Zellen mit dem Programm CB150. Nach der Nukleofektion geben Sie schnell 80 μl vorgewärmtes mTeSR1-Medium, das 10 mikromolare Gesteinsinhibitoren enthält, in jede Vertiefung der nukleofectierten Zellen. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren.

Übertragen Sie die Zellen vorsichtig aus dem Streifen in die Vertiefungen der vorbeschichteten 12-Well-Platte der Matrixmembran, die mTeSR1-Medium mit Gesteinsinhibitor enthält. Am zweiten Tag der Inkubation nach der Vorbereitung der MEF-Platten ist das Medium auf den HIPSCs von mTeSR1 auf mTeSR1, ergänzt mit 1XSMC4, mindestens zwei Stunden lang zu ersetzen, bevor die Einzelzellsortierung durchgeführt wird. Aspirieren Sie das Medium aus HIPSCs und verwenden Sie PBS, um die Zellen sanft zu waschen.

Geben Sie dann 500 μl Zellablösungslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Erzeugen Sie eine Einzelzellsuspension, indem Sie 1 ml mTeSR1 in jede Vertiefung geben und mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren. Sortieren Sie einzelne Zellen in einzelne Wells einer zuvor vorbereiteten 96-Well-Platte.

Vier Tage nach der Sortierung sollte die Koloniebildung erkennbar sein. Ersetzen Sie zu diesem Zeitpunkt das Kulturmedium durch HESC-Medium, das mit 1X SMC4 ergänzt wird. Nach dem Extrahieren und Expandieren der Ziel-DNA gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie ein Fragment-Analysator-Kit, um die PCR-amplifizierte genomische Zielregion aller Klone gemäß den Anweisungen des Herstellers durch die Gelfarbstoffmischung laufen zu lassen.

Bestätigen Sie pluripotente IPSC-Klone gemäß dem Textprotokoll. Vor der Transduktion des Sendai-Virus zeigen Pankreaszellen eine typische spindelartige Morphologie. Am 12. Tag erscheinen auf MEFs kleine dichte Kolonien, die menschlichen pluripotenten Zellkolonien ähneln.

Normalerweise haben die vollständig umprogrammierten menschlichen IPSC-Kolonien sehr klare Grenzen und können an den Tagen 23 bis 30 abgeholt werden. Hier ist eine dissoziierte Kolonie an Tag 23 zu sehen. Hier ist ein typisches Phasenkontrastbild einer IPSC-Kolonie nach der Ernte und Kultivierung unter feederfreien Bedingungen nach der Reprogrammierung von Pankreaszellen durch das Sendai-Virus dargestellt.

Auf der rechten Seite befinden sich mit alkalischer Phosphatase gefärbte rote IPSC-Kolonien. IPSCs wurden durch Immunfärbung für die Pluripotenzmarker OCT4 und NANOG bestätigt, wie in diesen Panels zu sehen ist. In diesem Experiment wurden IPSCs mit Zelloberflächenmarkern gefärbt und die FACS-Analyse an einer Einzelzellsuspension durchgeführt.

Der grüne Peak stellt die IPSCs der Bauchspeicheldrüse dar, und der violette Peak enthält IPSC-negative Zellen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, aseptische oder sterile Bedingungen für die Zellsortierung und Zellkultur aufrechtzuerhalten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Gen-Targeting in IPSCs und ESCs durchgeführt werden, und zusätzliche Fragen können durch präzise genetische Modifikationen beantwortet werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie zuverlässig fußabdruck- und feederfreie IPSCs generieren und Genome Editing biallelisch durchführen können.