Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fußabdruckfreie induzierte pluripotente Stammzellen oder IPSCs aus menschlichen Pankreaszellen unter konservenfreien Bedingungen zu erzeugen, anschließend die Zellen mittels CRISPR-Cas9-Ribonukleoproteinen zu bearbeiten und schließlich die modifizierten Einzelzellklone zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Genomeditierung menschlicher Stammzellen zu beantworten, beispielsweise die Erzeugung fußabdruckfreier IPSCs und die Bearbeitung mittels CRISPR-Cas9-Ribonukleoproteinen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass klonale Linien editierter IPSCs mit hoher Zuverlässigkeit erzeugt werden können und keine Hinweise auf Mosaikbildung vorliegen.

Nachdem eine 6-Loch-Platte mit kaltem Kollagen beschichtet wurde, am Tag 2 humane primäre Pankreaszellen aus frühen Passagen in Prigrow-III-Medium ansäen, um am Tag der Transduktion (Tag Null) etwa 2,5 × 10⁵ Zellen oder zumindest eine Konfluenz von 60 % pro Loch zu erreichen. Am Tag der Transduktion, nachdem die Zellen gemäß dem Textprotokoll geerntet und gezählt wurden, ein Set Sendai-Vektor-Röhrchen auf Eis auftauen und die berechneten Volumina jedes Röhrchens vorsichtig zu 1 mL vorgewärmtem Prigrow-III-Medium hinzufügen. Sanft pipettieren, um die Lösung zu mischen.

Aspirieren Sie das Prigrow III von den Zellen ab und geben Sie langsam die Umlenkungs-Virusmischung in die Vertiefungen. Inkubieren Sie die Zellen anschließend über Nacht in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator. Einundzwanzig Stunden nach der Transduktion entsorgen Sie vorsichtig die Virusmischung auf den Zellen und ersetzen sie durch frisches Prigrow-III-Medium.

Am sechsten Tag 1 mL Zell-Detachierungslösung zu den Zellen geben und 10 Minuten lang inkubieren. Anschließend alle Zellen unter Verwendung von Prigrow III mit Rock-Inhibitor auf Schalen mit am Vortag vorbereiteten MEFs ausplattieren. Die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Beobachten Sie die Platten regelmäßig auf das Auftreten von Zellklumpen oder Kolonien, die auf reprogrammierte Zellen hinweisen, die klonale Aggregate mit einer pflastersteinartigen Morphologie sowie einem großen Kern und großen Nukleolen bilden. Markieren Sie mögliche iPSC-Kolonien und überprüfen Sie sie regelmäßig auf Wachstum. Fast vier Wochen nach der Transduktion, nachdem 24-Loch-MEF-Platten vorbereitet wurden, bereiten Sie die Matrixmembran vor, indem Sie sie basierend auf dem Verdünnungsfaktor gemäß dem Zertifikat der Analyse aliquotieren.

Wählen Sie 24–48 Kolonien aus und übertragen Sie sie auf Matrix-beschichtete 24-Loch-Platten mit mTeSR1. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang und wechseln Sie das Medium täglich. Weitere Einzelheiten finden Sie im Textprotokoll.

Geben Sie 500 µL Dispase hinzu, um die robusten Kolonien, die auf der Matrixmembran platziert wurden, zu lösen. Nach einer 20-minütigen Inkubation der Zellen platzieren Sie diese erneut auf mit Matrixmembran beschichteten 12-Loch-Platten. Vermehren und charakterisieren Sie die Klone mittels alkalischer Phosphatase-Färbung, Immunfärbung und FACS-Analyse gemäß dem schriftlichen Protokoll.

Um HIPSCs zu transfizieren, nachdem SGRNAs gemäß dem Textprotokoll synthetisiert wurden, bereiten Sie für jede Probe ein Nukleofektions-Hauptgemisch vor, indem Sie 0,5 µg Cas9-Protein und 0,5 µg jeder SGRNA in einem Reaktionsvolumen von 22 µL kombinieren. Nachdem das Medium, das Rock-Inhibitor enthält, abgesaugt wurde, spülen Sie jede Vertiefung von ISPCs mit 2 mL RTPBS. Danach saugen Sie das PBS ab und geben 1 mL Zellablösungslösung hinzu.

Die Platte 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Zellen in 3 mL mTeSR1-Medium resuspendieren und vorsichtig mehrmals auf- und abpipettieren, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen. Die dissoziierten Zellen in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen überführen, das 5 mL mTeSR1-Medium enthält.

Zum Nukleofektions-Mastermix geben Sie 16,4 µL P3-Primärzellzusatz und 3,6 µL Zusatzmittel eins aus dem Nucleofector-Kit hinzu. Nach dem Zählen und Zentrifugieren der Zellen resuspendieren Sie jede Einheit von 0,5 × 10⁶ Zellen in 22 µL des zuvor hergestellten Transfektions-Mastermixes. Überführen Sie die Zellen schnell in die zentrale Kammer eines Wells eines Nucleocuvette-Streifens.

Danach den Streifen in ein Nucleofector-Gerät geben und die Zellen mit dem Programm CB150 nucleofizieren. Unmittelbar nach der Nucleofizierung 80 µL vorgewärmtes mTeSR1-Medium mit 10 µM ROCK-Inhibitor in jede Vertiefung mit den nucleofizierten Zellen geben. Vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren mischen.

Überführen Sie die Zellen vorsichtig vom Streifen in die Vertiefungen einer 12-Loch-Platte mit vorbeschichteter Matrixmembran, die mTeSR1-Medium mit Rock-Inhibitor enthält. Am zweiten Tag der Inkubation nach der Herstellung der MEF-Platten ersetzen Sie das Medium der HIPSCs von mTeSR1 auf mTeSR1, ergänzt mit 1XSMC4, für mindestens zwei Stunden vor der Einzelzell-Sortierung. Aspirieren Sie das Medium von den HIPSCs und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS.

Anschießend 500 µL Zell-Detachierungslösung in jede Vertiefung geben und die Zellen 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Eine Einzelzell-Suspension erzeugen, indem 1 mL mTeSR1 zu jeder Vertiefung hinzugefügt und mehrmals vorsichtig auf- und abpipettiert wird. Einzelzellen in die Vertiefungen einer zuvor vorbereiteten 96-Well-Platte sortieren.

Vier Tage nach der Sortierung sollte die Koloniebildung sichtbar sein. Zu diesem Zeitpunkt ersetzen Sie das Kulturmedium durch HESC-Medium, das mit 1X SMC4 ergänzt wurde. Nach der Extraktion und Amplifikation der Ziel-DNA gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie ein Fragmentanalyseset, um den PCR-amplifizierten genomischen Zielbereich aller Klone gemäß den Herstelleranweisungen durch die Geleinfärbemischung laufen zu lassen.

Bestätigen Sie pluripotente iPSC-Klone gemäß dem Textprotokoll. Vor der Sendai-Virus-Transduktion zeigen Pankreaszellen eine typische spindelartige Morphologie. Kleine, dichte Kolonien erscheinen bis zum Tag 12 auf MEFs und ähneln menschlichen pluripotenten Zellkolonien.

Normalerweise weisen vollständig reprogrammierte humane iPSC-Kolonien sehr klare Begrenzungen auf und können zwischen Tag 23 und 30 abgenommen werden. Hier ist eine dissoziierte Kolonie am Tag 23 dargestellt. Gezeigt ist ein typisches Phasenkontrastbild einer iPSC-Kolonie nach dem Abnehmen und der Kultur unter feeder-freien Bedingungen nach der Reprogrammierung von Pankreaszellen mittels Sendai-Virus.

Rote, mit Alkalischer Phosphatase gefärbte iPSC-Kolonien befinden sich rechts. Die iPSCs wurden durch Immunfärbung für die Pluripotenzmarker OCT4 und NANOG bestätigt, wie in diesen Darstellungen zu sehen ist. In diesem Experiment wurden iPSCs mit Zelloberflächenmarkern gefärbt und eine FACS-Analyse an einer Einzelzell-Suspension durchgeführt.

Der grüne Peak repräsentiert pankreatische IPSCs, und der violette Peak enthält IPSC-negative Zellen. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, aseptische oder sterile Bedingungen für die Zellsortierung und Zellkultur beizubehalten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Genzielansteuerung in IPSCs und ESCs durchgeführt werden, und zusätzliche Fragestellungen können durch präzise genetische Modifikationen beantwortet werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man zuverlässig fußabdruckfreie und fütterungszellfreie iPSCs erzeugt und biallelische Genom-Editierung durchführt.