Produktion von gentechnisch syrischen Goldhamster durch man Injektion des Komplexes CRISPR/Cas9

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, den Betrachtern detaillierte Verfahren zur Herstellung genetisch veränderter Goldhamster (Golden Syrian Hamster) mittels Pronukleusinjektion des CRISPR/Cas9-Komplexes bereitzustellen. Dieses von uns entwickelte PN-Injektionsprotokoll für den Golden Syrian Hamster macht die Genetische Veränderung bei dieser Tierart möglich. Diese Technologie leistet einen bedeutenden Beitrag für den Bereich der Entwicklung von Tiermodellen.

Aufgrund der extremen Empfindlichkeit von Hamsterembryonen gegenüber der Umgebung haben wir ein einzigartiges Verfahren zur Pronukleusinjektion entwickelt, das den besonderen Anforderungen von Hamsterembryonen Rechnung trägt. Die Entwicklung dieser Technik stellt einen großen Fortschritt in der Modellierung menschlicher Krankheiten dar, da erstmals genetisch veränderte Hamstermodelle hergestellt werden können. Bereiten Sie für dieses Experiment einen Tag vor der Pronukleus- oder PN-Injektion Zygote-Handhabungsschalen und einen PN-Injektions-Tropfen in einem Deckel einer 35-Millimeter-Schale mit HECM-9-Medium vor.

Decken Sie die Mediumstropfen mit Mineralöl ab. Um die Tropfen und das HECM-9-Medium auszugleichen, inkubieren Sie diese über Nacht bei 37,5 Grad Celsius. Am Tag der PN-Injektion bereiten Sie Embryo-Flush-Schalen mit HECM-9 vor.

Bewahren Sie sie bis zur Verwendung im Inkubator auf. Um die Eileiter zu isolieren, positionieren Sie ein euthanasiertes, superovuliertes weibliches Hamster in Rückenlage auf einem chirurgischen Tuch. Desinfizieren Sie den Bauchbereich mit 70 % Ethanol.

Als Nächstes halten Sie Haut und Bauchmuskelschicht mittig fest und führen einen Schnitt entlang des hinteren Abdomens durch. Um die Bauchorgane freizulegen, schneiden Sie das Peritoneum an. Anschließend greifen Sie mit einer feinen Pinzette einen der Gebärmutterhörner und ziehen das Gewebe aus dem Abdomen heraus.

Trennen Sie den Uterus vom Mesometrium und vom Fettgewebe. Führen Sie den ersten Schnitt zwischen Eileiter und Eierstock sowie einen zweiten in der Nähe der Verbindung zwischen Eileiter und Uterus durch, wobei ein kleiner Teil des Uterus mit einbezogen wird. Legen Sie die Eileiter in dieselbe Petrischale.

Um die Zygoten unter dem Stereomikroskop zu sammeln, greifen Sie mit einer Dumont-Pinzette der Stärke 5 die Seite des Uterushorns. Führen Sie eine selbstgebastelte Nadel vom Fimbrienende in das Lumen des Eileiters ein. Spülen Sie anschließend den Eileiter mit 300 bis 400 Mikrolitern HECM-9-Medium aus.

Sofort nach dem Spülen sammeln Sie die Zygoten und waschen Sie diese zweimal mit HECM-9 in der Handelschale. Alle Zygoten sollten zu diesem Entwicklungszeitpunkt von den Cumuluszellen befreit sein. Danach stellen Sie die Zygoten zur Vermeidung von Lichteinwirkung in einen Inkubator, bis die Injektion erfolgt.

Um sich auf die Injektion vorzubereiten, tauen Sie die Cas9-sgRNA-RNP-Komplexe auf Eis auf. Unmittelbar vor der Injektion befüllen Sie die Injektionsnadel, indem Sie das hintere Ende der Nadel in das Röhrchen mit der Lösung eintauchen und die Lösung durch Kapillarwirkung in die Nadel aufsteigen lassen. Füllen Sie danach die Halterpipette mit Mineralsöl bis auf etwa drei Millimeter vor die Nadelkrümmung. Stellen Sie den Halter in den Mikroinjektor, wobei die Spitze der Halterpipette waagerecht zum Boden der Petrischale ausgerichtet sein sollte.

Füllen Sie die Nadelspitze durch Absaugen mit Medium. Danach stellen Sie die Injektionsnadel in einem Winkel von 10 bis 15 Grad entgegen zur Haltenadel ein. Suchen Sie anschließend eine Zygote und saugen Sie diese vorsichtig mit der Haltenadel an.

Männliche, die etwas größer sind, und weibliche Pronuklei sollten vorzugsweise im gleichen Fokusbereich liegen und parallel zum Halter ausgerichtet sein. Mit der Injektionsnadel in einer Position um drei Uhr durchdringen Sie die Zona pellucida und das männliche Pronukleus. Sobald das Pronukleus anschwollt, ziehen Sie die Injektionsnadel schnell zurück, um zu verhindern, dass der Zellkern an der Nadel haften bleibt, und um Schäden zu vermeiden.

Die Effizienz der Gen-Targeting-Strategie für die Gene STAT2 und RAG1 mittels des Cas9/sgRNA-Systems wird anhand der Geburtenrate der Empfängerinnen und der Anzahl lebend geborener Welpen mit den gewünschten genetischen Modifikationen bewertet. Genotypisierungsergebnisse aus einem PCR-Restriktionslängenpolymorphismus-Test (PCR-RFLP) der Welpen zeigen die Effizienz des Gen-Targeting. Lane eins zeigt biallelisch gezielte Allele, während Lane drei und sieben monoallelisch bzw. mosaikartig gezielte Allele darstellen.

Diese Technologie hat den Weg dafür geebnet, dass Forscher neuere genetisch veränderte Hamstermodelle menschlicher Krankheiten entwickeln können. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie genetisch veränderte Goldene Syrische Hamster durch eine Pronukleusinjektion des CRISPR/Cas9-Komplexes erzeugt werden.