Oralen Biofilm Sampling für Microbiome Analyse bei gesunden Kindern
31. Dezember 2017
Änderungen in der mündlichen Microbiome während der gesamten Kindheit sind von wachsendem Interesse. Vergleich der verschiedenen Microbiome Studien zeigt einen Mangel an standardisierten Probenahme Protokolle. Begrenzten Raum macht Probenahme Ton subgingivalen Sulcus von schwierigen Kindern. Papier Punkt Probenahme präsentiert sich hier im Detail als die Methode der Wahl für diesen Bereich.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine standardisierte Methode zur oralen Biofilmentnahme für die Mikrobiomanalyse bei gesunden Kindern vorzustellen. Dies wird erreicht, indem Instrumente und Material zunächst vorbereitet und sterilisiert werden. Als nächstes wird das Kind auf die Biofilmentnahme vorbereitet.
Dann wird eine Biofilmprobenahme an drei Stellen durchgeführt, dem subgingivalen Sulcus, der Schleimhaut aus der Vestibularfalte und dem Speichel. Schließlich werden die Proben systematisch gelagert. Letztendlich werden die oralen Mikrobiomanalysen durchgeführt, um klinische und wissenschaftliche Fragestellungen zu beantworten.
Hallo, ich bin Elizabeth und ich bin Kieferorthopädin. Meine Forschung konzentriert sich auf die Veränderungen des oralen Mikrobioms, die mit einer kieferorthopädischen Behandlung einhergehen. Die Probenahme von oralem Biofilm kann schwierig sein.
Der Platz im subgingivalen Sulcus ist vor allem bei Kindern begrenzt. Beim Vergleich unserer Mikrobiomdaten mit der weltweiten Forschung stellten wir fest, dass es an standardisierten Probenahmeprotokollen mangelt. Mit diesem Video machen wir den ersten Schritt, um diese Lücke zu schließen.
Kalibrierte und sterile Papierspitzen, die üblicherweise in der endodontischen Therapie verwendet werden, werden an der ersten Ringmarke geschnitten, um ihre Länge zu standardisieren. Nach dem Schneiden müssen die Papierspitzen mit UV-Strahlung bestrahlt werden, um DNA- und RNA-Kontaminationen zu vermeiden. Die Röhren für die Lagerung werden autoklaviert und ebenfalls UV-bestrahlt.
Vor der Biofilm-Probenahme müssen die Zähne vollständig gereinigt werden, beginnend mit dem Auftragen von Kakaobutter. Dann werden die Zähne mit Plaque verfärbt. Nach dem Färben wird der Mund mit Wasser gespült.
Die Zähne werden richtig mit einer elektrischen Zahnbürste und Wasser geputzt. Es wird keine Zahnpasta aufgetragen, da dies den oralen Biofilm verändern würde. Ein Wangen- und Zungenretraktor wird verwendet, um den Mund offen und trocken zu halten.
Das Platzieren des Retraktors erfordert geschickte und ruhige Hände, um die Unannehmlichkeiten für das Kind zu minimieren und den Eingriff so kurz wie möglich zu halten. Es wird eine sterile Zahnpinzette verwendet, und die Probenahmestelle bleibt während des gesamten Eingriffs unberührt. Die Zähne werden mit sterilen Wattestäbchen gereinigt und getrocknet, um eine Aufnahme von supragingivaler Flüssigkeit während der Papierpunktprobenentnahme zu vermeiden.
Für die Biofilmprobenahme in der Mundhöhle können unterschiedliche Methoden eingesetzt werden. Aufgrund des begrenzten Platzes im subgingivalen Sulcus der Kinder ist die Papierpunktprobenahme die Methode der Wahl. Papierspitzen werden bis zu einer definierten Länge von vier Millimetern für 20 Sekunden tangential eingelegt.
Besondere Vorsicht ist geboten, um das Junktionsepithel nicht zu traumatisieren. An der dritten Markierung werden dann Papierspitzen auf eine standardisierte Länge von vier Millimetern geschnitten. Paper Point kann auch gleichzeitig in dieselbe Stelle eingefügt werden, oder es können Proben von mehreren Stellen zusammengefasst werden.
Das Trockenfeldgerät wird für die Schleimhaut- und Speichelprobenahme entfernt. Paper Points können auf die gleiche Weise aufgebracht werden, um den Biofilm der Schleimhaut in der vestibulären Falte zu beproben. Der Speichelbiofilm kann durch Ausspucken von unstimuliertem Speichel entnommen werden.
Je nach Studiendesign werden Papierpunkte als einzelne, gepoolte oder parallele Stichproben gespeichert. Ein farbcodiertes Lagersystem erleichtert die weitere Probenverwaltung. Schließlich werden die Proben für Mikrobiomanalysen bei minus 80 Grad Celsius gelagert.
Für die schnelle und genaue Identifizierung parodontopathogener Bakterien wurden mehrere kommerzielle Kits entwickelt. Paper Points werden an spezialisierte Labore geschickt. Die DNA-Extraktion, -Aufbereitung und -Analyse erfolgt dann innerhalb von drei Stunden.
Die DNA kann auch in der Forschung für Mikrobiomstudien verwendet werden. Next Generation Sequencing zum Beispiel führt zu vollständigen Mikrobiom-Datensätzen. Die relative Gesamthäufigkeit bestimmter Bakterienarten kann analysiert werden, ebenso wie Verschiebungen in der Mikrobiota aufgrund sich ändernder Bedingungen.
Dieses Balkendiagramm und diese Heatmap zeigen die relative Häufigkeit der subgingivalen Mikrobiota auf dem Stamm und auf der Ordnungsebene. Unterschiede in der mikrobiellen Zusammensetzung im Laufe der Zeit, Vergleiche zwischen oder innerhalb von Individuen oder unterschiedliche Probenahmemethoden werden in Histogrammen dargestellt. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse eines Vergleichs von zwei Stichprobenmethoden, Mode A und Mode B, auf unterschiedlichen taxonomischen Ebenen.
Die statistische Analyse der Werte, die mit Next Generation Sequencing erstellt wurden, kann in Tabellen dargestellt werden. Unterschiedliche Zeitpunkte, wie sie in dieser Tabelle dargestellt sind, können auf verschiedenen taxonomischen Ebenen analysiert werden. P-Werte werden berechnet, um signifikante Befunde nachzuweisen.
Schließlich kann das orale Mikrobiom auf OTU-Ebene mit Hilfe von Hauptkoordinatenanalysen visualisiert werden. Diese Abbildung zeigt intra- und interindividuelle Unterschiede bei fünf Probanden. Eine Häufung bestimmter Gruppen kann Verschiebungen in der Zusammensetzung des Mikrobioms zeigen.
Diese 3D-Animation zeigt die Ergebnisse einer Fall-Kontroll-Studie. Rote Punkte sind die Fälle. Blaue Punkte sind die Steuerelemente.
Eine deutliche Häufung der Fälle nach kieferorthopädischen Eingriffen an T3, die großen roten Punkte, visualisieren eine Verschiebung des Mikrobioms. Blaue Punkte, die die Kontrollgruppe anzeigen, sind gleichmäßig verteilt. Diese Methode kann Aufschluss über die klinische Biofilmentnahme im subgingivalen Sulcus gesunder Kinder geben.
Wir haben Papierspitzen als am besten geeignet für dieses empfindliche Fach ausgewählt. In diesem Video haben wir die Methode nur auf den dauerhaften Zustand angewendet. Es kann auch auf gemischten oder reifen Zustand angewendet werden.
Bei einigen der Patienten können Sie auch parodontal erkrankte Stellen nach dem gleichen Protokoll beproben. Hallo, mein Name ist Barbara und ich bin Molekularbiologin. Wenn ich Biofilme im Labor analysiere, muss ich mich auf eine Bibliothek mit unvoreingenommenen klinischen Proben verlassen.
Jeder Schritt im interdisziplinären Bereich der oralen mikrobiellen Forschung muss vollständig standardisiert werden. Und es gibt noch eine wichtige Tatsache. Nur im Team kann man erfolgreich sein.
Behandeln Sie Ihre Kollegen also immer nett.
Überblick
Dieser Artikel präsentiert eine standardisierte Methode zur oralen Biofilm-Probenahme bei gesunden Kindern, wobei der Fokus auf den Herausforderungen der Probenahme im begrenzten Raum des subgingivalen Sulcus liegt. Die Methode zielt darauf ab, die Zuverlässigkeit von Mikrobiom-Analysen durch die Behebung des Mangels an standardisierten Protokollen zu verbessern.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Orale Mikrobiomforschung
- Pädiatrische Zahnheilkunde
- Mikrobiologische Probenahmetechniken
Hintergrund
- Veränderungen des oralen Mikrobioms während der Kindheit werden zunehmend untersucht.
- Aktuelle Mikrobiomstudien fehlen standardisierte Probenahmeprotokolle.
- Die Probenahme im subgingivalen Sulcus von Kindern stellt einzigartige Herausforderungen dar.
- Papierspitzen-Probenahme wird als geeignete Methode für diesen Bereich vorgeschlagen.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur oralen Biofilm-Probenahme bei Kindern zu etablieren.
- Verfahren für die Mikrobiomanalyse zu standardisieren.
- Vergleiche zwischen Mikrobiomdaten über Studien hinweg zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Vorbereitung und Sterilisation von Instrumenten und Materialien.
- Reinigung und Vorbereitung der Zähne des Kindes vor der Probenahme.
- Probenahme aus dem subgingivalen Sulcus, der Mundschleimhaut und dem Speichel unter Verwendung von Papierspitzen.
- Systematische Lagerung von Proben für die Mikrobiomanalyse.
Hauptergebnisse
- Standardisierte Papierspitzen-Probenahme sammelt effektiv Biofilm-Proben.
- Proben können für die Analyse gebündelt oder einzeln aufbewahrt werden.
- Next Generation Sequencing liefert detaillierte Mikrobiom-Datensätze.
- Statistische Analysen zeigen signifikante Unterschiede in der mikrobiellen Zusammensetzung.
Schlussfolgerungen
- Die vorgeschlagene Methode verbessert die Zuverlässigkeit von oralen Mikrobiomstudien bei Kindern.
- Standardisierung ist entscheidend für interdisziplinäre Forschung in der oralen Mikrobiologie.
- Zusammenarbeit zwischen Forschern ist für erfolgreiche Ergebnisse unerlässlich.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Standardized oral biofilm sampling in children addresses a critical gap in pediatric microbiome research, enabling reliable data generation for target validation in oral health interventions. The method supports mechanistic de-risking by providing reproducible biological samples that reflect true microbial composition, reducing variability in preclinical assessments. This enhances predictive confidence in early discovery stages where oral microbiota shifts may indicate disease susceptibility or treatment response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of oral microbiome composition as a biomarker for cariogenic and periopathogenic mechanisms in children.
- Operational Value: Provides a standardized sampling protocol that reduces technical variability in microbiome data generation.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing regarding microbial shifts during childhood development and intervention periods.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological samples for downstream NGS and bioinformatic analysis, ensuring assay readiness.
- Operational Value: Facilitates sample pooling or parallel processing, improving throughput and standardization across study sites.
- Scientific Value: Generates quantitative microbial abundance data suitable for assay optimization and screening campaign design.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Delivers disease-relevant samples from healthy pediatric oral sites, establishing baseline for comparative disease modeling.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of microbiome shifts, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical pipelines.
- Scientific Value: Provides mechanistic insights into host-microbe interactions that inform target selection and validation strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying standardized biological inputs for microbiome profiling, which informs target identification and validation efforts prior to lead generation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of microbial community shifts linked to oral health status and developmental stages.
- Screening: Delivers reproducible samples enabling consistent NGS-based microbial profiling for comparative compound or intervention evaluation.
- Analytics: Generates relative abundance and diversity metrics that allow cross-condition comparison and statistical assessment of microbial changes.
- Translational Research: Connects discovery-phase microbiome data to preclinical continuity by establishing healthy baselines for disease model validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable sampling protocol applicable across pediatric oral health studies, reducing protocol redevelopment costs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbiome-associated target validation by minimizing sampling-induced noise.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization across sites and time points, critical for multi-center studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision reliability in oral health programs by reducing false positives from methodological artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of oral microbiome targets based on robust, comparable longitudinal data.
Implementation Considerations
- Requires training in pediatric dental techniques and sterile handling to ensure sample integrity and child cooperation.
- Dependent on access to UV irradiation, autoclaving, and cold storage (-80°C) infrastructure for contamination control and sample preservation.
- Necessitates cross-disciplinary coordination between dental clinicians and molecular biologists for standardized execution.
- Requires adaptation considerations when applying to mixed dentition or periodontally diseased sites, as noted in the protocol.
- Limited by the physical constraints of subgingival access in very young children, which may affect sampling consistency.
