Langfristige Live Imaging-Gerät für verbesserte experimentelle Manipulation von Zebrafischlarven

Das übergeordnete Ziel dieser bildgebenden Geräteherstellung ist es, eine modifizierbare Plattform für die mikroskopische Analyse der Wundheilung in lebenden Zebrafischlarven zu schaffen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Wundheilung zu beantworten, z. B. welchen Beitrag die Reorganisation von Kollagenfasern und zelluläre Reaktionen zum nachträglichen Nachwachsen von Gewebe nach einer Verletzung leisten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Verwundung und Bildgebung in einem einzigen Gerät erfolgt, während das Nachwachsen des Schwanzes durch das Gerät nicht behindert wird.

Darüber hinaus konnten die verschiedenen funktionellen Kompartimente des zWEDGI unabhängig voneinander modifiziert werden, um verschiedene Larvenstadien und eine Reihe von experimentellen Protokollen aufzunehmen. Modellieren Sie zunächst die PDMS-Komponente des Geräts mit den gewünschten Geometrien und Attributen gemäß dem Textprotokoll. Nachdem Sie die Formen mit einem Photopolymer-3D-Drucker gedruckt haben, reinigen Sie die Formen mit einer feinen Bürste, denaturiertem Alkohol in einer Sprühflasche und Druckluft.

Schrubben und entfernen Sie vorsichtig das nicht ausgehärtete Harz, insbesondere jegliches Material aus den Mikrokanalbereichen. Anschließend härten Sie die Formen in einem UV-Nachhärtungsgerät auf jeder Seite 60 Minuten lang nach, da nicht ausgehärtetes Harz für Zebrafischlarven giftig ist. Schleifen Sie mit Schleifpapier der Körnung 200 die Hohlraumseite der Form auf einer ebenen Fläche, bis alle Deckenflächen mit dem Schleifpapier in Kontakt sind.

Mit Schleifpapier der Körnung 400 und 600 schleifen Sie nach und nach leicht, um glatte, bündige Oberflächen über alle Geometrieflächen der Form zu erzeugen. Verwenden Sie dann eine Messuhr, um die Tiefe des Hohlraums nach dem Schleifen zu messen, um sicherzustellen, dass er nahe an der Auslegungstiefe liegt. Reinigen Sie die Formen und Glasabdeckscheiben, indem Sie sie 30 Minuten lang in einen mit Wasser gefüllten Ultraschallreiniger legen oder unter fließendem Wasser spülen.

Verwenden Sie Isopropylalkohol und gefilterte Druckluft, um die Formen und Abdeckungen zu reinigen und zu föhnen. Bereiten Sie eine Reinbank als Ort für die Herstellung der Geräte vor, um die Kontamination durch Schmutz in der Luft zu minimieren. Stellen Sie das PDMS her, indem Sie die Basis und den Aktivator im Verhältnis 5:1 in einen Plastikbecher gießen.

Mit einem hölzernen Bastelstäbchen zwei Minuten lang gut verrühren und das Gel wie beim Kneten von Brot auf sich selbst rühren. Entgasen Sie das Gemisch in einem Vakuumexsikkator für 25 bis 45 Minuten, bis alle Blasen verschwunden sind. Füllen Sie dann mit einer 10-Milliliter-Spritze den Hohlraum jeder 3D-gedruckten Form mit etwa 0,75 Millilitern PDMS, bis die Form leicht mit einem Meniskus überläuft.

Entgasen Sie die gefüllten Formen für 45 Minuten, um zusätzliche Blasen zu entfernen, die sich beim Befüllen gebildet haben könnten. Bringen Sie eine Glasabdeckscheibe auf die PDMS-gefüllte Form an und drücken Sie die Scheibe schräg nach unten, um zu verhindern, dass Blasen eingeschlossen werden. Lassen Sie zu, dass überschüssiges PDMS ausgestoßen wird, wenn die Glasscheibenabdeckung aufgebracht wird.

Verwenden Sie dann eine kleine Ratschenklemme, um die Abdeckscheibe fest an der Form zu halten. Aus Gründen der Effizienz kann eine Mehrfachklemmvorrichtung verwendet werden. Härten Sie das PDMS-Gerät und die eingespannten Formen bei 100 Grad Celsius in einem Ofen für mindestens 90 Minuten aus.

Nehmen Sie dann die Förmchen aus dem Ofen und lassen Sie sie abkühlen, bis sie leicht zu handhaben sind. Klemmen Sie die Form, in der sich die ausgehärtete PDMS-Vorrichtung befindet, so in einen Schraubstock, dass die Geometrien der Form nach oben zeigen, parallel zur Arbeitstisch. Beginnen Sie mit dem Entfernen des PDMS-Geräts, indem Sie den PDMS-Zughahn mit einer flachen Pinzette aus der Form lösen.

Arbeite dann mit der Pinzette um den Umfang der Form herum. Das PDMS muss mindestens 90 Minuten bei 100 Grad Celsius ausgehärtet werden, sonst bleibt es klebrig und klebt an der Form. Ein gutes Indiz dafür, dass Sie das Gerät lange genug ausgehärtet haben, ist, dass Sie tatsächlich eine Luftblase an der Schnittstelle zwischen der Form und dem PDMS-Gerät sehen, was darauf hindeutet, dass sie leicht entfernt werden kann.

Heben Sie das Gerät mit gefilterter Druckluft und einer Pinzette vorsichtig aus der Form, indem Sie sich an der Zuglasche festhalten und Luft unter das Gerät blasen. Platzieren Sie als Nächstes das PDMS-Gerät kopfüber auf der Innenseite der Abdeckung einer Glasbodenschale, so dass die Rückhaltekeile des Tunnels den Kunststoff berühren. Legen Sie dann den Schalendeckel mit dem umgedrehten zWEDGI und die entsprechende Glasbodenschale mit dem Innenglas nach oben in einen Plasmareiniger.

Die Plasmareinigungskammer evakuieren, bis der Druck 500 Millitorr erreicht. Stellen Sie die Funkfrequenz oder HF-Leistung auf hoch ein und setzen Sie das Gerät und die Schüssel etwa zwei Minuten lang der HF-Frequenz aus. Lassen Sie dann die Kammer langsam vom Druck ab und stellen Sie das Gerät und die Schüssel wieder in eine Reinraumhaube.

Entfernen Sie das PDMS-Gerät von der Schüsselabdeckung. Drehen Sie dann das PDMS zWEDGI in die richtige Ausrichtung auf dem Glas um, indem Sie es vorsichtig auf der Mittelmulde der Glasbodenschale positionieren. Um die PDMS-Haftung auf dem Glas zu gewährleisten, üben Sie mit dem hinteren Ende der Pinzette Druck auf die winzigen Geometrien der Mikrokanäle aus und glätten Sie das PDMS zu den Rändern hin.

Drücken Sie das PDMS-Gerät leicht nach unten, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen unter dem Gerät eingeschlossen werden. Geben Sie 70% Ethanol in die Schale und spülen Sie mit einer Mikropipette die Kanäle auch durch den Rückhaltetunnel. Entfernen Sie dann das Ethanol und spülen Sie das Gerät zwei- oder dreimal mit doppelt destilliertem Wasser ab, bevor Sie es an der Luft trocknen lassen.

Füllen Sie die Kanäle mit Magermilch und inkubieren Sie das Gerät 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um das Anhaften der Larven an der Glasabdeckfolie der Schale zu minimieren. Tauchen Sie das Gerät dann mehrmals vorsichtig zum Spülen in doppelt destilliertes Wasser und lassen Sie es kopfüber an der Luft trocknen. Nach der Betäubung der Larven gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie einige Mikroliter Tricain E3, um die Kanäle des Geräts vorzubefeuchten.

Nehmen Sie mit einer Pipettenspitze mit breiter Öffnung eine einzelne Larve auf und legen Sie sie in den Ladekanal. Richten Sie dann die Larve mit einer Pipettenspitze oder einem ähnlichen Werkzeug in der Ladekammer aus, wobei die Rückenseite zum geraderen Rand der Ladekammer und der Schwanz zum Rückhaltetunnel zeigt. Ziehen Sie vorsichtig Flüssigkeit aus der Verwundungskammer heraus, damit die Larve in den Rückhaltetunnel fließen kann.

Entfernen Sie den größten Teil der Flüssigkeit, während Sie die Feuchtigkeit um die Larve herum erhalten. Die Larve muss richtig in den Rückhaltetunnel ausgerichtet werden, da der größte Teil der Flüssigkeit entfernt wird. Es muss aber ausreichend Flüssigkeit um die Larven herum verbleiben.

Die Orientierung kann nach der Agarosezugabe angepasst werden, muss aber vor dem Erstarren der Agarose erfolgen. Pipettieren Sie 1%LMP Agarose in Tricain E3 über den Kopf der Larve, füllen Sie die Ladekammer und lassen Sie Agarose erstarren, während sich die Larve in der richtigen Position befindet. Geben Sie Tricain E3 nach Bedarf in die Wundkammer, um die Hydratation aufrechtzuerhalten.

Wiederholen Sie dann diesen Ladevorgang für die verbleibenden zwei Kanäle. Entfernen Sie vorsichtig mit einer Spritzennadel die Agarose, die durch den Rückhaltetunnel in die Wundkammer gesickert ist. Für die Verwundung, die Kurzzeitbildgebung oder die Isolierung der Wundbehandlung fügen Sie mehr Tricain E3 über die Agarose hinzu.

Um die Larven in der Verwundungskammer zu verwunden, wird mit einer sterilen Skalpellklinge die Schwanzflosse hinter der Chorda durchtrennt. Fügen Sie bei Bedarf zusätzliches Tricain E3 hinzu und setzen Sie den Deckel der Kulturschale wieder auf. Installieren Sie das zWEDGI-Gerät mit anästhesierten Larven auf einem inversen Mikroskop in einem Tischeinsatz, der die 60-Millimeter-Glasbodenschale aufnehmen kann.

Platzieren Sie den Schwanz der Larven im obersten Kanal und drehen Sie die Schale nach Bedarf, um den Schwanz in die gewünschte Position zu bringen. Bilden Sie die Larve so ab, wie es für das jeweilige Experiment erforderlich ist. Nehmen Sie am Ende des Experiments die zWEDGI-Schale aus dem Mikroskop.

Nach der Entnahme der Larven und des Agars gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie Ethanol und destilliertes Wasser, um das zWEDGI wie zuvor gezeigt zu reinigen, und stellen Sie es auf den Kopf, um es an der Luft zu trocknen. Bewahren Sie das abgedeckte Gerät an einem kühlen, trockenen Ort auf. Hier sind Bilder mit Multiphotonenmikroskopie für die zweite Harmonische oder SHG-Bildgebung von Kollagenfasern in der Schwanzflosse zu sehen, um die bildgebenden Fähigkeiten des zWEDGI zu veranschaulichen.

Vor der Verwundung detektierte das SHG Kollagenfasern, die von der Chorda nach außen zur Flossenspitze strahlen. Kurz nach der Wunde vergrößert sich der Abstand zwischen der Spitze der zusammengezogenen Flosse und der Mitte der Flosse mit der Wundentspannung. Das zWEDGI ermöglicht die Erfassung dreidimensionaler Daten im Zeitverlauf und bietet so einen vollständigeren Überblick über die dynamischen Veränderungen in der Struktur der extrazellulären Matrix.

Der 3D-Charakter der Datenerfassung ermöglicht eine räumliche Rekonstruktion mit Hilfe von Rendering-Software. Diese Rekonstruktionen und die anschließenden Rotationsmöglichkeiten verdeutlichen, dass die Kontraktion und Entspannung der Flosse nicht nur in der XY-Ebene der Bildsammlung stattfindet, sondern auch in der Z-Achse, da sich der Schwanz von der Aufwärtskrümmung des zusammengezogenen Zustands abflacht. Sobald die wiederverwendbaren Formen gedruckt sind, kann die Herstellungstechnik in drei bis vier Stunden durchgeführt werden.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, vor dem Aushärten sicherzustellen, dass keine Luftblasen im PDMS eingeschlossen sind, und die Geräte lange genug auszuhärten, bevor Sie versuchen, sie aus den Formen zu entfernen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die lokalisierte Wirkstoffapplikation, die Antikörpermarkierung oder die RNA- und Proteinreinigung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie sich das Vorhandensein von Medikamenten oder Inhibitoren auf die Wundheilung auswirkt. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Wundheilung, um die Kollagendynamik, die Immunzellantwort und das Nachwachsen des Gewebes in den Zebrafischlarven zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein zWEDGI herstellt und es für die Verwundung und Live-Bildgebung von Zebrafischlarven verwendet. Vergessen Sie nicht, dass Photopolymer-3D-Druckharze für den Menschen gefährlich und für Zebrafische giftig sind. Es müssen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. das Tragen von Handschuhen und die Verwendung einer Gesichtsmaske beim Umgang mit nicht ausgehärteten 3D-gedruckten Teilen und das Sicherstellen, dass das gesamte auf den Drucken verbleibende Harz ausgehärtet ist, bevor versucht wird, die Formen mit PDMS zu füllen.