Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns, lokal Steuerfläche Haftfähigkeit: eine Methode, um direkte Chondrogenic Differenzierung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, großskalige Dendrimer-basierte ungleichmäßige Nanomuster zu erhalten, die eine nanoskalige Kontrolle der lokalen Oberflächenadhäsion ermöglichen. Die beschriebene Methode wird zur Untersuchung der Zelladhäsion und chondrogenen Differenzierung eingesetzt. Dendrimer-erhöhte Nanomuster ermöglichen die lokale Kontrolle der Oberflächenadhäsion auf der Nanoskala.

Polynanomere der ersten Generation, die mit dem zelladhäsiven RGD-Peptid modifiziert wurden, werden verwendet, um Nanomuster zu erzeugen. Sie zeichnen sich durch Scan-per-Mikroskopie-Techniken aus und werden in Zelladhäsions- und Differenzierungsstudien eingesetzt. Anschließend analysieren wir die Ergebnisse aus der Mikroskopie und Immunfärbetechniken.

Der erste Schritt besteht darin, die Arbeitssubstrate vorzubereiten. Kundenspezifische quadratische Glasobjektträger werden hergestellt, indem Mikroskopie-Objektträger mit einem diamantbestückten Cutter geschnitten werden. Machen Sie Objektträger mit einer Größe von 1,25 x 1,25 Zentimetern.

Waschen Sie die Rutschen mit entionisiertem Wasser, gefolgt von 96% Ethanol und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Bereiten Sie die 2%ige PLLA-Lösung vor, indem Sie 200 Milligramm PLLA in ein Druckrohr geben und 10 Milliliter Dioxan hinzufügen. Fügen Sie einen Rührstab hinzu und verschließen Sie die Tube fest.

Erwärmen Sie die Mischung in einem Glyzerinbad bei 60 Grad Celsius für 24 Stunden unter leichtem Rühren. Legen Sie die Objektträger in ein Glasfläschchen mit der PLLA-Lösung auf einer sauberen, heißen Platte bei 60 Grad Celsius. Warten Sie mindestens 10 Minuten, um die erforderliche Temperatur zu erreichen.

Beschichten Sie die Glassubstrate mit der PLLA-Lösung, indem Sie den Objektträger auf die Schleuderbeschichtungsstufe legen und das ausgewählte Programm ausführen. Wir wählen 3.000 U/min für 30 Sekunden mit einer Beschleunigung von 1.500 U/min pro Sekunde mit einem Vorschritt von 500 U/min bei fünf Sekunden bei 300 U/min, um eine homogene Beschichtung zu gewährleisten. Schleuderbeschichtete Gläser können im Kühlschrank aufbewahrt werden.

Bereiten Sie Lösung A vor und beschallen Sie sie für 10 Minuten mit einer Dosis von 0,77 Milligramm pro Milliliter RGD-Cys-D1-Dendrimer in deionisiertem Wasser. Bereiten Sie dann Dendrimerlösungen von 10 zu 2% bzw. 10 zu 5%Lösung B bzw. C in deionisiertem Wasser vor. Lösung C 10 Minuten lang beschallen und die folgenden Dendrimerlösungen D, E und F ebenfalls in deionisiertem Wasser herstellen.

Lösung D, 2,5x10 auf 8%Lösung E, 10 auf 8%und Lösung F, 4 10 auf 9%Diese Lösungen bis zur Verwendung im Kühlschrank aufbewahren. Sie schließen mit einer UV-Lampe der Zellkulturkabine 18 PLLA-beschichtete Gläser für 13 Minuten ab, um sie steril zu machen. Beschallen Sie jede der Dendrimerlösungen 10 Minuten lang.

Filtern Sie die Dendrimerlösungen durch Filter mit einem Durchmesser von 0,22 Mikrometern auf den PLLA-beschichteten Glasobjektträgern in einer 12-Well-Platte unter der laminaren Strömung der Zellkulturkabine. Lassen Sie sie 16 Stunden lang bei Raumtemperatur in der Kabine und waschen Sie sie mit sterilem, entionisiertem Wasser. Für die Positivkontrollproben wird eine sterile Fibronektinlösung in PBS hergestellt und die Repliken mit der Lösung eine Stunde lang bei Raumtemperatur in der Zellkulturkabine inkubiert.

Waschen Sie sie mit PBS. Die restlichen drei PLLA-beschichteten Substrate dienen als Nachbildungen für die Negativkontrolle. Die Nanomuster-Topographie wird mit einem Rasterkraftmikroskop analysiert, das im Abklopfmodus an der Luft betrieben wird.

Montieren Sie einen Silizium-Ausleger mit einer Federkonstante von 40 Newton pro Meter und einer Resonanzfrequenz von 300 Kilohertz in den AFM-Spitzenhalter. Mit dem Nanostruktursubstrat auf dem AFM-Tisch nähern Sie sich der Oberfläche bis zum Kontakt und wählen Sie einen Amplitudensollwert, der es ermöglicht, die Dendrimerkonfiguration abzubilden, ohne übermäßigen Druck auf die Oberfläche auszuüben. Registrieren Sie mindestens drei repräsentative Bilder von 5 x 5 Mikrometern pro Substrat und drei unabhängigen Substraten pro Bedingung.

Bearbeiten Sie die aufgenommenen Bilder mit der AFM-Verarbeitungssoftware. Wählen Sie Dendrimere auf den verarbeiteten AFM-Höhenbildern aus und erhalten Sie die entsprechenden Bildschwellenwerte. Ermitteln Sie die Partikelgenauigkeiten, und verwenden Sie sie, um die minimalen Abstände zwischen den Partikeln zu erhalten.

Seien die minimalen Partikelabstände in Z auf die entsprechenden Partikelgenauigkeiten festgelegt, um die Wahrscheinlichkeitssteuerungsstecker für die minimalen Partikelabstände zu erhalten. Passen Sie die Farbskala des Diagramms an, um die Bereiche zu visualisieren, in denen die lokale RGD-Oberflächendichte unter 70 Nanometern liegt. Quantifizieren Sie den Bereich dieser Bereiche, indem Sie sie im Bild auswählen und einen Schwellenwert generieren.

Verwenden Sie kommerzielles humanes Fett, das aus mesenchymalen Stammzellen aus frühen Passagen gewonnen wurde, vorzugsweise unter fünf. Kultivieren Sie sie bei 37 Grad und 4,6 % CO2-Atmosphäre im Stammzellwachstumsmedium, bis eine Konfluenz von 70 oder 80 % erreicht ist. Aussaat der Zellen mit einer Zelldichte von 3.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf den Substraten in einem Chondrogenese-induzierenden Medium.

Wechseln Sie das Medium alle drei Tage. Der Kondensationsschritt kann vom ersten Tag in der Kultur an beobachtet werden, und seine Entwicklung kann mit einem optischen Phasenkontrastmikroskop in allen Kulturlabors verfolgt werden. Fixieren Sie die Zellen 20 Minuten lang mit 10%iger Formalinlösung bei Raumtemperatur und waschen Sie sie dann mit PBS.

Sperren Sie die Furaldehydgruppen, indem Sie eine 50 millimolare Lösung von Ammoniumchlorid in PBS hinzufügen. 20 Minuten bei Raumtemperatur ziehen lassen. Mit PBS waschen.

Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1% Lösung von Saponin in der Blockierungslösung von 1% Albumin in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie mit Primärantikörpern in der Blockierungslösung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Mit PBS waschen.

Inkubieren Sie mit Sekundärantikörpern in der Blockierungslösung für eine Stunde bei Raumtemperatur, wobei Lichteinwirkung zu vermeiden ist. Mit PBS waschen und trocknen. Tragen Sie Mikroskopie-Eindeckmittel auf die Proben auf und decken Sie sie vorsichtig mit Deckgläsern ab.

Bilden Sie die immungefärbten Proben für das fokale Adhäsionsprotein Paxillin nach einem Tag chondrogener Induktion und für den frühen chondrogenen Marker Kollagen II alpha I nach fünf Tagen chondrogener Induktion mit einem aufrechten konfokalen Mikroskop ab. Erfassen Sie Schnitte in einem repräsentativen Intervall, z. B. 0,5 oder 1 Mikrometer. Filtern Sie die auf Paxillin gefärbten Bilder aus der basalen Zone von Zellkondensaten.

Entfernen Sie den Hintergrund, glätten Sie ihn und konvertieren Sie ihn in Acht-Bit-Dateien. Machen Sie sie binär, indem Sie einen empirisch ausgewählten Schwellenwert festlegen. Behandeln Sie mindestens drei Zellkondensate pro Bedingung von drei unabhängigen Proben.

Quantifizieren Sie die ausgewählten Bereiche und drücken Sie sie als den entsprechenden Prozentsatz der Fläche geteilt durch die Anzahl der Zellkerne im Bild aus. Um die Kollagen-II-alpha-I-Färbung zu quantifizieren, erstellen Sie konfokale Z-Projektionen. Filtern Sie die resultierenden Bilder, entfernen Sie den Hintergrund, glätten Sie sie und legen Sie einen Schwellenwert fest.

Quantifizieren Sie die Summe der projizierten Fläche, der maximalen Kollagen-II-alpha-I-Fläche pro Probe im Vergleich zur Fläche des entsprechenden Zellkondensats. Es können verschiedene Nanomusterkonfigurationen erhalten werden, die die anfängliche Dendrimerkonzentration in Lösung modifizieren. Nanomuster können durch AFM-Analyse und Wahrscheinlichkeitskonturdiagramme für den konstruierten minimalen Abstand zwischen den Partikeln visualisiert werden.

Sie heben die Bereiche auf der Oberfläche mit der höchsten lokalen RGD-Oberflächendichte hervor. Dendrimer-Nanomuster werden in Zelladhäsionsstudien verwendet. Die Adhäsion nimmt mit der lokalen RGD-Oberflächendichte zu.

Für die Positivkontrolle und Oberflächen, die Dendrimeraggregate enthalten, geht diese Korrelation verloren. Der Einfluss der lokalen RGD-Oberflächendichte wurde in der Chondrogenese getestet, sowohl die Zellkondensation als auch die Differenzierung werden durch Nanomuster begünstigt, die eine intermediäre Adhäsivität aufweisen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Dendrimer-basiertes Nanomuster in einer Drei-Tabellen-Methode den Einfluss der lokalen RGD-Dichte auf die Zellantwort untersucht.

Nanomuster halten die Zelladhäsion an der entsprechenden homogenen Oberfläche, die üblicherweise in Zellkulturen verwendet wird, effizienter aufrecht. In Differenzierungsexperimenten begünstigte die intermediäre Adhäsion der Zellen am Substrat die mesenchymale Zellkondensation und die frühe chrondogene Differenzierung. Aufgrund der einfachen Modifikation des peripheren Dendrimerwachstums kann die hier beschriebene Methode auf alle überschüssigen rheumatischen Schichten ausgedehnt werden, die Dichteeffekte auf Zellen haben.