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Advanced Biology

Der TUNEL-Assay

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Cell Biology

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The TUNEL Assay

4.12: Detecting Reactive Oxygen Species

4.15: Annexin V and Propidium Iodide Labeling

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08:12 min

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April 30, 2023

Overview

Eines der Markenzeichen der Apoptose ist die nukleare DNA-Fragmentierung durch Nukleasen. Diese Enzyme werden durch Caspasen, die Familie der Proteine aktiviert, die die Zell-Tod-Programm ausführen. TUNEL-Test ist eine Methode, die nutzt diese Funktion um Apoptotic Zellen zu erkennen. In diesem Test katalysiert ein Enzym namens terminal Deoxynucleotidyl Transferase die Zugabe von dUTP Nukleotide an den freien 3′ Enden des fragmentierten DNA. Mithilfe von dUTPs, die gekennzeichnet sind mit chemischen Tags, die Fluoreszenz oder Farbe produzieren können, können apoptotische Zellen gezielt identifiziert werden.

Jupiters Video auf der TUNEL-Test beginnt indem wir diskutieren, wie diese Technik verwendet werden kann, um Apoptotic Zellen zu erkennen. Dann gehen wir durch ein allgemeines Protokoll für TUNEL-Assays auf Gewebeschnitte und Visualisierung der Ergebnisse mit Fluoreszenz-Mikroskopie. Schließlich werden mehrere Anwendungen des Assays in die aktuelle Forschung abgedeckt werden.

Procedure

Der TUNEL-Test wird am häufigsten verwendet, um Zellen Apoptose, die eine Form des programmierten Zelltods ist zu erkennen. Apoptose ist ein wichtiger biologischer Prozess, während der Entwicklung und für die Aufrechterhaltung der Homöostase der Gewebe. TUNEL Färbung ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der Apoptotic Zellen. Dies hilft Wissenschaftlern Wirksamkeit neuer Behandlungsmethoden für Krankheiten zu testen, in denen Apoptose entweder gehemmt wird, wie bei Krebs, oder verbessert, wie in Neurodegeneration.

Dieses Video erklärt, wie der TUNEL-Test verwendet werden kann, um Zellen Apoptose, eine Schritt für Schritt Protokoll zur Durchführung dieses Verfahrens in Gewebeschnitten, bezeichnen und wie Forscher diese Technik, um die Mechanismen des Zelltods, anwenden.

Vor dem Eintauchen in das Protokoll den TUNEL-Assay, sprechen wir über die Prinzipien, die hinter dieser Technik.

Eines der vielen Kennzeichen Merkmale der Apoptose ist DNA-Fragmentierung. Wie tritt DNA-Fragmentierung? Apoptose erfolgt durch Enzyme genannt Caspasen in das Zytosol vorhanden. Ihre Hauptaufgabe ist die Proteine zu Spalten, um die Zelle zu demontieren. Darüber hinaus Caspasen aktiviert ein Enzym, genannt Caspase aktivierte DNase, CAD, durch lösen sie aus ihrer Inhibitor — ICAD. Aktivierte CAD ist eine Endonuklease, die Reisen in den Zellkern und bindet sich chromosomalen DNA.

Spaltung von DNA bewirkt letztlich Anhäufung von DNA-Fragmenten mit geklaut enden, und die TUNEL-Assay Eindringmittel Etiketten diese Enden der fragmentierten DNA, so dass Wissenschaftler um Apoptose zu erkennen eingekerbt. Aber wie kommt es dazu? Dafür müssen Sie die TUNEL-Reaktion zu verstehen. TUNEL steht für terminal Deoxynucleotidyl Transferase-vermittelten dUTP Nick-End bezeichnen. Die zwei wichtigsten TUNEL Reagenzien sind terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT, und Deoxyuridine Triphosphat oder dUTP, die zur leichteren Erkennung Eindringmittel beschriftet werden kann.

Um die TUNEL Reaktion verstehen, gehen Sie wir zurück zu den apoptotischen Zellen mit DNA-Fragmente. Diese Fragmente geklaut haben freie 3 ‘-Hydroxyl-Gruppen. Nach dem Hinzufügen der TUNEL Reagenzien zu einer Probe mit Apoptotic Zellen legen das Eindringmittel beschrifteten dUTPs auf diese 3 ‘-Hydroxyl-Gruppen mit Hilfe des Enzyms Katalysator TdT. Die Zellen befleckt mit diesem Verfahren werden TUNEL-positiven Zellen, genannt, die dann mit Fluoreszenz-Mikroskopie visualisiert werden können.

Nun, Sie die grundlegenden Prinzipien und Konzepte, die hinter der TUNEL-Test verstehen, lassen Sie uns beschreiben ein allgemeines Protokoll für die Durchführung dieser Technik in Gewebeschnitten. Die wichtigsten Schritte der TUNEL-Test gehören Fixierung des Gewebes von Interesse, Permeabilisierung der Gewebe, Hinzufügen von TUNEL Reagenzien, stoppen die TUNEL-Reaktion, und schließlich die Analyse.

Erstens ist das Gewebe des Interesses festzusetzen, um biologische Strukturen zu bewahren. Fixierung durch Vernetzung Proteine in den Zellen funktioniert. Zum TUNEL-Test können Gewebe fixiert werden, indem sie zu einer Lösung mit 4 % Paraformaldehyd für 4-24 Stunden bei 4° c Nach der Fixierung, Cryosection Gewebe in dünne Scheiben von 10 µm oder weniger.

Der nächste Schritt ist Permeabilisierung, die Reagenzien wie das TdT-Enzym ermöglicht, den Zellkern einzudringen. Permeabilisierung der Gewebeschnitte kann erfolgen, indem das Gewebe zu Proteinase K-Lösung für 5 – 15 Minuten bei 37° C. Spülen Sie Gewebeschnitte mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung auf einem Orbitalschüttler für 15 – 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach Permeabilisierung TdT Enzym und Gewebekulturen beschrifteten dUTPs dazu Gewebeschnitte, zusammen mit einer Kennzeichnung Puffer, enthält Kobalt, das fungiert als Cofaktor für die Reaktion von TUNEL. Zusammen, sind das Reaktionsgemisch TUNEL Abschnitt Gewebe für 1 – 3 Stunden bei 37° C inkubiert und geschützt vor Licht, Fluoreszenz vor dem Ausbleichen zu verhindern.

Nach Inkubation Stop-Puffer wird zum Abschnitt Gewebe um die TUNEL-Reaktion nicht mehr hinzugefügt, und nach einer kurzen Inkubationszeit der Abschnitte werden gewaschen, mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung. Zu guter Letzt werden Gewebeschnitte gebeizt mit Gewebekulturen tagged dUTP visualisiert mit Fluoreszenz-Mikroskopie und bewertet für die Lokalisierung von TUNEL positive Zellen in einem bestimmten Gewebe. Man kann Zelltod quantifizieren, einfach durch zählen den Anteil der TUNEL positive Zellen in einem bestimmten Gewebe-Abschnitt.

Nun, da Sie wie den TUNEL-Test um Apoptotic Zellen erkennen durchgeführt gesehen haben, lassen Sie uns besprechen, wie dieser Assay verwendet werden kann, von Zellbiologen gestellte Fragen anzusprechen.

Zelltod tritt als ein normaler Bestandteil der Entwicklung für die Formung von Geweben und Strukturen und für die Beseitigung von unnötigen Zellen. Daher interessieren sich Wissenschaftler dieses Phänomen-Studie die Auswirkungen der pränatalen Exposition gegenüber verschiedenen Substanzen auf Apoptose während der Entwicklung. Hier interessierte Wissenschaftler untersuchen die Wirkung von Alkohol pränatale Exposition auf die Entwicklung des Gehirns. Die Ergebnisse der TUNEL Färbung durchgeführt auf fetale Gehirn ergab erhöhte Apoptose in Geweben, die Alkohol, im Vergleich zu Kontrolltieren pränatal ausgesetzt waren.

Wissenschaftler nutzen auch den TUNEL-Test, um Apoptose in Reaktion auf eine bakterielle Infektion zu untersuchen. In diesem Experiment entwickelten Wissenschaftler ein Modell der Lungenentzündung durch die Injektion von Mäusen mit Pseudomonas Aeruginosa, die Lungenentzündung induziert. Dann Lungengewebe entfernt wurde und TUNEL Färbung wurde durchgeführt, um Apoptose als Reaktion auf die bakterielle Infektion zu untersuchen. Ergebnisse zeigen, dass apoptotischen Zelltod bei Mäusen ausgesetzt, die Bakterien im Vergleich zu Kontrolltieren erhöht.

Zu guter Letzt TUNEL Färbung auf menschliche Tumorproben einsetzbar um Tumor Reaktion auf Medikamente zu bestimmen. In diesem Beispiel wurden Tumorproben von menschlichen Patienten geerntet und ex Vivo kultiviert. Sie waren als nächstes mit der präklinischen Medikamenten behandelt und für eine Antwort mit der TUNEL-Test bewertet. Gewonnenen Daten zeigen, dass die Behandlung mit einem Medikament, das Hitze-Schock-Protein 90 deutlich hemmt Apoptose im Tumorgewebe erhöht.

Sie sah nur Jupiters Video über die Verwendung des TUNEL-Tests, um Zellen Apoptose zu erkennen. Dieses Video überprüft die Prinzipien hinter TUNEL Färbung und eine Schritt für Schritt Protokoll den TUNEL-Test auf Gewebeschnitte durchführen. Wir überprüfen auch, wie diese Methode angewendet werden könnte, um den programmierten Zelltod während der Entwicklung und Krankheit zu verstehen. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

Transcript

The TUNEL assay is most commonly used to detect cells undergoing apoptosis, which is a form of programmed cell death. Apoptosis is an important biological process during development, and for maintaining tissue homeostasis. TUNEL staining allows for visualization and quantification of apoptotic cells. This helps scientists test efficacy of new treatments for disorders in which apoptosis is either inhibited, like in cancer, or enhanced, as in neurodegeneration.

This video will explain how the TUNEL assay can be used to label cells undergoing apoptosis, a step-by-step protocol for performing this method in tissue sections, and how researchers are applying this technique to understand mechanisms of cell death.

Before delving into the protocol of the TUNEL assay, let’s discuss the principles behind this technique.

One of the many hallmark characteristics of apoptosis is DNA fragmentation. How does DNA fragmentation occur? Apoptosis is carried out by enzymes called caspases present in the cytosol. Their primary role is to cleave proteins in order to dismantle the cell. In addition, caspases activate an enzyme called caspase-activated DNase, or CAD, by detaching it from its inhibitor—ICAD. Activated CAD is an endonuclease that travels to the nucleus and cleaves chromosomal DNA.

Cleavage of DNA ultimately causes accumulation of DNA fragments with nicked ends, and the TUNEL assay fluorescently labels these nicked ends of fragmented DNA, allowing scientists to detect apoptosis. But how does this happen? For that you have to understand the TUNEL reaction. TUNEL stands for terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling. The two main TUNEL reagents are terminal deoxynucleotidyl transferase, or TdT, and deoxyuridine triphosphate, or dUTP, which may be fluorescently labeled for ease of detection.

In order to understand the TUNEL reaction, let’s go back to the apoptotic cells with DNA fragments. These nicked fragments have free 3′ hydroxyl groups. Once you add the TUNEL reagents to a sample containing apoptotic cells, the fluorescently labeled dUTPs attach to these 3′ hydroxyl groups with the help of the catalyst enzyme TdT. The cells stained using this procedure are called TUNEL positive cells, which can then be visualized using fluorescence microscopy.

Now that you understand the basic principles and concepts behind the TUNEL assay, let’s outline a general protocol for performing this technique in tissue sections. The major steps of the TUNEL assay include fixing the tissue of interest, permeabilization of the tissue, adding TUNEL reagents, stopping the TUNEL reaction, and finally the analysis.

First, the tissue of interest must be fixed in order to preserve biological structures. Fixation works by crosslinking proteins within cells. For the TUNEL assay, tissues can be fixed by adding them to a solution containing 4% paraformaldehyde for 4–24 hours at 4°C. After fixation, cryosection the tissue into thin slices of 10 µm or less.

The next step is permeabilization, which allows for reagents such as the TdT enzyme to penetrate the cell nucleus. Permeabilization of tissue sections can be performed by adding the tissue to proteinase K solution for 5–15 minutes at 37°C. Rinse tissue sections with phosphate buffered saline on an orbital shaker for 15–30 minutes at room temperature.

Following permeabilization, the TdT enzyme and fluorescently labeled dUTPs are added to the tissue sections, along with a labeling buffer containing cobalt that acts as a cofactor for the TUNEL reaction. Together, the TUNEL reaction mixture and the tissue section are incubated for 1–3 hours at 37°C, and protected from light to prevent the fluorescence from fading.

Following incubation, stop buffer is added to the tissue section to cease the TUNEL reaction, and after a short incubation the sections are washed with phosphate buffered saline. Finally, tissue sections stained using fluorescently tagged dUTP are visualized using fluorescence microscopy, and assessed for localization of TUNEL positive cells within a given tissue. One can quantify cell death simply by counting the percentage of TUNEL positive cells in a given tissue section.

Now that you’ve seen how to perform the TUNEL assay to detect apoptotic cells, let’s discuss how this assay can be used to address questions asked by cell biologists.

Cell death occurs as a normal part of development for the sculpting of tissues and structures, and for the elimination of unnecessary cells. Therefore, scientists interested in this phenomenon study the effect of prenatal exposure to different substances on apoptosis during development. Here, scientists were interested in examining the effect of prenatal alcohol exposure on brain development. The results of TUNEL staining performed on fetal brains revealed increased apoptosis in tissues that were prenatally exposed to alcohol, as compared to control animals.

Scientists also use the TUNEL assay to investigate apoptosis in response to bacterial infection. In this experiment, scientists developed a model of pneumonia by injecting mice with Pseudomonas aeruginosa, which induces lung inflammation. Then, lung tissue was removed and TUNEL staining was performed to examine apoptosis in response to the bacterial infection. Results show that apoptotic cell death increased in mice exposed to the bacteria, as compared to control animals.

Lastly, TUNEL staining can be used on human tumor samples, in order to determine tumor responsiveness to drugs. In this example, tumor samples were harvested from human patients and cultured ex vivo. Next, they were treated with pre-clinical drugs and assessed for a response using the TUNEL assay. Data obtained show that treatment with a drug that inhibits heat shock protein 90 significantly increases apoptosis in tumor tissue.

You’ve just watched JoVE’s video on using the TUNEL assay to detect cells undergoing apoptosis. This video reviewed the principles behind TUNEL staining, and a step-by-step protocol to perform the TUNEL assay on tissue sections. We also reviewed how this method could be applied to understand programmed cell death during development and disease. As always, thanks for watching!

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