4.14: Der TUNEL-Assay

Der TUNEL-Assay wird am häufigsten verwendet, um Zellen nachzuweisen, die sich in der Apoptose befinden, einer Form des programmierten Zelltods. Apoptose ist ein wichtiger biologischer Prozess während der Entwicklung und zur Aufrechterhaltung der Homöostase des Gewebes. Die TUNEL-Färbung ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung apoptotischer Zellen. Dies hilft den Wissenschaftlern, die Wirksamkeit neuer Behandlungen für Erkrankungen zu testen, bei denen die Apoptose entweder gehemmt ist, wie bei Krebs, oder verstärkt wird, wie bei der Neurodegeneration.

In diesem Video wird erklärt, wie der TUNEL-Assay zur Markierung von Zellen verwendet werden kann, die sich einer Apoptose unterziehen, ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Durchführung dieser Methode in Gewebeschnitten, und wie Forscher diese Technik anwenden, um die Mechanismen des Zelltods zu verstehen.

Bevor wir uns mit dem Protokoll des TUNEL-Assays befassen, wollen wir die Prinzipien hinter dieser Technik besprechen.

Eines der vielen charakteristischen Merkmale der Apoptose ist die DNA-Fragmentierung. Wie kommt es zur DNA-Fragmentierung? Die Apoptose wird durch Enzyme durchgeführt, die Caspasen genannt werden, die im Zytosol vorhanden sind. Ihre Hauptaufgabe besteht darin, Proteine zu spalten, um die Zelle zu zerlegen. Darüber hinaus aktivieren Caspasen ein Enzym namens Caspase-aktivierte DNase oder CAD, indem sie es von seinem Inhibitor lösen? ICAD. Aktiviertes CAD ist eine Endonuklease, die in den Zellkern gelangt und chromosomale DNA spaltet.

Die Spaltung der DNA führt schließlich zu einer Anhäufung von DNA-Fragmenten mit eingekerbten Enden, und der TUNEL-Assay markiert diese eingekerbten Enden der fragmentierten DNA fluoreszierend, was es den Wissenschaftlern ermöglicht, Apoptose nachzuweisen. Doch wie kommt es dazu? Dafür muss man die TUNEL-Reaktion verstehen. TUNEL steht für terminale Desoxynukleotidyltransferase-vermittelte dUTP-Nick-End-Markierung. Die beiden wichtigsten TUNEL-Reagenzien sind die terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) und Desoxyuridintriphosphat (dUTP), die zur Erleichterung des Nachweises fluoreszenzmarkiert werden können.

Um die TUNEL-Reaktion zu verstehen, gehen wir zurück zu den apoptotischen Zellen mit DNA-Fragmenten. Diese geknickten Fragmente haben freie 3? Hydroxylgruppen. Sobald Sie die TUNEL-Reagenzien zu einer Probe hinzufügen, die apoptotische Zellen enthält, binden die fluoreszenzmarkierten dUTPs an diese 3? Hydroxylgruppen mit Hilfe des Katalysatorenzyms TdT. Die mit diesem Verfahren gefärbten Zellen werden TUNEL-positive Zellen genannt, die dann mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden können.

Nachdem Sie nun die grundlegenden Prinzipien und Konzepte hinter dem TUNEL-Assay verstanden haben, lassen Sie uns ein allgemeines Protokoll für die Durchführung dieser Technik in Gewebeschnitten skizzieren. Zu den wichtigsten Schritten des TUNEL-Assays gehören die Fixierung des interessierenden Gewebes, die Permeabilisierung des Gewebes, die Zugabe von TUNEL-Reagenzien, das Stoppen der TUNEL-Reaktion und schließlich die Analyse.

Zunächst muss das interessierende Gewebe fixiert werden, um biologische Strukturen zu erhalten. Die Fixierung funktioniert durch die Vernetzung von Proteinen innerhalb der Zellen. Für den TUNEL-Assay können Gewebe fixiert werden, indem sie 4 bis 24 Stunden lang bei 4 °C in eine Lösung mit 4 % Paraformaldehyd gegeben werden. Nach der Fixierung kryosektionieren Sie das Gewebe in dünne Scheiben von 10 μm oder weniger.

Der nächste Schritt ist die Permeabilisierung, die es Reagenzien wie dem TdT-Enzym ermöglicht, in den Zellkern einzudringen. Die Permeabilisierung von Gewebeschnitten kann durchgeführt werden, indem das Gewebe für 5-15 Minuten bei 37 °C in Proteinase-K-Lösung gegeben wird. Spülen Sie die Gewebeschnitte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf einem Orbitalschüttler für 15-30 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach der Permeabilisierung werden das TdT-Enzym und fluoreszenzmarkierte dUTPs zusammen mit einem kobalthaltigen Markierungspuffer zu den Gewebeschnitten hinzugefügt, der als Cofaktor für die TUNEL-Reaktion fungiert. Zusammen werden das TUNEL-Reaktionsgemisch und der Gewebeschnitt 1-3 Stunden lang bei 37? C und vor Licht geschützt, um ein Verblassen der Fluoreszenz zu verhindern.

Nach der Inkubation wird dem Gewebeschnitt Stopppuffer zugesetzt, um die TUNEL-Reaktion zu stoppen, und nach einer kurzen Inkubation werden die Schnitte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Schließlich werden Gewebeschnitte, die mit fluoreszenzmarkierten dUTP gefärbt wurden, mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht und auf die Lokalisierung von TUNEL-positiven Zellen in einem bestimmten Gewebe untersucht. Man kann den Zelltod einfach quantifizieren, indem man den Prozentsatz der TUNEL-positiven Zellen in einem bestimmten Gewebeschnitt zählt.

Nachdem Sie nun gesehen haben, wie Sie den TUNEL-Assay zum Nachweis apoptotischer Zellen durchführen, wollen wir nun besprechen, wie dieser Assay verwendet werden kann, um Fragen von Zellbiologen zu beantworten.

Der Zelltod ist ein normaler Teil der Entwicklung, um Gewebe und Strukturen zu formen und unnötige Zellen zu eliminieren. Daher untersuchen Wissenschaftler, die sich für dieses Phänomen interessieren, die Auswirkungen der pränatalen Exposition gegenüber verschiedenen Substanzen auf die Apoptose während der Entwicklung. Hier interessierten sich die Wissenschaftler für die Untersuchung der Auswirkungen einer pränatalen Alkoholexposition auf die Entwicklung des Gehirns. Die Ergebnisse der TUNEL-Färbung, die an fetalen Gehirnen durchgeführt wurde, zeigten eine erhöhte Apoptose in Geweben, die pränatal Alkohol ausgesetzt waren, im Vergleich zu Kontrolltieren.

Wissenschaftler verwenden den TUNEL-Assay auch, um die Apoptose als Reaktion auf eine bakterielle Infektion zu untersuchen. In diesem Experiment entwickelten die Wissenschaftler ein Modell der Lungenentzündung, indem sie Mäusen Pseudomonas aeruginosa injizierten, das eine Lungenentzündung auslöst. Dann wurde Lungengewebe entfernt und eine TUNEL-Färbung durchgeführt, um die Apoptose als Reaktion auf die bakterielle Infektion zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass der apoptotische Zelltod bei Mäusen, die den Bakterien ausgesetzt waren, im Vergleich zu Kontrolltieren zunahm.

Schließlich kann die TUNEL-Färbung an menschlichen Tumorproben verwendet werden, um das Ansprechen des Tumors auf Medikamente zu bestimmen. In diesem Beispiel wurden Tumorproben von menschlichen Patienten entnommen und ex vivo kultiviert. Anschließend wurden sie mit präklinischen Medikamenten behandelt und mit dem TUNEL-Assay auf ein Ansprechen untersucht. Die erhaltenen Daten zeigen, dass die Behandlung mit einem Medikament, das das Hitzeschockprotein 90 hemmt, die Apoptose im Tumorgewebe signifikant erhöht.

Sie haben gerade das Video von JoVE über die Verwendung des TUNEL-Assays zum Nachweis von Zellen gesehen, die sich einer Apoptose unterziehen. In diesem Video werden die Prinzipien der TUNEL-Färbung und ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung des TUNEL-Assays an Gewebeschnitten vorgestellt. Wir haben auch untersucht, wie diese Methode angewendet werden kann, um den programmierten Zelltod während der Entwicklung und Krankheit zu verstehen. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!