Eine In Vivo Duo-Farbe-Methode für Imaging-vaskuläre Dynamik nach Contusive Spinal Cord Injury

Das übergeordnete Ziel dieses in vivo Duo-Farben-Zwei-Photonen-Bildgebungsverfahrens ist es, die akuten dynamischen Veränderungen der spinalen Gefäße zu überwachen, die nach einer kontusiven Rückenmarksverletzung auftreten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen darüber zu beantworten, wie sich diese dynamischen Gefäßveränderungen auf den pathologischen Verlauf und die funktionellen Defizite auswirken, die nach einer Querschnittlähmung auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen Techniken mit promodernen Proben besteht darin, dass sie einen Beweis für die akute Gefäßdynamik einer Rückenmarksverletzung bei einem lebenden Tier liefert.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Behandlung von Rückenmarksverletzungen, da diese Methode es uns ermöglicht, potenzielle neuroprotektive Strategien zu untersuchen, die auf eine frühe Gefäßreparatur abzielen. Wir hatten die Idee zu diesem Duo-Farb-Bildgebungsverfahren, als wir feststellten, dass die sequentielle Injektion von kontrastierenden Fluoreszenzfarben es uns ermöglicht, gestörte Gefäße nach einer Rückenmarksverletzung sichtbar zu machen. Vor Beginn des Eingriffs ist das angemessene Maß an Sedierung durch mangelndes Ansprechen auf das Zehenkneifen einer sechs Wochen alten weiblichen Sprague-Dawley-Ratte zu bestätigen, gefolgt von einer subkutanen Injektion einer Analgesie und eines entzündungshemmenden Mittels.

Rasieren Sie die Ratte im Bereich der Halswirbelsäule und im Halsbereich auf der Brustseite des Tieres und tupfen Sie die exponierte Haut mit einem chirurgischen Betadine-Peeling und 70%igen Alkoholtupfern ab. Tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf und legen Sie die Ratte in Rückenlage auf eine sterile chirurgische Unterlage auf ein 37 Grad Celsius heißes Heizkissen unter einem sterilen Mikroskop. Finde den Pulspunkt in der Nähe des Schlüsselbeins, um die Vena jugularis externa zu lokalisieren, und mache mit einer kleinen sterilen Federschere einen vertikalen Schnitt am Schnittpunkt des Schwanzastes des rechten Unterkiefers, des Tuberculus major des Humerus und des Manubriums.

Verwenden Sie die Federschere und eine feine Pinzette, um das Jugulargefäß zu isolieren, und verwenden Sie eine sterile chirurgische Nahtleitung, um das distale Ende des Gefäßes zu ligieren. Verwenden Sie als Nächstes eine Mikroschere, um einen kleinen Schnitt in die Gefäßwand zu machen, und schieben Sie einen speziellen Katheter aus einer 21-Gauge-Nadel, die an einer mit Kochsalzlösung gefüllten Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, in das Gefäß. Wenn eine kleine Menge Blut in die Nadel gelangt, war das Einstechen erfolgreich.

Befestigen Sie die Nadel an ihren proximalen und distalen Enden. Um die Wirbelsäule zu stabilisieren, schalten Sie das Tier in die Bauchlage und schneiden Sie die Haut mit einem Skalpell Nr. 15 entlang der Mittellinie auf der gewünschten Höhe der Wirbelsäule. Lokalisieren Sie den zweiten Brustwirbel an der Spitze zwischen den Schulterblättern und zählen Sie von T2 nach oben, um den C7-Wirbel zu finden.

Präparieren Sie die Muskelschichten vom fünften bis zum siebten Halswirbel beidseitig, um die lateralen Facetten freizulegen, und machen Sie auf beiden Seiten des lateralen Wirbelknochens einen Schlitz. Schieben Sie die Edelstahlarme einer modifizierten Stabilisierungsvorrichtung unter die freiliegenden Querfacetten des Prozesses und ziehen Sie die Schrauben fest, um die Wirbelsäule zu stabilisieren. Entfernen Sie dann vorsichtig die C5- bis C7-Schichten und legen Sie ein kleines Stück mit Kochsalzlösung getränktes Gelschaum auf die freiliegende Dura Mater, um sie mit Feuchtigkeit zu versorgen.

Um das Zwei-Photonen-Bildgebungsfenster zu erstellen, platzieren Sie kleine Stücke Gelschaum in den Spalt zwischen den Muskeln und den Wirbelknochen und eine dünne Linie aus Gelschaum zwischen dem Rückenmark und den Wirbelknochen. Versiegeln Sie dann den umliegenden Muskelknochenbereich mit Gewebekleber. Der wichtigste Schritt bei der Vorbereitung eines erfolgreichen Bildgebungsfensters besteht darin, sicherzustellen, dass es keine geringfügigen Blutungen im Inneren des Fensters gibt.

Nachdem Sie den Kleber etwa fünf Minuten trocknen gelassen haben, füllen Sie eine sterile Ein-Milliliter-Spritze mit warmem 4%Agar und geben Sie eine Wand aus Agar entlang der Fensterkante. Der Agar verfestigt sich schnell und bleibt dabei flexibel. Um ein Grundbild zu erhalten, entfernen Sie zuerst den Gelschaum und fügen Sie Immersionsflüssigkeit in das Fenster ein.

Platzieren Sie das stabilisierte Tier in der Dunkelkammer des Zwei-Photonen-Mikroskops mit dem Zwei-Photonen-Bildgebungsfenster direkt unter einem Objektiv mit geringer Vergrößerung und senken Sie das Objektiv vorsichtig in das Fenster ab. Füllen Sie eine sterile Spritze von einem Milliliter mit 0,5 Millilitern frisch zubereiteter Rhodamin-B-Isothiocyanat-Dextran-Lösung und verbinden Sie die Spritze mit dem Katheter. Drücken Sie den Kolben sehr langsam, um den Farbstoff mit dem Okular abzugeben, um den interessierenden Bereich zu identifizieren, und verwenden Sie eine ladungsgekoppelte Gerätekamera, um ein wegweisendes Hellfeldbild der Oberflächenblutgefäßmuster aufzunehmen.

Öffnen Sie als Nächstes die Zwei-Photonen-Bildgebungssoftware, um die Stromversorgung einzuschalten und die geeignete Wellenlänge der Laseranregung auszuwählen. Wählen Sie dann die richtige Zwei-Photonen-Laserleistung, den richtigen HV-Pegel und den richtigen Fluoreszenzkanal aus, die dem injizierten Fluorophor-Experiment entsprechen, und bilden Sie das Gewebe durch das Bildgebungsfenster ab, um sowohl Bilder als auch Zeilenscandaten zu sammeln. Um die C7-Mittellinienprellung einzuführen, setzen Sie die Ratte auf ein Gerät des Louisville Injury System Apparatus und wählen Sie eine 0-Punkt-Einstellung.

Passen Sie dann die Gewebeverschiebung an, und klicken Sie auf Experiment ausführen, um den Aufprall auszulösen oder die Verletzung zu lösen. Legen Sie dann ein kleines Stück mit Kochsalzlösung getränkten Gelschaum auf die belichtete Dura Mater, um sie mit Feuchtigkeit zu versorgen und neue Bilder durch das Bildgebungsfenster mit denselben Bildgebungsparametern zu öffnen. Bringen Sie das Tier zurück in die dunkle Kammer und injizieren Sie 0,5 Milliliter frisch zubereitetes Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran in den Katheter.

Dann bringen Sie das Tier zurück in die dunkle Kammer des Mikroskops und erhalten Sie Bilder in beiden Fluorophorkanälen. Die Injektion von Rhodamin-Dextran-Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht die Aufnahme eines Landmark-Bildes für die Kartierung des Gefäßnetzwerks zu Studienbeginn. Nach der Entstehung einer mittelschweren C7-Mittellinien-Kontusionsverletzung erleichtert die Einführung von FITC-Dextran die Detektion der Gefäßstruktur nach verletzungsbedingtem Austreten des ersten Farbstoffs in das umgebende Parenchym.

Die Bildgebung des Gefäßes vor und nach der Verletzung ermöglicht es auch, Veränderungen des Gefäßdurchmessers und der Reaktion auf eine Verletzung zu quantifizieren sowie Änderungen der Geschwindigkeit der roten Blutkörperchen vor und nach der Verletzung durch die Gefäße zu berechnen. Zusammengenommen können diese Daten verwendet werden, um die abgebildeten Gefäße als Venen oder Arterien zu klassifizieren. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, auffällige Atemartefakte zu vermeiden und zu versuchen, kleinere Blutungen innerhalb des Bildfensters zu begrenzen.

Dieses Verfahren kann auch an transgenen Tieren durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den neurovaskulären Wechselwirkungen zu beantworten, die nach einer Rückenmarksverletzung auftreten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Überwachung akuter vaskulärer dynamischer Veränderungen nach einer kontusiven Rückenmarksverletzung bei einem lebenden Tier einsetzen können.