Site-verwiesene Immobilisierung von Knochen morphogenetische Protein 2 an feste Oberflächen durch Click-Chemie

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist die robuste und reproduzierbare Herstellung eines osteogenen Gerüsts durch ortsgerichtete und kovalente Kopplung einer neu entwickelten BMP2-Variante mittels Click-Chemie. Diese Methode kann helfen, Probleme zu überwinden, die mit den üblichen Techniken zur Behandlung der Nichtheilung von Defekten des langen Knochens verbunden sind. Absorptions- oder Verkapselungsmethoden erfordern superphysiologische Mengen an BMP2, die mehrere schwere Nebenwirkungen hervorrufen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass geringere Mengen der neu entwickelten BMP2-Variante verwendet werden, die kovalent und seitlich mit Gerüsten verbunden sind. Vermehren Sie eine einzelne Kolonie über Nacht in 50 Millilitern LB-Medium mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin bei 37 Grad Celsius. Verdünnen Sie die Übernachtkulturen von eins bis 20 in 800 Milliliter hervorragendes Brühemedium, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin.

Züchten Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius, bis eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,7 erreicht ist. Geben Sie dann Propofol L-Lycin bis zu einer Endkonzentration von 10 Millimolar hinzu. Induktion der Genexpression durch Zugabe von IPTG für eine Endkonzentration von einem Millimolar.

Züchten Sie die Kultur 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Orbitalschüttler bei 180 U/min. Nach der Inkubation wird die gesamte Kultur 30 Minuten lang bei 9.000 g zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Bakterienpellet in 30 Millilitern TBSE-Puffer erneut.

Wiegen Sie ein leeres Zentrifugenbecherglas und geben Sie das resuspendierte Pellet in das leere Becherglas. Dann zentrifugieren Sie das resuspendierte Pellet bei 6, 360 mal g für 20 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und wiegen Sie das Becherglas mit dem Pellet

Subtrahieren Sie das Gewicht des leeren Becherglases, um das Gewicht des Pellets zu berechnen. Suspendieren Sie dann das Pellet wieder in STE-Puffer. Verwenden Sie 200 Milliliter STE-Puffer pro 10 Gramm Pellet.

Die Suspension wird auf Eis beschallt, bevor sie 20 Minuten lang bei 6.360 g zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und wiegen Sie das Pellet. Nachdem Sie die Beschallungs- und Zentrifugationsschritte viermal wiederholt haben, suspendieren Sie das Pellet wieder in 100 Millilitern TBS-Puffer

Zentrifugieren Sie bei 6.360 g für 20 Minuten. Entsorgen Sie dann den Überstand und wiegen Sie das Pellet. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Nukleasepuffer mit frisch zugegebener Nuklease unter Verwendung von 10 Millilitern pro Gramm Pellet.

Die Suspension über Nacht bei Raumtemperatur auf einer Rührplatte bei 30 U/min inkubieren. Am nächsten Tag geben Sie Triton Buffer zur Suspension. Das Volumen des hinzuzufügenden Triton-Puffers entspricht einem 0,5-Volumen-Teil der Suspension.

Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Suspension 20 Minuten lang bei 6,360 g zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und wiegen Sie das Pellet. Als nächstes suspendieren Sie das Pellet wieder in TE Buffer mit acht Millilitern pro Gramm Pellet.

Nach dem Zentrifugieren wie zuvor wird der Überstand entsorgt und das Pellet gewogen. Suspendieren Sie nun das Pellet erneut, indem Sie vier Milliliter pro Gramm 25 Millimolare Natriumacitat, PH5, und fünf Milliliter pro Gramm sechs molare Guanidiniumchlorid mit einem millimolaren DTT hinzufügen. Inkubieren Sie die Suspension über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer Rührplatte.

Nach einer Zentrifugation bei 75.500 g für 20 Minuten enthält der Überstand das ungefaltete, monomere BMP2-Protein. Sammeln Sie den Überstand und konzentrieren Sie diesen Extrakt auf eine optische Dichte pro Milliliter von 20 unter Verwendung einer Molekulargewichts-Cutoff-Membran von drei Kilodalton in einer Konzentrationszelle. Geben Sie die konzentrierten Monomere in einzelnen Tropfen unter Rühren in den Renaturierungspuffer.

Dann die Lösung 120 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit konzentrierter Salzsäure auf 3,0 ein, bevor Sie die Lösung gegen eine millimolare Salzsäure dialysieren. Die dialysierte Lösung wird unter Verwendung einer Dichtmembran mit einem Molekulargewicht von 10 Kilodalton in einer Konzentrationszelle konzentriert.

Laden Sie dann die Proteinlösung auf die äquilibrierte Säule, verdünnen Sie die Fraktionen mit einem linearen Gradienten von Puffer B und sammeln Sie zwei Milliliterfraktionen. Analysieren Sie 20 Mikroliter jeder Fraktion durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, gefolgt von Coomassie Brilliant Blue-Färbung, um die Fraktionen, die Monomere enthalten, und die Fraktionen, die Dimere enthalten, zu bestimmen. Als nächstes Dimer ziehen, das Fraktionen enthält.

Dialysieren Sie den Pool von Dimerfraktionen über Nacht bei vier Grad Celsius gegen fünf Liter ein-Millimol-Salzsäure. Konzentrieren Sie das Produkt mit einer 10-Kilodalton-Zentrifugalfiltereinheit, bevor Sie das Endprodukt durch SDS-PAGE und Coomassie Brilliant Blue-Färbung analysieren. Kombinieren Sie 20 Mikromolare des Typs BMP2-K3Plk oder BMP2-while, der als Negativkontrolle verwendet wird, mit 20 Mikrolitern Azid-aktivierten Agarosekügelchen in Reaktionspuffer bei einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern.

Zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einer rotierenden Mischung bei 20 U/min inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie eine Endkonzentration von fünf Millimolar EDTA hinzufügen. Die Lösung wird 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Mischer bei 20 U/min inkubiert.

Zentrifugieren Sie dann die Proben bei 20.000 g für eine Minute bei Raumtemperatur und sammeln Sie die Überstände. Waschen Sie anschließend das Pellet mit den Kügelchen mit 1.000 Mikrolitern HBS 500 Puffer. Die Probe wird eine Minute lang bei Raumtemperatur bei 20.000 g zentrifugiert und der Überstand aufgefangen.

Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch zweimal mit HBS 500 Puffer, dreimal mit viermolarem Magnesiumchlorid und zweimal mit PBS, wobei Sie jeweils den Überstand auffangen. Lagern Sie die gekoppelten Kügelchen in 1.000 Mikrolitern PBS bei vier Grad Celsius. Führen Sie den ALP-Assay wie im Textprotokoll beschrieben durch.

Zur Durchführung der ALP-Färbung werden promyoblastische C2C12-Zellen in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum sowie 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin G und Streptomycin bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid kultiviert. Füttern Sie C2C12-Zellen mit einer Dichte von 30.000 Zellen pro Well in einer 96-Well-Mikroplatte. Nachdem Sie die Zellen über Nacht anheften ließen, entfernen Sie das Medium und fügen Sie 20 Mikroliter PMB2-K3PLK-gekoppelte Kügelchen pro Vertiefung hinzu.

Geben Sie dann 20 Mikroliter 0,4 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in jede Vertiefung. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Mikroplatte bei 2.000 g für fünf Minuten bei 20 Grad Celsius. Fügen Sie dann 80 Mikroliter des gleichen Mediums hinzu.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid für 72 Stunden. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und achten Sie darauf, dass sich die erstarrten 0,4 % Agarose nicht ablösen. Geben Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung einer einstufigen MBT-BCIP sub-straighten Lösung hinzu.

Analysieren Sie die alkalische Phosphatidatfärbung mittels Lichtmikroskopie, unmittelbar nachdem die violette Färbung sichtbar wird. Verwenden Sie die Hellfeldmikroskopie und machen Sie Fotos. Die Bioaktivität der neu produzierten BMP2-K3Plk-Variante wird durch Induktion der alkalischen Phosphatase-Genexpression in C2C12-Zellen validiert.

Der In-vitro-Test zeigt ähnliche Expressionsniveaus für alkalische Phosphatase-Gene, die entweder durch BMP2 oder BMP2-K3Plk induziert wurden. Kügelchen, die mit BMP2-K3Plk über eine durch die Abdeckung katalysierte Azid-Alkincyclo-Addition beschichtet wurden, ergaben Fluoreszenzen, wenn sie mit der demarkierten BMP-Rezeptor-1A-Öko-Domäne inkubiert wurden. Die Bindung des BMP-Rezeptors 1A an den BMP2-K3Plk bestätigt die Beibehaltung der Bioaktivität nach der Kopplung.

Die Bioaktivität der BMP2-K3Plk-funktionalisierten Kügelchen wurde durch ALP-vermittelte Färbung nachgewiesen. Die Färbung erfolgte nur in den Zellen, die in direktem Kontakt mit den BMP2-K3Plk-funktionalisierten Kügelchen standen, was bestätigt, dass das Protein tatsächlich kovalent an die Kügelchen gebunden ist und nicht nur absorbiert wird. Wenn das Protein in der resorbierten Situation freigesetzt würde, wäre eine stärker verteilte Färbung in größeren Abständen beobachtet worden, wie hier für die alkalische Phosphatase-Färbung nach Behandlung mit löslichem BMP2-K2Plk zu sehen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man biologisch aktive Proteine durch genetische Expansion exprimiert und produziert und wie man ein fiktives Protein durch Click-Chemie-Reaktion kovalent an Mikrosphären koppelt. Die Erzeugung von Proteinvarianz durch genetische Expansion ermöglicht prinzipiell die Einführung künstlicher Aminosäuren an jeder Position der primären Proteinsequenz. Das Einbringen einer Mutation in die BMP2-Sequenz kann die Rückfaltungseffizienz beeinflussen und auch die Proteinparameter verändern.

Die Herstellung von BMP2-K3Plk erforderte eine Modifikation der etablierten Methode zur Expression von BMP2 vom Typ BMP2. Das hergestellte BMP2-K3Plk zeigte eine biologische Aktivität, die mit der des While-Typ-Proteins vergleichbar ist. Unser Ansatz, die BMP2-Variante durch Click-Chemie kovalent an ein azire-fiktionalisiertes Agarose-Kügelchen zu koppeln, konnte mit hoher Effizienz realisiert werden, was zu fiktionalisierten Kügelchen führte, die eine genetische Differenzierung in vitro darstellten.

Der Standardschutz nach der Guten Laborpraxis muss gewährleistet sein.