Bewertung der Antikörper-basierte Medikamente Auswirkungen auf murinen Knochenmark und peritonealen Makrophagen Aktivierung
December 26th, 2017
Antikörper-basierte Medikamente haben die Behandlung von entzündlichen Erkrankungen revolutioniert. Zusätzlich zu den direkten Auswirkungen auf bestimmte Ziele, können Antikörper Makrophagen entzündungshemmende zu aktivieren. Dieses Protokoll beschreibt wie entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung bewertet in vitro mit Maus Knochenmark Makrophagen, und in-vivo mit peritonealen Makrophagen werden kann.
Das übergeordnete Ziel dieser Experimente ist es, die Auswirkungen von Antikörper-basierten Medikamenten auf die Aktivierungszustände von entzündungshemmenden Makrophagen anhand von Mausknochenmark- und Peritonealmakrophagen zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Immunologie zu beantworten, z. B. ob spezifische Antikörpermedikamente wirken, indem sie Makrophagen in einen IL-10-erzeugenden entzündungshemmenden Aktivierungszustand versetzen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Reaktion von primären Mausmakrophagen aus dem Knochenmark in vitro und der Bauchhöhle in vivo misst.
Führen Sie diesen Vorgang in einer sterilen Haube durch. Befestigen Sie eine eingeschläferte Maus in Rückenlage mit ausgestreckten Gliedmaßen auf einer Schaumstoffplatte. Reinigen Sie dann die Beine mit 70% Ethanol.
Machen Sie dann einen flachen Schnitt von etwa zwei Millimetern Tiefe, um die Haut und das Fell von der Oberfläche jedes Hinterbeins zu entfernen. Präparieren Sie dann das Gewebe, um Zugang zu den Tibias und Femuren zu erhalten. Um die Schienbeine und Oberschenkelknochen zu entfernen, schneiden Sie den Knochen und die Muskeln direkt unterhalb des Hüftgelenks und oberhalb der Knöchel ab.
Entfernen Sie dann so viel Muskelgewebe wie möglich von den Knochen. Reinigen Sie anschließend die Knochen mit 70 % Ethanol und lassen Sie es eine Minute lang verdampfen. Legen Sie dann die Knochen in eine Platte mit sechs Vertiefungen, die mit Knochenfleischmedium gefüllt ist.
Schneiden Sie in der Platte einen Millimeter von beiden Enden der Oberschenkelknochen ab, so dass ihre inneren Hohlräume freiliegen. Stellen Sie sicher, dass eine 26-Gauge-Nadel an die Kavitäten herankommt. Trennen Sie anschließend das Schienbein und den Oberschenkelknochen vom Kniegelenk.
Führen Sie dann die Nadel, die an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, in eine Knochenhöhle ein und sammeln Sie das Knochenmark. Ziehen Sie das Knochenmark von allen vier Knochen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern Knochenfleischmedium. Das Medium und das Mark mehrmals auf und ab spritzen.
Oder wirbeln Sie mit langsamer Geschwindigkeit, um Klumpen in der Suspension sanft zu verteilen. Markfäden sollten in kleine Markflecken von weniger als einem halben Millimeter Länge zerlegt werden. Füllen Sie dann das Röhrchen auf 50 Milliliter mit Knochenfleischmedium auf und geben Sie es in einen 75 Quadratzentimeter großen Gewebekulturkolben.
Inkubieren Sie das Knochenmark eine Stunde lang. Während der Inkubation haften die gereiften Zellen an dem Kolben, und die gewünschten hämatopoetischen Vorläuferzellen bleiben in Suspension. Füllen Sie die Suspension in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie die Zellen zu einem Pellet herunter.
Als nächstes verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet in fünf Millilitern MCSF-Kulturmedium. Stellen Sie dann die Zelldichte auf 500.000 pro Milliliter ein und laden Sie 30 Milliliter in einen neuen 75-Quadratzentimeter-Kolben. Setzen Sie die Kultivierung der Zellen fort und überprüfen Sie an den Tagen vier, sieben und 10, ob die Zellen adhärent und leicht verzweigt sind, indem Sie ein Breakfield-Mikroskop mit inversem Phasenkontrast verwenden.
Entsorgen Sie bei der Überprüfung der Zellen das Medium, das die nicht adhärenten Zellen enthält. Waschen Sie dann die adhärenten Zellen einmal mit IMDM und geben Sie 30 Milliliter frisches MCSF-Kulturmedium zurück in den Kolben. Ersetzen Sie das Medium an Tag 10 durch acht Milliliter enzymfreien EDTA-basierten Zelldissoziationspuffer, um die Zellen zu sammeln.
Inkubieren Sie die Zellen kurz, kratzen Sie sie dann vorsichtig ab und überprüfen Sie mit einem Mikroskop, ob sie freigesetzt wurden. Sobald die Zellen freigesetzt sind, überführen Sie den Puffer mit den Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie dann den Kolben dreimal mit fünf Millilitern IMDM, um weitere Zellen zu sammeln.
Ziehen Sie alle Auffangbehälter heraus, zentrifugieren Sie sie und resuspendieren Sie das Pellet in drei Millilitern MCSF. Zählen Sie nun die Zellen und stellen Sie ihre Konzentration auf eine Million pro Milliliter ein. Plattieren Sie dann 100 Mikroliter Zellsuspension pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden.
Die gesamte Platte sollte befüllbar sein. Kultivieren Sie die Zellen etwa eine Stunde lang, bis sie adhärent sind. Stimulieren Sie sie dann mit unterschiedlichen Konzentrationen von LPS oder intravenösem Immunglobulin oder beidem, das in IMDM hergestellt wird.
Führen Sie alle Manipulationen in doppelter oder dreifacher Ausführung durch, und stellen Sie sicher, dass die unbehandelten Steuerelemente beibehalten werden. Inkubieren Sie die Zellen dann 24 Stunden lang und analysieren Sie die Überstände. Bereiten Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit der erforderlichen Menge an intravenösem Immunglobulin und LPS vor und setzen Sie eine 26-Gauge-Nadel ein.
Verwenden Sie für Steuerelemente stattdessen PBS plus LPS. Fassen Sie die Maus am Genick und sichern Sie mit einer Hand die Hinterhand und den Schwanz. Zielen Sie auf den unteren rechten Quadranten des Bauches und führen Sie die Nadel in einem Winkel von 30 bis 40 Grad mit der Abschrägung nach oben ein und führen Sie sie etwa 1,5 Zentimeter ein.
Injizieren Sie dann den Bolus. Ernten Sie nach einer Stunde Peritonealmakrophagen, nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben. In einer sterilen Haube stecken Sie die euthanasierte Maus mit ausgebreiteten Gliedmaßen an eine Schaumstoffplatte und sterilisieren den Bauch mit 70%igem Ethanol.
Machen Sie dann einen flachen, zwei Millimeter großen Schnitt entlang der Mittellinie und ziehen Sie die Bauchhaut ab. Vermeiden Sie es, die Peritonealwand zu punktieren. Laden Sie als Nächstes eine Fünf-Milliliter-Spritze vollständig mit sterilem PBS bei pH 7,4 und injizieren Sie die Maus mit einer 25- oder 27-Gauge-Nadel am oberen Rand der Bauchhöhle von beiden Seiten in Richtung Mittellinie, wobei die Abschrägung der Nadel nach oben zeigt.
Nachdem Sie die Nadel herausgezogen haben, massieren Sie das Bauchfell 10 Sekunden lang, um die Zellen zu lösen. Führen Sie nun die Nadel wieder in den Hohlraum ein und sammeln Sie etwa 3,75 Milliliter Spülflüssigkeit. Füllen Sie die Spülflüssigkeit in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis.
Wiederholen Sie die Injektion, Massage und Sammlung der Spülflüssigkeit noch drei weitere Male und ziehen Sie alle Sammlungen in denselben Schlauch. Bei der abschließenden Entnahme kann es einfacher sein, die Spülflüssigkeit von der anderen Seite der Maus zu entnehmen. Als nächstes schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren sie in 500 Mikrolitern Beschichtungsmedium.
Zählen Sie dann die lebensfähigen Makrophagen und resuspendieren Sie sie bei einer Million pro Milliliter. Füllen Sie nun 100 Mikroliter Suspension in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit flachem Boden. Inkubieren Sie die Zellen anschließend eine Stunde lang.
Die Peritonealmakrophagen haften an der Platte. Entfernen Sie dann die nicht anhaftenden Zellen und spülen Sie jede Vertiefung zweimal mit 200 Mikrolitern warmem IMDM aus. Warten Sie nach jedem Waschen 10 Sekunden und kippen Sie die Platte langsam, um die Spüllösung zu ziehen.
Fügen Sie nach den Waschgängen wieder 100 Mikroliter Beschichtungsmedium hinzu und stellen Sie die Platte in den Inkubator. Für den ELISA inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang ohne Stimulation. Sammeln und klären Sie dann das konditionierte Medium für die Zytokinanalyse.
BMDMs können verwendet werden, um Antikörper-basierte Arzneimittelreaktionen zu testen, wenn sie in vitro mit einem Entzündungsreiz konfrontiert werden. Intravenöses Immunglobulin mit LPS erhöht die Produktion des entzündungshemmenden Zytokins IL-10 um das Siebenfache im Vergleich zur alleinigen LPS-Stimulation. Und es verringert die Produktion von IL-12/23p40.
Darüber hinaus erhöhte die intravenöse Immunglobulinstimulation allein oder mit LPS die Aktivierung der MAP-Kinase ERK1/2 mit früher und anhaltender Phosphorylierung. Die Aktivierung von P-38 erfolgte ebenfalls früher. Darüber hinaus erhöhten peritoneale Makrophagen die IL-10-Produktion durch Stimulation in vitro im Vergleich zu PBS-injizierten Mäusen signifikant.
Als nächstes wurde die Zytokinproduktion in Lavageflüssigkeit und in Überständen von ex vivo stimulierten Peritonealmakrophagen untersucht. IL-10 war in der Lavageflüssigkeit, in Peritonealzellen und Peritonealmakrophagen erhöht, wenn die Mäuse mit intravenösem Immunglobulin und LPS konfrontiert wurden. Im Vergleich dazu war die Produktion der pro-inflammatorischen Zytokin-Untereinheit IL-12/23p40 in kultivierten Peritonealmakrophagen signifikant reduziert, nicht jedoch in der Lavageflüssigkeit.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Auswirkungen von Antikörper-basierten Medikamenten auf Makrophagen-Aktivierungszustände in vitro und in vivo mit Mausknochenmark und Peritonealmakrophagen testen können.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Bewertung der durch Antikörper-basierte Medikamente induzierten entzündungshemmenden Makrophagenaktivierung. Es detailliert Methoden zur Bewertung von Mausknochenmarksmakrophagen in vitro und von Peritonealmakrophagen in vivo.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Immunologie
- Zellbiologie
- Pharmakologie
Hintergrund
- Antikörper-basierte Therapien haben die Behandlung von Entzündungskrankheiten verändert.
- Makrophagen spielen eine entscheidende Rolle bei Entzündungen und können zu einem entzündungshemmenden Zustand aktiviert werden.
- Das Verständnis der Makrophagenaktivierung kann zu besseren therapeutischen Strategien führen.
- Diese Studie konzentriert sich auf die Auswirkungen spezifischer Antikörper-Medikamente auf das Verhalten von Makrophagen.
Zweck der Studie
- Untersuchung, wie Antikörper-basierte Medikamente die Aktivierungszustände von Makrophagen beeinflussen.
- Feststellung, ob diese Medikamente einen IL-10 produzierenden entzündungshemmenden Aktivierungszustand bei Makrophagen fördern.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung primärer Mausmakrophagen.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Knochenmarksmakrophagen aus Mausfemora und -tibien.
- Kultur und Stimulation von Makrophagen mit LPS und Immunglobulin.
- Sammlung und Analyse von Peritonealmakrophagen nach Injektion der Behandlungen.
- Bewertung der Makrophagenaktivierungszustände durch Supernatantanalyse.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung und Kultur von Knochenmark- und Peritonealmakrophagen.
- Nachgewiesene Veränderungen der Makrophagenaktivierungszustände als Reaktion auf Antikörperbehandlungen.
- Bereitstellung einer detaillierten Methodik für zukünftige Studien in der Makrophagenbiologie.
- Hervorhebung der Bedeutung der Makrophagenaktivierung in therapeutischen Kontexten.
Schlussfolgerungen
- Antikörper-basierte Medikamente können die Aktivierungszustände von Makrophagen effektiv verändern.
- Dieses Protokoll dient als wertvolles Werkzeug für immunologische Forschung.
- Weitere Studien sind erforderlich, um die Implikationen dieser Ergebnisse in klinischen Umgebungen zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Evaluating the effects of antibody-based drugs on murine macrophage activation provides critical insight into immunomodulatory mechanisms relevant to biologic drug development. This approach enables mechanistic de-risking by clarifying whether candidate therapeutics induce anti-inflammatory states, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. Understanding macrophage responses informs portfolio decisions, especially for biologics targeting immune pathways in inflammatory and autoimmune indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding antibody-induced macrophage polarization.
- Supports biological de-risking by quantifying anti-inflammatory cytokine production, such as IL-10.
- Clarifies pathway engagement and functional target validation for antibody-based candidates.
- Facilitates predictive confidence in advancing immunomodulatory biologics.
Screening & Assay Development
- Prepares validated primary macrophage systems for downstream compound screening workflows.
- Standardizes cytokine quantification assays for reproducibility and cross-study comparability.
- Enables robust measurement of drug-induced changes in macrophage activation states.
- Supports reliable evaluation of candidate biologics in immune cell-based assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro and in vivo macrophage activation data with disease-relevant models in mice.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of immunomodulatory mechanisms.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for biologics with immune-modifying activity.
- Supports mechanistic de-risking for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling functional assessment of antibody-based drugs on primary macrophages both in vitro and in vivo.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antibody-induced anti-inflammatory macrophage states and pathway activation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cytokine readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers measurable outputs such as IL-10 and IL-12/23p40 levels for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo disease models to inform biomarker alignment and mechanism-of-action studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating diverse antibody-based biologics across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immunomodulatory drug development.
- Operational Value: Standardizes macrophage activation assays for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management for biologics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated immune mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary immune cell isolation and cytokine quantification.
- Needs access to sterile tissue culture, ELISA, and western blotting infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data analysis.
- Adaptable to genetically modified mouse models for mechanistic studies.
- Limited by species differences and the need for careful interpretation of murine data for human translation.
