Name: Bewertung der Antikörper-basierte Medikamente Auswirkungen auf murinen Knochenmark und peritonealen Makrophagen Aktivierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung antikörperbasierter Medikamente zur Aktivierung entzündungshemmender Makrophagen in vitro und in vivo bei Mus musculus. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von IL-10-Produktion und immunologischen Reaktionen.

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L.k. ist der Empfänger von der University of British Columbia 4-Jahres-Stipendium (4YF) Diplom Zugehörigkeit Award. L.M.S ist der Empfänger der Canadian Association of Gastroenterology / Morbus Crohn und Colitis Kanada / CIHR neue Ermittler Gehalt Award und biomedizinische Stipendiat der Stiftung Michael Smith für die Gesundheitsforschung. Diese Arbeit wurde durch einen Projekt-Zuschuss von Canadian Blood Services in Zusammenarbeit mit der Canadian Institutes of Health Research unterstützt (gewähren # CIHR2016-LS).

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of British Columbia genehmigt.
(1) Knochenmark Makrophagen Ableitung und Aktivierung mit Antikörpern
<ol>
	<li>Führen Sie Sterbehilfe mit CO2 Erstickung.<ol>
		<li>Statt Maus Induktion Kammer. Einschläfern Sie Maus mit 5 % Isoflurane Narkose, für 60-90 s, bis unbeweglich und atmen tief und langsam ist.</li>
		<li>Isofluran-Narkose schalten Sie und verwalten Sie ca. 6-8 L/min CO2 bis Maus atmen aufgehört hat. Lassen Sie Maus mit CO2 für mindestens weitere 5 min. überprüfen, dass es nicht mehr ein Herzschlag oder Atmung. Führen Sie eine zervikale Dislokation um Tod zu gewährleisten. Hinweis: 8-12 Wochen alte Mäusen bieten den höchsten Ertrag von Makrophagen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spray Maus Beine mit 70 % Ethanol und Pin, die sie mit Armen und Beinen in Rückenlage auf eine Dämmplatte verteilt. Machen Sie mit Schere und Pinzette die Haut halten einen flachen Schnitt (0,2 cm), die Haut und das Fell von der Oberfläche eines jeden der Hinterbeine zu entfernen. Hinweis: Führen Sie dieses Verfahren und alle Gewebekultur Manipulationen in einer sterilen Kapuze.</li>
	<li>Schneiden Sie Muskel um Tibien und Oberschenkelknochen sichtbar zu machen. Entfernen Sie die Schienbeine und Oberschenkelknochen, durch Schneiden von Knochen und Muskeln unterhalb des Hüftgelenks und über den Knöcheln. So viele Muskeln wie möglich abschneiden.</li>
	<li>Sprühen Sie Knochen mit 70 % Ethanol und warten Sie 1 Minute zu verdunsten, dann legen Sie sie in 6-well-Platte Knochen bündig Medium (Iscoves modifizierte Dulbecco Medium (IMDM), 10 % fetalen bovine Serum (FBS)).</li>
	<li>Schneiden Sie die Enden der Knochen von 0,1 cm des Knochens aus die Knöchel und die Oberseite des Oberschenkelknochens schneiden, so dass der Knochenhohlraum ausgesetzt ist. Sicherstellen Sie, dass das Knochenmark sichtbar ist und eine 26 Gauge-Nadel in den Knochenhohlraum platziert werden kann.</li>
	<li>Schneiden Sie die Knochen und Muskeln, die Schienbeine und Oberschenkelknochen aus den Kniegelenken zu trennen. Legen Sie eine 26 Gauge-Nadel befestigt, eine 10 mL Spritze in den Hohlraum. Spülen Sie das Knochenmark in ein 50 mL konische Röhrchen mit 5 mL des Knochens bündig mittlere. Spülen Sie zwei Schienbeine und zwei Oberschenkelknochen von einem einzigen Mausklick in jede 50 mL Tube.</li>
	<li>Pipette nach oben und unten mehrere Male oder Wirbel das Knochenmark mit langsamer Geschwindigkeit, Klumpen behutsam zu zerstreuen. Strings von Knochenmark sollte in klein (weniger als 0,5 mm) Flecken von Knochenmark aufgeteilt werden. Füllen Sie das konische Rohr bis 50 mL mit Knochen bündig mittlere. Pipette Inhalt des konischen Rohres in einer Gewebekultur 75 cm2 behandelt Kolben und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 1 h. Hinweis: Ältere Makrophagen und mesenchymalen Zellen werden an den Kolben und verworfen werden, während die gewünschte hämatopoetischen Vorläuferzellen in der Schwebe bleiben.</li>
	<li>Das Medium mit hämatopoetischen Vorläuferzellen in ein 50 mL konische Röhrchen Pipette. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 300 X g bei Raumtemperatur für 5 min. verwerfen den Überstand und das Pellet in 5 mL Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (MCSF) Kulturmedium Aufschwemmen (IMDM, 10 % FBS, 5 ng/mL MCSF und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin 150 μM Monothioglycerol (MTG)).</li>
	<li>Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer18. Fügen Sie Medium, um Zellen zu einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/mL, 1, 5 x 107 Zellen/Kolben in 30 mL Medium, Aufschwemmen und pipette vorsichtig nach oben und unten hinzu. Pipette 30 mL der Suspension in eine neue 75 cm2 Gewebekultur behandelt Kolben.</li>
	<li>Am Tag 4 und 7. Tag nach der ursprünglichen Kultur im Schritt 1,9 überprüfen Sie die Zellen anhaftende und leicht verzweigt mit einem invertierten Phase Kontrast Hellfeld-Mikroskop. Entsorgen Sie das Medium mit den nicht-anhaftende Zellen. Waschen Sie die Zellen mit IMDM einmal und 30 mL MCSF Kulturmedium.</li>
	<li>Wenn die Zellen sind Reifen von Tag 10 (&#62; 95 % positiv für F4/80 und Mac-1), noch einmal überprüfen, ob die Zellen sind Anhänger und leicht.</li>
	<li>Platte Zellen für Stimulationen, das Kulturmedium aus der Flasche zu entfernen und Hinzufügen von 8 mL Enzym frei, EDTA-basierte Zelle Dissoziation Puffer (Table of Materials). Inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
	<li>Kratzen Sie Zellen sanft, mit einer kleinen Menge des Drucks, mit einem sterilen Zelle Schaber. Check-in das Mikroskop, das Zellen von der Oberfläche der Küvette getrennt haben. Pipette dissoziiert Zellen in ein 50 mL konische Röhrchen. Spülen Sie den Kolben 3 Mal mit 5 mL IMDM und bündeln Sie die Spüllösung mit Zellen, die geerntet wurden. Zentrifugieren Sie Zellen bei 300 X g bei Raumtemperatur für 5 min.</li>
	<li>Die Zelle Pellet in 3 mL MCSF Kulturmedium pro 50 mL konische Röhrchen aufzuwirbeln. Anzahl vitaler Zellen mit einem Hemocytometer18. Zellen in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL und Platte 100 μl Zellsuspension (1 x 105 Zellen/Na) pro Bohrloch einer 96-Well Gewebekultur behandelt, flache Bodenplatte aufzuwirbeln. Hinweis: Knochen aus einem einzigen Mausklick erzeugt genügend Zellen für 100 Brunnen. Auf Wunsch können 1 mL der Zellen in einem 6-Well-Platte (Gewebekultur behandelten, flacher Boden) überzogen. Eine größere Anzahl von Zellen (1 x 106 ) kann für western-Blot Analysen nützlich sein.</li>
	<li>Sobald anhaftende, doppelte oder dreifacher Brunnen jeweils mit 10 ng/mL von LPS in IMDM, 30 mg/mL IVIg, oder IVIg + LPS zu stimulieren. Dosen von LPS oder IVIg können titriert werden, um Antworten zu optimieren. Doppelte oder dreifacher Brunnen als unstimulierte Steuerelemente zu verlassen. Inkubieren sie für 24 h (37 ° C, 5 % CO2). Hinweis: Neu vergoldete Zellen sollte Gewebekultur Brunnen innerhalb 1 h entsprechen.</li>
	<li>Sammeln Sie Zelle Überstände jede Vertiefung in einzelnen 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie Partikel enthält durch Spinnen bei 10.000 x g für 5 min.</li>
	<li>Entfernen Sie die Zelle überstand und nicht zu stören das Pellet. Ort der geklärte Zelle in einem sterilen Microcentrifuge Schlauch überstand. Hinweis: Zelle Überstände können Zytokine IL-10 und Zytokin-Untereinheit, IL-12 / 23p 40, durch Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) sofort untersucht, oder bei-80 ° C langfristig gelagert. Folgen Sie ELISA Protokoll von kommerziell erhältlichen Kit (Table of Materials). Andere Pro-inflammatorische Zytokine kann geprüft werden, wie IL-6 und TNF, wie auch sie durch Behandlung mit IVIg sinken + LPS Stimulation im Vergleich zur Stimulation mit LPS allein. Nach der Stimulation können Techniken wie westliche Beflecken oder quantitative Polymerase-Kettenreaktion (Q-PCR) 19,20adhärente Zellen vorbereitet sein.</li>
</ol>
(2) herausfordernd Mäuse In Vivo mit IVIg und Ernte peritoneale Makrophagen
<ol>
	<li>Wiegen Sie jede Maus.</li></ol>Berechnen Sie das Volumen der IVIg (Lager Konzentration 100 mg/mL) benötigt, um eine endgültige Dosis von 2,5 g/kg Körpergewicht für jede Maus zur Verfügung stellen. Hinweis: zum Beispiel ist bei einer Maus 20 g 500 µL IVIg erforderlich.
	<li>Zeichnen die erforderliche Menge an IVIg in eine sterile 1 mL Spritze mit einer sterilen 26 ausgestattet gauge Nadel. Verwalten Sie für Kontroll-Mäusen, die nicht IVIg erhalten eine Äquivalentdosis Volumen von sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert 7,4 statt IVIg.</li>
	<li>SCRUFF die Maus mit einer Hand durch seine Haut an der Rückseite des Halses mit Daumen und Zeigefinger greifen und hielt seinen Schweif und Hinterbeine mit den restlichen Fingern. Neigen Sie ihren Körper auf den Boden.</li>
	<li>Legen Sie die Nadel in einem Winkel von 30-40° im Verhältnis zu der Maus Bauch, im unteren rechten Quadranten, oben abgeschrägt und Einfügen von 1,5 cm von der Nadel. Injizieren Sie die IVIg oder PBS intraperitoneal. Warten Sie 1 h.</li>
	<li>Mäuse mit 5 % Isofluran-Narkose gefolgt von 6-8 L/min CO2 Erstickung einschläfern (siehe Schritte 1.1.1 - 1.1.2), oder nach ethischen Richtlinien des Instituts.</li>
	<li>Heften Sie die Maus, um eine Dämmplatte mit Gliedmaßen ausgebreitet. Sprühen Sie die Teile mit 70 % Ethanol. Hinweis: Führen Sie die Prozedur in einer sterilen Kapuze.</li>
	<li>Machen Sie einen flachen Schnitt in der Haut (0,2 cm) mit einer Schere entlang der Mittellinie der Maus, um zu vermeiden, schneiden die Bauchhöhle. Ziehen Sie die Bauchhaut Ausschalten der Maus Bauch mit Pinzette, damit das Futter von der intakten peritonealen Wand sichtbar ist.</li>
	<li>Füllen Sie eine 5 mL Spritze mit 5 mL sterilem PBS (pH 7,4). Legen Sie ein 25 oder 27 gauge Nadel an der Spitze des Hohlraums aus entweder links oder rechts in Richtung der Mitte der Maus mit der Schräge der Nadel auf. Hinweis: Legen Sie die Nadel vorsichtig in der Maus, so dass Sie PBS nicht in die Organe, sondern vielmehr in den peritonealen Raum injizieren.</li>
	<li>Drücken Sie die Flüssigkeit in der Bauchhöhle. Ziehen Sie die Nadel aus dem Hohlraum und massieren Sie das Peritoneum für 10 s, alle Zellen zu verdrängen. Stechen Sie die Nadel an der Spitze der Kavität und vermeiden Sie Organe zu. Sammeln und die Lavage-Flüssigkeit erholte sich in einem 15 mL konische Röhrchen auf Eis legen. Hinweis: Für jede 5 mL Flüssigkeit injiziert, wird etwa 3,75 mL wiederhergestellt werden.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Injektion und Erholung (Schritte 2,8-2,9) 3 mehr Mal (insgesamt Injektionsvolumen von 20 mL), 15 mL Lavage-Flüssigkeit insgesamt wiederherstellen. Sammeln Sie Lavage jede Maus in einem separaten 15 mL konische Rohr. Hinweis: Nach der letzten Injektion kann es einfacher sein, die Flüssigkeit von den weit linken und rechten Seiten der Maus, extrahieren wo Flüssigkeit angesammelt hat. Die Organe werden weniger Interferenzen mit der Nadel an dieser Stelle führen.</li>
	<li>Spin-down Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Zellen in 500 μL der Beschichtung Medium (IMDM, 10 % FBS und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin) per Mausklick geleert. Zählen Sie tragfähige Makrophagen mit einem Hemocytometer18. Hinweis: Die Makrophagen werden etwas größer als die anderen peritonealen Zellen. Typische Ausbeute ist 5 x 105 - 1 x 106 Makrophagen/Maus mit einem Wildtyp-C57BL/6-Maus. Optional: Wenn eine große Anzahl von roten Blutkörperchen in der Zelle Pellet vorhanden sind, führen Sie einen Lyse Schritt um sie zu entfernen, mit 1 X roter Blutkörperchen Lyse Puffer nach Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Zellen im Medium 1 x 106 Makrophagen/ml Plattieren Aufschwemmen und Platte 100 μL pro Well in eine 96-Well flache Bodenplatte Gewebekultur behandelt. Hinweis: Es möglicherweise notwendig, Pool Zellen von mehr als eine Maus für ein Experiment, wenn mit dreifacher Brunnen oder Titration Stimulanzien. Zum Beispiel wenn eine Maus 5 x 105 Makrophagen hatte, wäre 500 μL der Beschichtung Medium erforderlich. Gäbe es genügend Zellen für 5 Brunnen oder 1 Experiment in zweifacher Ausfertigung mit einer Dosis von LPS.</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen für 1 h bei 37 ° C, 5 % CO2 zu Makrophagen werden Anhänger. Adhärenten Zellen sind die peritonealen Makrophagen. Entfernen Sie Zelle Überstände und nicht anhaftende Zellen. Spülen Sie die Brunnen zweimal mit 200 μL IMDM (vorgewärmt auf 37 ° C), warten Sie 10 s und langsam kippen die Platte. Ersetzen Sie das Überzug Medium. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 30 min vor der Stimulation der Zellen.</li>
	<li>Stimulieren Sie die Makrophagen mit 10 ng/mL von LPS in IMDM, oder lassen Sie unstimulierte als Kontrolle. 24 h inkubieren, sammeln und Zelle Überstände (siehe Schritte 1.16 1.17) für IL-10 Zytokin Analyse von ELISA zu klären. Folgen Sie ELISA Protokoll von kommerziell erhältlichen Kit (Table of Materials). Hinweis: Nach Stimulation können adhärente Zellen Techniken wie western-Blot oder PCR vorbereitet sein.</li>

(3) herausfordernd Mäuse in Vivo mit IVIg + LPS und Ernte peritoneale Makrophagen
<ol>
	<li>Wiegen Sie jede Maus. Berechnen Sie das Volumen der IVIg (Lager Konzentration 100 mg/mL) benötigt, um eine endgültige Dosis von 2,5 g/kg Körpergewicht bereitzustellen. Berechnen Sie die Höhe der LPS (100 μg/mL Konzentration Lager in IMDM) benötigt, um eine endgültige Dosis von 0,2 μg/g Körpergewicht bereitzustellen. Hinweis: zum Beispiel ist für eine Maus 20 g 500 µL der Stammlösung IVIg und 40 μl einer 100 μg/mL Lösung von LPS erforderlich.</li>
	<li>Zeichnen Sie die erforderliche Menge an IVIg und LPS in eine sterile 1 mL Spritze, ausgestattet mit einem sterilen 26 gauge Nadel. Ersetzen Sie für Kontroll-Mäusen, die nicht IVIg erhalten gleichwertigem Umfang von IVIg mit sterilen PBS pH 7.4.</li>
	<li>SCRUFF die Maus mit einer Hand durch seine Haut an der Rückseite des Halses mit Daumen und Zeigefinger greifen und hielt seinen Schweif und Hinterbeine mit den restlichen Fingern. Neigen Sie ihren Körper auf den Boden.</li>
	<li>Ort die Nadel in einem Winkel von 30-40° im Verhältnis zu der Maus Bauch, im unteren rechten Quadranten, Fase, und fügen Sie 1,5 cm. Spritzen die IVIg + LPS, oder PBS + LPS, intraperitoneal wie in Schritt 2.4.</li>
	<li>Ernten Sie nach 1h peritoneale Makrophagen durch Schritten 2,5-2.10.</li>
	<li>Spin-down Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. 1 mL der wiederhergestellten Lavage-Flüssigkeit zu entfernen und IL-10 und IL-12 / 23p 40 Analysen von ELISA nach Herstellerangaben verwenden oder Einfrieren bei-80 ° C für zukünftige Analysen. Hinweis: Um genauer Vergleich zwischen den Behandlungen für Lavage Fluid Zytokin Analyse zu gewährleisten, führen Sie 5 mL Flushs von der Bauchhöhle 4 Mal für ein finales Volumen von 15 mL. Nicht alle Flüssigkeit wird aus jeder Spülung wiederhergestellt werden.</li>
	<li>Wie in Schritt 2.11 Aufschwemmen und tragfähige Makrophagen zu zählen. Hinweis: Die Makrophagen werden etwas größer als die anderen peritonealen Zellen.</li></ol>Typische Ausbeute ist 5 x 105 - 1 x 106 Makrophagen/Maus mit einem Wildtyp-C57BL/6-Maus. Optional: Wenn eine große Anzahl von roten Blutkörperchen in der Zelle Pellet vorhanden sind, führen Sie einen Lyse Schritt nach Herstellerangaben zu entfernen, wie in Schritt 2.11.
	<li>Wie in Schritt 2.12, erneut aussetzen Sie Zellen in Galvanik Medium. Hinweis: Es möglicherweise notwendig, Pool Zellen von mehr als eine Maus für ein Experiment. Zum Beispiel wenn eine Maus 5 x 105 Makrophagen hatte, wäre 500 μL der Beschichtung Medium erforderlich.</li>
	<li>Wie in 2.13, inkubieren Zellen für 1 h bei 37 ° C 5 % CO2 zu Makrophagen werden Anhänger.</li>
	<li>Sammeln und konditionierten Medium gemäß Schritte 1,14 1,15, aus allen peritonealen Zellen zu klären. Hinweis: Proben können sofort verwendet oder eingefroren und bei-80 ° C für die Zytokin-Analyse von ELISA gespeichert.</li>
	<li>Führen Sie Schritt 2.11, aber inkubieren Sie Zellen für 24 h unstimulierte. Sammeln und Zelle Überstände nach Schritte 1.16-1.17 für Zytokin-Analyse von ELISA zu klären. Hinweis: Zellen können Techniken wie western-Blot oder PCR, wie in den Schritten 1.16 1.17 und 2.14 vorbereitet werden.</li>

<ol><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation%3A+time+for+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment.</a> F1000Prime Rep. 6, 13(2014).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+functional+characterization+of+three+activated+macrophage+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations.</a> J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).</li>
<li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).</li>
<li>Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+IgG+density+and+macrophage+Fc+%28gamma%29+receptor+cross-linking+on+phagocytosis+and+IL-10+production%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production.</a> Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).</li>
<li>Vos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-tumor+necrosis+factor-%CE%B1+antibodies+induce+regulatory+macrophages+in+an+Fc+region-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner.</a> Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).</li>
<li>Kozicky, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+immunoglobulin+skews+macrophages+to+an+anti-inflammatory%2C+IL-10-producing+activation+state%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state.</a> J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).</li>
<li>Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+proinflammatory+responses+by+ligating+the+macrophage+Fcgamma+receptor+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I.</a> J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiinflammatory+activity+of+IgG%3A+the+intravenous+IgG+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox.</a> J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).</li>
<li>Gelfand, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+immune+globulin+in+autoimmune+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases.</a> N Engl J Med. 368 (8), 777(2013).</li>
<li>Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+immune+globulin+affects+cytokine+production+in+T+lymphocytes+and+monocytes%2Fmacrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages.</a> Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).</li>
<li>Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipopolysaccharide-induced+interleukin-12+production+by+activation+of+repressor+element+GA-12+through+hyperactivation+of+the+ERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway.</a> Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).</li>
<li>Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB1+%28p50%29+homodimers+differentially+regulate+pro-+and+anti-inflammatory+cytokines+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages.</a> J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).</li>
<li>Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+targets+for+mucosal+healing+and+therapy+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).</li>
<li>Bryant, A., Moore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rituximab+and+its+potential+for+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Clin+Risk+Manag%22%5BJournal%5D)">Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).</li>
<li>Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies%3A+versatile+platforms+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).</li>
<li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+viability+analysis+using+trypan+blue%3A+manual+and+automated+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).</li>
<li>Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 6 (3), 160(2014).</li>
<li>Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+mRNA+using+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).</li>
<li>Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+activation+following+macrophage+FcgammaR+ligation+leads+to+chromatin+modifications+at+the+IL-10+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus.</a> J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li>
<li>Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+macrophage+function+with+IgG+immune+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endotoxin+Res%22%5BJournal%5D)">Modulating macrophage function with IgG immune complexes.</a> J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).</li>
<li>Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+suppression+of+interleukin-12+induction+after+macrophage+receptor+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation.</a> J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).</li>
<li>Riquelme, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-%CE%B3-induced+iNOS+expression+in+mouse+regulatory+macrophages+prolongs+allograft+survival+in+fully+immunocompetent+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients.</a> Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).</li>
<li>Vos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+macrophages+induced+by+infliximab+are+involved+in+healing+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro.</a> Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).</li>
<li>Gerber, J. S., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+lipopolysaccharide+toxicity+by+ligating+the+macrophage+Fc+gamma+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors.</a> J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).</li>
<li>Durandy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+immunoglobulins--understanding+properties+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms.</a> Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).</li>
<li>Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2249.2005.02834.x/full">Clinical uses of intravenous immunoglobulin.</a> Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).</li>
<li>Murakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+immunoglobulin+preparation+prevents+the+production+of+pro-inflammatory+cytokines+by+modulating+NF%CE%BAB+and+MAPKs+pathways+in+the+human+monocytic+THP-1+cells+stimulated+with+procalcitonin%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin.</a> Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Makrophagen Aktivierung Staaten spielen eine wichtige Rolle in beiden Gewebe Homöostase und Krankheit22. Makrophagen können unterschiedliche sowie überlappende Aktivierungsstatus abhängig von Cues in ihrer Mikroumgebung3haben. Sie haben unterschiedliche Rollen in allen Phasen der Entzündungsreaktion: Verteidigung gegen Krankheitserreger, Wunde heilen und Gewebe Restitution und haben auch eine ausgeprägte entzündungshemmende Aktivierungsstatus, die wichtig für das Ausschalte...

Makrophagen sind angeborene Immunzellen, die mehrere Rollen in der Immunantwort auf Infektionen oder Verletzungen zu spielen. Makrophagen sind verantwortlich für die Einleitung einer Immunantwort auf Infektionen oder Gewebe Schaden, die entzündliche Reaktion zu stoppen und die heilende Antwort1zu fördern. Beispiele für die drei am besten untersuchten Makrophagen Aktivierung Zustände sind: 1) Makrophagen, die Behandlung mit Interferon-Gamma (IFNγ) und bakterielle Lipopolysaccharid (LPS), M (IFNγ + LPS) bezeichnet, die dazu beitragen, die entzündliche Reaktion; (2) Makrophagen stimuliert mit Interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), die mit dem Heilungsprozess verbunden sind; (3) Makrophagen stimuliert mit Immunkomplexe (IC) und LPS, M (IC + LPS), die die Fähigkeit haben, die entzündliche Reaktion2,3deaktivieren. M (IC + LPS) unterscheiden sich von M(IL-4) Wundheilung Makrophagen und nicht ausdrücken, das Enzym Arginase (Arg-1) oder FIZZ14. Der beste Marker für diese entzündungshemmende Makrophagen ist ihre Zytokin-Produktion-5. Makrophagen haben mehrere Rollen bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit, aber auch zu entzündlichen Erkrankungen und Krebs3beitragen. Aus diesem Grund sind Makrophagen eine wichtige therapeutische Ziel für die Behandlung von einer Vielzahl von Krankheiten. Es ist wichtig zu untersuchen, die Auswirkungen von Antikörpern auf ihren Aktivierungsstatus zu Makrophagen-basierte Therapien für Krankheiten zu entwickeln.
Dieses Dokument konzentriert sich auf die Verwendung von murinen Knochenmark abgeleitet Makrophagen (BMDMs) und peritonealen Makrophagen, die Wirkung von Antikörpermedikamente auf Entzündungsreaktionen in Vitro und in Vivozu testen. Vor kurzem gab es mehrere Studien, die zeigen der Auswirkungen von Antikörpern auf Makrophagen Aktivierung6,7,8. Gemeinsam mit Immun-komplexe, die Antikörper mit einem Antigen und LPS, normalerweise Entzündungsreiz komplexiert sind aktiviert Makrophagen produzieren sehr hohes Maß an den Anti-inflammatorische Zytokine IL-10 und sehr niedrige Niveaus von Pro-inflammatorischen Zytokinen, Interleukin 12 (IL-12)9. In Addition, Infliximab, ein monoklonaler Antikörper gegen TNF zur Arbeit, zum Teil durch Induktion entzündungshemmende Makrophagen durch seine Fragment kristallisierbares (Fc) Region7festgestellt wurde. Wir haben berichtet, dass IVIg + LPS entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung, die ähnlich M (IC + LPS) induzieren, wobei Co stimulierte Makrophagen produzieren große Mengen von IL-10 und geringe Mengen an die Untereinheit Pro-inflammatorische Zytokin Interleukin-12 oder 23 p40 ( Il-12/23p40), Interleukin-6 (IL-6) und TNF-8. IVIg ist ein Medikament, bestehend aus polyclonal Antikörper vor allem IgG, die aus dem Blut von mehr als 1.000 Spender10gebündelt hat. Es wird zur Behandlung einer Vielzahl von Immunkrankheiten wie idiopathische thrombozytopenische Purpura und chronische demyelinisierende Polyneuropathie, aber sein Wirkmechanismus ist nicht vollständig verstanden11. Die Auswirkungen der Antikörpermedikamente basierend auf Makrophagen Aktivierung können beurteilt werden, hierin beschriebene Methoden verwenden.
Die Auswirkungen von spezifischen Biologics auf Makrophagen Aktivierung können in BMDMs und peritonealen Makrophagen getestet werden. Mit Hilfe dieser Makrophagen Quellen ermöglicht Bewertung von Primärzellen. Vorläufige Tests von Antikörpern auf kultivierten Primärzellen erfordert weniger Zeit und finanzielle Investition als andere Zeit- und kostenintensiv Krankheitsmodelle. Durch Einspritzen eines Medikaments in einem gesunden Maus in Vivo, und die Zellen zu isolieren und ex Vivozu analysieren, kann man feststellen, ob Studien gerechtfertigt sind, um zu beurteilen, ob die Behandlung mit Biologics Makrophagen Aktivierung in Krankheitsmodellen betrifft.
Unsere Techniken bieten nur wenige Studien die Wirkung von biologischen Therapien auf Makrophagen Aktivierung in Vitro und in Vivo direkt testen einen Vorteil gegenüber alternativen Techniken. Aktuelle Techniken beinhalten Tests biologischen Drogenwirkungen auf gemischte Zelle Bevölkerungen in Vitro, wie z. B. die Wirkung von Infliximab in einem gemischten Lymphozyten Reaktion (MLR) oder IVIg auf menschliche Makrophagen in peripheren mononukleären Blutzellen, wo die Wirkung kann nicht auf eine bestimmte Zelle Typ7,12zurückführen. Mit BMDMs und peritonealen Makrophagen ist vorteilhaft gegenüber der Verwendung von Zelllinien, wie RAW264.7 Zellen, die nicht die Pro-inflammatorische Zytokine produzieren, IL-12, als Reaktion auf LPS8,13. Testen die Wirkung von einem Antikörper-basierten Medikament auf Makrophagen Antworten ex Vivo hat Vorteile, weil direkt auf Makrophagen Cytokine Reaktionen zurückführen lassen, anstatt herleiten von Makrophagen Antworten durch die Messung der Serumspiegel Zytokin14 . BMDMs und peritonealen Makrophagen können abgeleitet und von genetisch veränderten Mäusen zu bestimmen, die spezifische Rolle eines Proteins in entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung isoliert. Wir haben z. B. Il10 mangelhaft(- / -) BMDMs zu zeigen, dass IVIg-induzierte Verringerung der Produktion von Pro-inflammatorischen Zytokinen IL-108teilweise abhängig ist. Ein Medikament Wirkmechanismus untersucht werden kann verwenden westliche Beflecken, wo die Rolle der spezifischen Proteine und Signalisierung Ereignisse ermittelt werden kann. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) kann durchgeführt werden, auf BMDMs oder peritonealen Makrophagen Muster der Genexpression zu zeigen, die durch Antikörper Aktivierung entstehen. Krankheitsmodelle bei Mäusen bieten Informationen über die mögliche Wirksamkeit von Antikörper-basierten biologischen Therapien in Modellen für Erkrankungen wie entzündliche Darm-Krankheit, rheumatoide Arthritis und Krebs15,16, 17. jedoch die hier beschriebenen Techniken informieren über den Wirkmechanismus von diese Biologics durch die Bestimmung, ob sie entzündungshemmende Makrophagen-Aktivität induzieren.

<table><tbody><tr><td>Iscove' s modifizierter Dulbecco" s Medium (IMDM)</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter makriner Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (MCSF)</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>78059</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Lebenstechnologien</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerin (MTG)</td><td>Sigma</td><td>88640</td><td></td></tr><tr><td>1X Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen</td><td>eBioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puffer für die Zelldissoziation</td><td>Life-Technologien</td><td>13150016</td><td>Enzymfreies, auf Hanks basierendes</td>EDTA-Lipopolysaccharid</tr><tr><td>(LPS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>L 4516</td><td>aus E. coli 0127:B8</td></tr><tr><td>IVIg (Gammunex)</td><td>Grifols</td><td>aus dem BC Children's Hospital, Transfusionsmedizin</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Gammagard flüssig)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>erhalten vom BC Children's Hospital, Transfusionsmedizin</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Octagam)</td><td>Octapharma</td><td>erhalten vom BC Children's Hospital, Transfusionsmedizin</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (steril), pH 7,4</td><td>Lebenstechnologien</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Maus IL-10 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555252</td><td></td></tr><tr><td>Maus IL-12/23p40 ELISA</td><td>BD Biosciences</td><td>555165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Erk1/2 Antikörper</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PP38 Antikörper</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>9211</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Antikörper</td><td>Fitzgerald industries</td><td>10R-G109A</td><td></td></tr><tr><td>26 g Nadel</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>BD biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Spritze</td><td>BD biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konisches Röhrchen</td><td>BD biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Röhrchen</td><td>BD biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (1,7 mL)</td><td>Diamed</td><td>SPE155-N</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Gewebekultur-behandelter Kolben</td><td>BD biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>BD biosciences</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>feine Spitze, präparieren&nbsp;</td></tr><tr><td>Schere</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td>Delicate, 4 1/2"</td></tr><tr><td>Hellfeldmikroskop</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td>Inverser Phasenkontrast</td></tr><tr><td>Skala&nbsp;</td><td>Mettler&nbsp;</td><td>PE 3000</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der antikörper-basierte medikamente auswirkungen auf murinen knochenmark und peritonealen makrophagen aktivierung

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Makrophagen sind phagocytic angeborene Immunzellen, die Immunantworten auf Krankheitserreger zu initiieren und zu Heilung und Gewebe Wiedergutmachung beitragen. Makrophagen sind ebenso wichtig für die Entzündungsreaktionen ausschalten. Wir haben gezeigt, dass hohe Mengen an die Anti-inflammatorische Zytokine, Interleukin 10 (IL-10) und niedrige Niveaus von Pro-inflammatorischen Zytokinen als Reaktion auf bakteriellen Lipopolysacchariden (Makrophagen stimuliert mit intravenösem Immunglobulin (IVIg produzieren) LPS). IVIg ist ein polyvalenter Antikörper, vor allem Immunglobulin Gs (IgGs), aus dem Plasma von mehr als 1.000 Blutspendern gebündelt. Es dient der Ergänzung Antikörper bei Patienten mit Immunschwäche oder Immunantworten bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder entzündlichen Bedingungen zu unterdrücken. Infliximab, eine therapeutische anti-Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF) Antikörper, nachweislich auch Makrophagen produzieren IL-10 in Reaktion auf entzündliche Reize zu aktivieren. IVIg und andere Antikörper-basierten Biologics kann getestet werden, um deren Auswirkungen auf Makrophagen Aktivierung zu bestimmen. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung, Stimulation und Bewertung der murinen Knochenmark Makrophagen durch Antikörper in Vitro aktiviert und murinen peritonealen Makrophagen aktiviert mit Antikörpern in Vivo. Zu guter Letzt zeigen wir die Verwendung von westliche Beflecken, um den Beitrag der bestimmte Zelle Signalwege entzündungshemmende Makrophagen-Aktivität zu bestimmen. Diese Protokolle können mit genetisch veränderten Mäusen, verwendet werden, um festzustellen, die Wirkung von bestimmten benutzt auf entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung. Diese Techniken können auch verwendet werden, um festzustellen, ob bestimmte Biologics wirken können, indem Makrophagen auf eine IL-10 produzierende entzündungshemmende Aktivierungsstatus, die Entzündungsreaktionen in Vivoreduziert. Dies kann geben Auskunft über die Rolle der Makrophagen Aktivierung in die Wirksamkeit von Biologika während Krankheitsmodelle in Mäusen und geben Einblick in ein potenzieller neuer Wirkmechanismus im Menschen. Umgekehrt kann dies gegen den Einsatz von spezifischen Antikörpern basierende Biologics Vorsicht zur Behandlung von Infektionskrankheiten, insbesondere dann, wenn Makrophagen eine wichtige Rolle in der Wirt Verteidigung gegen diese Infektion spielen.

Murine Knochen Knochenmark abgeleitet Makrophagen können aus Vorstufen der blutbildenden Zellen im Knochenmark Aspiraten kultiviert werden. Knochenmark Aspiraten gebündelt in der Regel vom Oberschenkelknochen und Gebeinen der Mausklick C57BL/6 Ertrag 107 Knochenmark abgeleitet Makrophagen, so dass sie eine günstige Quelle von Makrophagen für Experimente. BMDMs kann verwendet werden, basieren Medikament Antikörperantworten als mit einem Entzündungsreiz in Vitroherausgef...

Antikörper-basierte Medikamente haben die Behandlung von entzündlichen Erkrankungen revolutioniert. Zusätzlich zu den direkten Auswirkungen auf bestimmte Ziele, können Antikörper Makrophagen entzündungshemmende zu aktivieren. Dieses Protokoll beschreibt wie entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung bewertet in vitro mit Maus Knochenmark Makrophagen, und in-vivo mit peritonealen Makrophagen werden kann.

Bewertung der Antikörper-basierte Medikamente Auswirkungen auf murinen Knochenmark und peritonealen Makrophagen Aktivierung

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Das übergeordnete Ziel dieser Experimente ist es, die Auswirkungen von Antikörper-basierten Medikamenten auf die Aktivierungszustände von entzündungshemmenden Makrophagen anhand von Mausknochenmark- und Peritonealmakrophagen zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Immunologie zu beantworten, z. B. ob spezifische Antikörpermedikamente wirken, indem sie Makrophagen in einen IL-10-erzeugenden entzündungshemmenden Aktivierungszustand versetzen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Reaktion von primären Mausmakrophagen aus dem Knochenmark in vitro und der Bauchhöhle in vivo misst.Führen Sie diesen Vorgang in einer sterilen Haube durch. Befestigen Sie eine eingeschläferte Maus in Rückenlage mit ausgestreckten Gliedmaßen auf einer Schaumstoffplatte. Reinigen Sie dann die Beine mit 70% Ethanol.Machen Sie dann einen flachen Schnitt von etwa zwei Millimetern Tiefe, um die Haut und das Fell von der Oberfläche jedes Hinterbeins zu entfernen. Präparieren Sie dann das Gewebe, um Zugang zu den Tibias und Femuren zu erhalten. Um die Schienbeine und Oberschenkelknochen zu entfernen, schneiden Sie den Knochen und die Muskeln direkt unterhalb des Hüftgelenks und oberhalb der Knöchel ab.Entfernen Sie dann so viel Muskelgewebe wie möglich von den Knochen. Reinigen Sie anschließend die Knochen mit 70 % Ethanol und lassen Sie es eine Minute lang verdampfen. Legen Sie dann die Knochen in eine Platte mit sechs Vertiefungen, die mit Knochenfleischmedium gefüllt ist.Schneiden Sie in der Platte einen Millimeter von beiden Enden der Oberschenkelknochen ab, so dass ihre inneren Hohlräume freiliegen. Stellen Sie sicher, dass eine 26-Gauge-Nadel an die Kavitäten herankommt. Trennen Sie anschließend das Schienbein und den Oberschenkelknochen vom Kniegelenk.Führen Sie dann die Nadel, die an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, in eine Knochenhöhle ein und sammeln Sie das Knochenmark. Ziehen Sie das Knochenmark von allen vier Knochen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern Knochenfleischmedium. Das Medium und das Mark mehrmals auf und ab spritzen.Oder wirbeln Sie mit langsamer Geschwindigkeit, um Klumpen in der Suspension sanft zu verteilen. Markfäden sollten in kleine Markflecken von weniger als einem halben Millimeter Länge zerlegt werden. Füllen Sie dann das Röhrchen auf 50 Milliliter mit Knochenfleischmedium auf und geben Sie es in einen 75 Quadratzentimeter großen Gewebekulturkolben.Inkubieren Sie das Knochenmark eine Stunde lang. Während der Inkubation haften die gereiften Zellen an dem Kolben, und die gewünschten hämatopoetischen Vorläuferzellen bleiben in Suspension. Füllen Sie die Suspension in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie die Zellen zu einem Pellet herunter.Als nächstes verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet in fünf Millilitern MCSF-Kulturmedium. Stellen Sie dann die Zelldichte auf 500.000 pro Milliliter ein und laden Sie 30 Milliliter in einen neuen 75-Quadratzentimeter-Kolben. Setzen Sie die Kultivierung der Zellen fort und überprüfen Sie an den Tagen vier, sieben und 10, ob die Zellen adhärent und leicht verzweigt sind, indem Sie ein Breakfield-Mikroskop mit inversem Phasenkontrast verwenden.Entsorgen Sie bei der Überprüfung der Zellen das Medium, das die nicht adhärenten Zellen enthält. Waschen Sie dann die adhärenten Zellen einmal mit IMDM und geben Sie 30 Milliliter frisches MCSF-Kulturmedium zurück in den Kolben. Ersetzen Sie das Medium an Tag 10 durch acht Milliliter enzymfreien EDTA-basierten Zelldissoziationspuffer, um die Zellen zu sammeln.Inkubieren Sie die Zellen kurz, kratzen Sie sie dann vorsichtig ab und überprüfen Sie mit einem Mikroskop, ob sie freigesetzt wurden. Sobald die Zellen freigesetzt sind, überführen Sie den Puffer mit den Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie dann den Kolben dreimal mit fünf Millilitern IMDM, um weitere Zellen zu sammeln.Ziehen Sie alle Auffangbehälter heraus, zentrifugieren Sie sie und resuspendieren Sie das Pellet in drei Millilitern MCSF. Zählen Sie nun die Zellen und stellen Sie ihre Konzentration auf eine Million pro Milliliter ein. Plattieren Sie dann 100 Mikroliter Zellsuspension pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden.Die gesamte Platte sollte befüllbar sein. Kultivieren Sie die Zellen etwa eine Stunde lang, bis sie adhärent sind. Stimulieren Sie sie dann mit unterschiedlichen Konzentrationen von LPS oder intravenösem Immunglobulin oder beidem, das in IMDM hergestellt wird.Führen Sie alle Manipulationen in doppelter oder dreifacher Ausführung durch, und stellen Sie sicher, dass die unbehandelten Steuerelemente beibehalten werden. Inkubieren Sie die Zellen dann 24 Stunden lang und analysieren Sie die Überstände. Bereiten Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit der erforderlichen Menge an intravenösem Immunglobulin und LPS vor und setzen Sie eine 26-Gauge-Nadel ein.Verwenden Sie für Steuerelemente stattdessen PBS plus LPS. Fassen Sie die Maus am Genick und sichern Sie mit einer Hand die Hinterhand und den Schwanz. Zielen Sie auf den unteren rechten Quadranten des Bauches und führen Sie die Nadel in einem Winkel von 30 bis 40 Grad mit der Abschrägung nach oben ein und führen Sie sie etwa 1,5 Zentimeter ein.Injizieren Sie dann den Bolus. Ernten Sie nach einer Stunde Peritonealmakrophagen, nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben. In einer sterilen Haube stecken Sie die euthanasierte Maus mit ausgebreiteten Gliedmaßen an eine Schaumstoffplatte und sterilisieren den Bauch mit 70%igem Ethanol.Machen Sie dann einen flachen, zwei Millimeter großen Schnitt entlang der Mittellinie und ziehen Sie die Bauchhaut ab. Vermeiden Sie es, die Peritonealwand zu punktieren. Laden Sie als Nächstes eine Fünf-Milliliter-Spritze vollständig mit sterilem PBS bei pH 7,4 und injizieren Sie die Maus mit einer 25- oder 27-Gauge-Nadel am oberen Rand der Bauchhöhle von beiden Seiten in Richtung Mittellinie, wobei die Abschrägung der Nadel nach oben zeigt.Nachdem Sie die Nadel herausgezogen haben, massieren Sie das Bauchfell 10 Sekunden lang, um die Zellen zu lösen. Führen Sie nun die Nadel wieder in den Hohlraum ein und sammeln Sie etwa 3,75 Milliliter Spülflüssigkeit. Füllen Sie die Spülflüssigkeit in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis.Wiederholen Sie die Injektion, Massage und Sammlung der Spülflüssigkeit noch drei weitere Male und ziehen Sie alle Sammlungen in denselben Schlauch. Bei der abschließenden Entnahme kann es einfacher sein, die Spülflüssigkeit von der anderen Seite der Maus zu entnehmen. Als nächstes schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren sie in 500 Mikrolitern Beschichtungsmedium.Zählen Sie dann die lebensfähigen Makrophagen und resuspendieren Sie sie bei einer Million pro Milliliter. Füllen Sie nun 100 Mikroliter Suspension in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit flachem Boden. Inkubieren Sie die Zellen anschließend eine Stunde lang.Die Peritonealmakrophagen haften an der Platte. Entfernen Sie dann die nicht anhaftenden Zellen und spülen Sie jede Vertiefung zweimal mit 200 Mikrolitern warmem IMDM aus. Warten Sie nach jedem Waschen 10 Sekunden und kippen Sie die Platte langsam, um die Spüllösung zu ziehen.Fügen Sie nach den Waschgängen wieder 100 Mikroliter Beschichtungsmedium hinzu und stellen Sie die Platte in den Inkubator. Für den ELISA inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang ohne Stimulation. Sammeln und klären Sie dann das konditionierte Medium für die Zytokinanalyse.BMDMs können verwendet werden, um Antikörper-basierte Arzneimittelreaktionen zu testen, wenn sie in vitro mit einem Entzündungsreiz konfrontiert werden. Intravenöses Immunglobulin mit LPS erhöht die Produktion des entzündungshemmenden Zytokins IL-10 um das Siebenfache im Vergleich zur alleinigen LPS-Stimulation. Und es verringert die Produktion von IL-12/23p40.Darüber hinaus erhöhte die intravenöse Immunglobulinstimulation allein oder mit LPS die Aktivierung der MAP-Kinase ERK1/2 mit früher und anhaltender Phosphorylierung. Die Aktivierung von P-38 erfolgte ebenfalls früher. Darüber hinaus erhöhten peritoneale Makrophagen die IL-10-Produktion durch Stimulation in vitro im Vergleich zu PBS-injizierten Mäusen signifikant.Als nächstes wurde die Zytokinproduktion in Lavageflüssigkeit und in Überständen von ex vivo stimulierten Peritonealmakrophagen untersucht. IL-10 war in der Lavageflüssigkeit, in Peritonealzellen und Peritonealmakrophagen erhöht, wenn die Mäuse mit intravenösem Immunglobulin und LPS konfrontiert wurden. Im Vergleich dazu war die Produktion der pro-inflammatorischen Zytokin-Untereinheit IL-12/23p40 in kultivierten Peritonealmakrophagen signifikant reduziert, nicht jedoch in der Lavageflüssigkeit.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Auswirkungen von Antikörper-basierten Medikamenten auf Makrophagen-Aktivierungszustände in vitro und in vivo mit Mausknochenmark und Peritonealmakrophagen testen können.

assessment-antibody-based-drugs-effects-on-murine-bone-marrow

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Homöostase und Pathologie in vielen Geweben. Das Protokoll beschreibt hier vorgestellte Verfahren zur Abreicherung von...

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

In diesem Video demonstrieren wir die Aktivierung von aus Knochenmark gewonnenen Makrophagen als Reaktion auf bakterielle Lipopolysaccharide und intravenöses Immunglobulin.

Aktivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark der Maus als Reaktion auf Antikörper

Dieses Video zeigt die Aktivierung der Peritonealmakrophagen einer Maus mit intravenösem Immunglobulin und bakteriellem Lipopolysaccharid. Durch die Co-Stimulation werden die Peritonealmakrophagen zu entzündungshemmenden Makrophagen mit immunregulatorischer Aktivität aktiviert.

In vivo Aktivierung von Peritonealmakrophagen als Reaktion auf Antikörper in einem Mausmodell

In diesem Video demonstrieren wir die Wirkung verschiedener Anti-c-fms-Antikörperkonzentrationen auf die Osteoklastogenese, d.h. den Prozess der Osteoklastenbildung aus Osteoklastenvorläuferzellen.

Wirkung des Anti-C-fms-Antikörpers auf die Osteoklastogenese in Knochenmarkzellen der Maus in vitro

Makrophagen sind seit langem als eine kritische Komponente der angeborenen und erworbenen Immunantworten erkannt. Die jüngste Explosion des Wissens im Zusammenhang mit evolutionären, genetischen und biochemischen Aspekte der Interaktion zwischen Makrophagen und Mikroben hat die wissenschaftliche Aufmerksamkeit auf Makrophagen erneuert. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Makrophagen aus Knochenmark der Maus zu unterscheiden.

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur in Vivo Bestimmung der naiven CD4-T Zellaktivierung (T Cell), Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch GM-CSF Knochenmark (BM)-abgeleitete Dendritische Zellen (DCs). Darüber hinaus beschreibt dieses Protokolls BM und T-Zellen isoliert, DC-Generation und DC und T-Zell-Adoptiv-Transfer.

Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

Dieses Protokoll enthält Dissektion der murinen langen Knochen und Knochenmark isoliert, Knochenmark Makrophagen zu generieren und produzieren Osteoklasten mit Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL) oder Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF-α) und ihre Verhaftung durch Anti-c-Fms Antikörper, M-CSF Rezeptor.

Wirkung von Anti-c-Fms-Antikörper auf Osteoklasten Bildung und Verbreitung von Osteoklasten-Vorläufer In-vitro-

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-enzymatische und unkomplizierte Methode zur Isolierung von 7-9 Tage alten neonatalen Knochenmarkzellen der Maus und zur Erzeugung differenzierter Makrophagen unter Verwendung eines Überstands von L929-Zellen als Quelle für den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF). Die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen wurden weiterhin auf die Oberflächenantigene F4/80, CD206, CD11b und funktionelle Kompetenz analysiert.

Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen

Dendritische Zellen Aufnahme Antigene und wandern in Richtung Immunsystem Organe prozessierte Antigene, die auf T-Zellen präsentieren. Qdot Nanokristall Kennzeichnung stellt eine langfristige und stabile Fluoreszenz-Signal. Dies ermöglicht die Verfolgung von dendritischen Zellen in verschiedenen Organen durch Fluoreszenz-Mikroskopie.

Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Erfahren Sie die Bewertung antikörperbasierter Medikamente zur Aktivierung entzündungshemmender Makrophagen in vitro und in vivo bei Mus musculus. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von IL-10-Produktion und immunologischen Reaktionen.

Bewertung der Antikörper-basierte Medikamente Auswirkungen auf murinen Knochenmark und peritonealen Makrophagen Aktivierung

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