Name: Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Lernen Sie die Implementierung eines Echtzeit-3D-Einzelteilchen-Tracking-Mikroskops zur kontinuierlichen Beobachtung diffundierender Nanopartikel. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung einzelner Viren während des Infektionsprozesses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch das National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Prämiennummer R35GM124868 und von der Duke University unterstützt.

1. setup Layout und Ausrichtung
<ol>
	<li>Laser-Installation und Kollimation der Tracking-Anregung<ol>
		<li>Befestigen Sie den Laser auf die optischen Tisch mit einer selbstgebauten Halterung. Die Halterung ist eine einfache Aluminium-Platte mit Befestigungsbohrungen für den Laserkopf und optischen Tisch. Der Laser ist fest eine Metallfassung für Stabilität und Wärmeableitung beizufügen. Verwenden Sie für diese Arbeit 488 nm Festkörperlaser für Beleuchtung (Abbildung 1), obwohl die Wellenlänge ausgewählt werden kann, entsprechen einem bestimmten Fluorophore oder experimentieren. Ein kritischer Faktor ist, dass die Wellenlänge des Lasers den 2D-EOD Arbeitsbereich passen bestimmt in erster Linie durch die Wellenlängen-Platte zwischen die zwei Deflektoren (Abbildung 1: W2). 488 nm Laser kann das grüne oder gelbe fluoreszierende Protein (GFP/YFP), die gemeinsame fluoreszierende Tags in live Zellexperimente sind effektiv begeistern.</li>
		<li>Der Laserstrahl Höhe und Richtung mit einer dielektrischen Spiegel anpassen (Abbildung 1: M). Stellen Sie sicher, dass der Laserstrahl ist parallel zum optischen Tisch und auf eine passende Höhe einstellen. Hinweis: Sollte die Höhe anhand der Mikroskop-Plattform gewählt werden. Diese Höhe sollte für alle nachfolgenden Spiegel in diesem Protokoll verwendeten beibehalten werden, obwohl es nicht explizit angegeben werden.</li>
		<li>Lassen Sie den Strahl mit einem Paar Linsen (Abbildung 1: L1 und L2). Die Brennweiten der Linsen sollte sorgfältig ausgewählt werden, um den Laserpunkt abgeschnitten durch die Blende von der 2D-EOD zu vermeiden. Clipping ist offensichtlich durch eine Änderung in der Laser-Strahl-Form nach dem Durchlaufen der 2D-EOD. Die Qualität der Kollimation hier ist sehr wichtig, weil Aberrationen durch nachfolgende Linsen verstärkt werden und jede Abweichung wird die Leistung der 2D-EOD Durchbiegung verschlechtern. Im Idealfall lassen Sie den Strahl durch Fokussierung des Strahls zu einem Punkt mindestens 20 m entfernt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Legen Sie eine Lochblende (Abbildung 1: PH) der entsprechenden Größe im Mittelpunkt der ersten Kollimation Linse (Abbildung 1: L1).<ol>
		<li>Wählen Sie eine entsprechend dimensionierte Lochkamera. Die Lochkamera Größe kann anhand der folgenden Berechnung gewählt werden: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> Wo λ ist die Wellenlänge des Lasers, f ist die Brennweite der ersten Linse, und D ist der Eingang Strahldurchmesser.</li>
		<li>Montieren Sie die Lochkamera auf 3D Verschiebetisch, so dass es gerade im Mittelpunkt der ersten Kollimation Linse platziert werden kann.</li>
		<li>Passen Sie die Position für das Loch. Einen Laser-Leistungsmesser nach der Lochkamera und passen Sie die Position der Lochkamera in XYZ, das macht Zähler auslesen zu maximieren. Wenn ein Beugung Ring beobachtet wird, mit einer Iris platziert, bevor die 2D-EOD blockieren.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation von Glan-Thompson-Polarisator<ol>
		<li>Setzen Sie den Glan-Thompson-Polarisator (Abbildung 1: GP) nach der zweiten Linse Kollimation (Abbildung 1: L2) um die Polarisation des Laserstrahls zu reinigen. Drehen Sie den Polarisator um maximale Kraftübertragung mit dem Leistungsmesser zu finden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation von EOD<ol>
		<li>Verwenden Sie 2 EOD (Abbildung 1: EOD1 &amp; EOD2), den Laser in X- und Y-Richtung abzulenken. Maximieren Sie die Laser-Übertragung durch Anpassen der Gier, Neigung und Höhe des jedem EOD.</li>
		<li>Richten Sie die zwei EODs zueinander mit der Ausrichtung Markierung des Herstellers auf der Seite jedes Deflektor.</li>
		<li>Beantragen Sie ein Testmuster an die Steuerung des 2D-EOD, überprüfen Sie die Ausgabe der EOD. Dies kann der Ritter Tour (Abbildung 2) über die nachfolgend beschriebenen FPGA oder eine einfache Sinuswelle von einem Funktionsgenerator zur Verfügung gestellt. Für eine optimale Leistung sollte der Ablenkung durch jede Deflektor parallel zur X oder Y-Richtung des Piezo-Nanopositionierer sein. Diese Richtung wird durch die Winkelrichtung die Deflektoren um die Getriebe-Achse bestimmt. Um die Durchbiegung Richtung drehen ohne bewegliche 2D-EOD, platzieren Sie eine Taube Prism nach 2D-EOD die Durchbiegung Achsen zu den Piezo Nanopositionierer Achsen ausrichten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation von Halbwellen-Platte<ol>
		<li>Legen Sie eine Halbwellen-Platte (Abbildung 1: W1) zwischen den Glan-Thompson-Polarisator (Abbildung 1: GP) und 2D-EOD ausrichten den eingehenden Laser beam Polarisation mit den Achsen der Durchbiegung des 2D-EOD. Eine langen Brennweite Objektiv (300 mm) nach der 2D-EOD und eine sCMOS Kamera im Laserfokus. Als nächstes aktivieren Sie die 2D-EOD, der Ritter Tour beschrieben (Abbildung 2) zu generieren. Drehen Sie die Halbwellen Platte, bis eine gleichmäßig quadratische Laser-Verteilung auf die Kamera beobachtet wird.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation eines Balkens Aufwendung Objektiv und Relais-Linse-paar<ol>
		<li>Legen Sie ein paar Linsen (Abbildung 1: L3 und L4) nach der 2D-EOD, erweitern Sie den Balken um die hintere Öffnung der Objektivlinse zu füllen (Abbildung 1: OL) und ein weiteres paar Linsen (Abbildung 1: L5 und L6), Relais der Brennebene auf das Mikroskopobjektiv. Achten Sie darauf, genügend Raum zwischen diesen beiden Paaren von Linsen zu verlassen, wie der TAG Objektiv zwischen ihnen in einem späteren Schritt installiert werden soll.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installieren Sie das dichroitische Filter, 10/90 Strahlteiler, Fokussierung Objektiv, APD, Objektiv und Fluoreszenz Emission Filter zur Vervollständigung den Erkennung Weg.<ol>
		<li>Den dichroitischen Filter einbauen (Abbildung 1: DC) entsprechend den Laser auf das Objektiv. Richten Sie den Laser gehen Sie geradeaus durch das Zentrum der Objektivlinse mit zwei Schwertlilien auf der Ober- und Unterseite von einer langen Objektiv-Tubus.</li>
		<li>Installieren Sie einen 10/90 Strahlteiler (Abbildung 1: BS) durch die 10 % des Lichtes für die Bildgebung durch eine sCMOS Kamera (siehe unten) und 90 % der durchläuft, der APD für Tracking reflektiert wird.</li>
		<li>Richten Sie die APD. Fokussieren Sie den Laser auf einem Deckgläschen durch das Objektiv. Verwenden Sie die Reflexion aus dem Deckglas, alle nachfolgenden Elemente auszurichten, indem ein Deckglas der Objektive Fokus setzen und überprüfen die Intensität der APD auslesen. Nach den Strahlteiler installieren der APD Fokussierlinse (Abbildung 1: L7) gefolgt von der APD auf einer 3D Übersetzung-Bühne. Positionieren Sie das Objektiv so, dass die Laser-Reflexion aus dem Ziel, durch die Mitte der Linse geht.</li></ol></li></ol>Die APD-Position kann optimiert werden, durch die 3D Position um die Intensität von der Laser-Reflexion auf das Deckglas zu maximieren. Die APD-Position ist an der optimalen Position, wenn eine Bewegung der Detektor Position in eine beliebige Richtung die Intensität verringert.
		<li>Installieren Sie einen Langpass-Fluoreszenz Emission Filter (Abbildung 1: F) vor den Strahlteiler, reflektierte und zerstreute Licht zu entfernen.</li>
	
	
	<li>Installation von der TAG-Linse<ol>
		<li>Legen Sie das TAG Objektiv zwischen den beiden Paaren von Linsen (zwischen Abbildung 1: L4 und L5) so erwähnt und in Abbildung 1dargestellt. Anpassen der Yaw, Pitch, Höhe und Seitenlage derart, dass der Strahl senkrecht durch die Mitte des TAG-Linse geht.</li>
	</ol>
	</li>

2. Probenvorbereitung.
<ol>
	<li>Feste Partikel Vorbereitung<ol>
		<li>Verdünnen Sie 190 nm fluoreszierenden Perlen, ~ 5 × 108 Perlen/mL mit PBS-Puffer. 400 µL-Perlen-Lösung auf einem Deckglas und Mount auf dem Probenhalter der piezoelektrischen Bühne hinzufügen (das Volumen der Perlen hängen von der Probenhalter; der Durchmesser der Probenkammer Halter verwendet hier ist 18 mm). Für die hier verwendeten Perlen werden PBS die Partikel auf dem Deckglas zu hinterlegen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Frei bewegliche Teilchen-Vorbereitung<ol>
		<li>Verdünnen Sie 110 nm fluoreszierenden Perlen, ~ 5 × 108 Perlen/mL mit VE-Wasser. 400 µL-Perlen-Lösung auf einem Deckgläschen hinzufügen und auf der Probenhalter der piezoelektrischen Stufe montieren.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. optimieren Sie Tracking-Parameter
<ol>
	<li>Rasterscan feste Partikel<ol>
		<li>Legen Sie eine feste Partikel Probe am Mikroskop.</li>
		<li>Aktivieren Sie den Laser, Micropositioner Controller, Piezo Nanopositionierer Controller, TAG Objektiv Controller und EOD-Controller. Beachten Sie, dass die Reihenfolge nicht ankommt. Führen Sie die Piezo-Nanopositionierer im geschlossenen Regelkreis.</li>
		<li>Raster scannen die Probe in XYZ mit einer benutzerdefinierten Scan Software (Abbildung S3, Software, die von den Autoren auf Anfrage erhältlich), das treibt die 2D-EOD in einem Ritter Tour (Abbildung 2), sammelt zählt die APD, treibt die piezo Nanopositionierer, und führt Positionsberechnung (Abbildung S2). Die Schrittweite ist 40 nm und die Tastweite ist 2 µm.<ol>
			<li>Um das Deckglas im Mittelpunkt des Ziels zu platzieren, entfernen Sie die Fluoreszenz Emission Filter und verwenden Sie die Reflexion des Lasers aus dem Deckglas zu, um die Signalintensität in Abhängigkeit von der Z-Position der Micropositioner zu maximieren. Nach der Platzierung der Probenmaterials in der Brennebene zurück setzen Sie Fluoreszenz Emission Filter ein.</li>
			<li>Öffnen Sie das Scan-Programm. Stellen Sie Scanbereich und Schrittweite durch Eingabe der Nummer in der "Start", "fertig stellen" und "Schritt ein". Zunächst legen Sie einen großen Scanbereich und Schrittweite, ein Teilchen (z.B. 10 x 10 µm Bereich mit 200 nm Schrittweite) zu finden. Schrumpfen Sie nach der Feststellung der Partikel der Scanbereich und verringern Sie Schrittweite (z.B. 2 x 2 µm Bereich mit 100 nm Schrittweite) zu. Klicken Sie auf "Scan", um führen Sie einen 3D Rasterscan, um den fluoreszierenden Fokus zu finden.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TAG-Objektiv-Einstellungen (siehe auch Abbildung 3)<ol>
		<li>Klicken Sie auf die TAG-Objektiv-Steuerungs-Software. Klicken Sie auf "verbinden", "schalten" sequenziell.</li>
		<li>Um die Ausgangsphase des Trigger-Signals zu ändern, ist es notwendig, ändern Sie den Trigger-Ausgabemodus. Ändern Sie zunächst den Modus von "RGB", "Multiplane" und ändern Sie es zurück. Jetzt kann die Phase geändert (Abb. 3 b).</li>
		<li>Festlegen der Ausgangsphase 0°, 90° und 270 ° sein. Während alle drei Phasen, die den Phasenraum decken verwendet werden können, sind diese drei auch empirisch arbeiten gefunden (Abb. 3 c).</li>
		<li>Wählen Sie die 68.500 Hz-Frequenz-Einstellung.</li>
		<li>Um die optimale Frequenz zu finden ist es oft notwendig, um den Frequenzbereich Suche ändern. Klicken Sie auf "erweitert", "einstellen". Änderung der ' Max. Freq(Hz) "der Spalte 0 von 70.000 Hz 71.500 Hz. Dies kann eingestellt werden, in welchem Frequenzbereich geeignet ist. Klicken Sie auf "Kalibrierung speichern", "Exit Kalibrierung" (Abbildung 3d).</li>
		<li>Um die neue Kalibrierung wirksam zu machen, wechseln Sie die Resonanz auf eine andere Frequenz (z. B. 189.150 Hz) und wechselte dann zurück zu den 68.500 Hz-Frequenz-Einstellung (Abbildung 3e).</li>
		<li>Ändern Sie die Amplitude allmählich auf 35 %. Klicken Sie auf "Sperren Resonanz". Nachdem die Frequenz gesperrt ist, klicken Sie auf "Entsperren Resonanz" (Abbildung 3e). Das TAG-Objektiv ist nun einsatzbereit.</li>
		<li>Kalibrieren, ändern Sie die Parameter, die bei der Schätzung verwendet werden, um die geschätzte Position gleich der realen Position machen, wie in Abbildung 4e, f. Eingabe der Scanbereich von x, y und z und klicken Sie dann auf "Scan" Taste zum Scannen der Probe in XYZ zu bewegen die Partikel über die beweglichen Laserspot. Die Position des Partikels sollten wie durch Laserfokus gescannt wird mit der geschätzten Partikel Position bestimmt durch die Position Schätzung Schleife (Abbildung S1) übereinstimmen. Die Beziehung zwischen dem geschätzten und echte Position (Abbildung 4D) kann geschätzte Position Bilder (Abb. 4f) entnommen werden. Wenn die Positionen nicht einverstanden sind, passen Sie die Werte der Laserposition (Ck) in die Position Schätzung Schleife (Abbildung S1) verwendet.</li>
		<li>Richten Sie TAG Objektiv<ol>
			<li>Wenn der TAG Objektiv Controller deaktiviert ist, gescannt das Raster Partikelbilder (siehe unten), die vor der Installation TAG Objektiv und nach Installation TAG Objektiv identisch aussehen sollte. Als nächstes führen Sie fluoreszierende Partikel Z-Stapel-Scannen durch verschieben das Ziel mit der Z-Nanopositionierer Tune Position und Winkel der TAG Objektiv (Abbildung 4). Optimieren Sie die Position der Linse TAG bis gibt es kein Drift in den Partikel-Bildern in XY-Ebene entlang der Z-Richtung, die erreicht wird, wenn es keine Änderung in der XY-Position des Partikels in Abhängigkeit von der Z-Position (Abbildung 4D). Das Tracking-System ist nach dem Ausrichten des Objektivs TAG einsatzbereit.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation von sCMOS Kamera zur Überwachung der Partikel<ol>
		<li>Installieren Sie eine sCMOS Kamera um Partikel zu visualisieren, während sie verfolgt werden. Installieren Sie die sCMOS erst, nachdem alle Komponenten von der Tracking-System installiert und optimiert haben.</li></ol></li></ol>Laden Sie eine feste fluoreszierende Partikel-Probe auf dem Mikroskop und führen Sie das Tracking-Programm, ein Teilchen in der objektiven fokalen Volumen zu sperren. Installieren Sie dann die 100 mm Brennweite (Abbildung 1: L8) und sCMOS. Einstellen Sie die sCMOS Position, so dass das Bild des Partikels, der kleinsten und hellsten Stelle fokussiert ist.
	
	

(4) in Echtzeit 3D-Tracking von frei diffundierende Nanopartikel
<ol>
	<li>Setzen die 110 nm frei beweglichen Teilchen Probe am Mikroskop.</li>
	<li>Laser, Mikro-Positionierer Controller Piezo Nanopositionierer Controller, TAG Objektiv Controller und EOD Controller einschalten. Führen Sie die Piezo-Nanopositionierer im Open-Loop. Stellen Sie die TAG Objektiv Software gemäß Schritt 3.2.</li>
	<li>Öffnen Sie, und führen Sie die Tracking-Software (verfügbar auf Anfrage von den Autoren). Legen Sie die Position Schätzung Parameter auf die optimierten Werte, die in Abschnitt 3 gefunden wurden.</li>
	<li>Um das Deckglas im Mittelpunkt des Ziels zu platzieren, entfernen Sie die Fluoreszenz Emission Filter und verwenden Sie die Reflexion des Lasers aus dem Deckglas zu, um die Signalintensität in Abhängigkeit von der Z-Position der Micropositioner zu maximieren. Erhöhen Sie nach der Feststellung des Deckglases die Fokus Position 15 µm Laser entfernt das Deckglas und in die Lösung zu konzentrieren. Fluoreszenz Emission Filter wieder einsetzen.</li>
	<li>Die integrierte Steuerung Konstanten festgelegt. Die integrierte Steuerung Konstanten können eingestellt werden, beginnend bei einem niedrigen Wert und langsam erhöhen, bis die Schwingungen in der Partikel Positionsanzeigen gesehen werden können. Sobald Schwingungen zu beobachten sind, festgelegt die ganzheitliche Steuerung konstanten zu 80 % des Wertes der Schwingungen verursacht. Typische Werte werden um 0,012 für XY "integraler Gain" und 0,004 für Z "integralen Verstärkung".</li>
	<li>Die Tracking-Schwellen in 'Track Schwelle' und "Track Minimum" eingestellt und die Tracking-Experiment starten, indem Sie auf "Suchen" und "Auto Track". Die Schwelle für die abschließenden Verfolgung liegt etwas höher als der Hintergrund-Ebene und die Schwelle zur Auslösung von Tracking ist etwa doppelt so hoch als der Hintergrund. Hier die Schwelle zur Auslösung von Tracking 3 kHz und der Schwellenwert für die Beendigung der Flugbahn ist 1,5 kHz.</li>
</ol>

<ol><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5 (5), 417(2008).</li>
<li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044(2011).</li>
<li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339(2009).</li>
<li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Nanoscopy+of+Single+DNA+Molecules+by+Using+Stimulated+Emission+Depletion+%28STED%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED).</a> Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).</li>
<li>Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy+of+a+fluorescent+protein-labeled+organelle+inside+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).</li>
<li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li>
<li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-resolution+3D+visualization+of+the+early+stages+of+cellular+uptake+of+peptide-coated+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles.</a> Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).</li>
<li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+behavior+of+molecules+in+biological+systems%3A+breaking+the+3D+speed+barrier+with+3D+multi-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss%22%5BJournal%5D)">Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy.</a> Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).</li>
<li>Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp0671796">Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking.</a> J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).</li>
<li>Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+a+confocal+microscope+by+single+fluorescent+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles.</a> Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).</li>
<li>Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.2204652">Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901(2006).</li>
<li>Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Resolved%2C+Confocal+Single-Molecule+Tracking+of+Individual+Organic+Dyes+and+Fluorescent+Proteins+in+Three+Dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions.</a> ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).</li>
<li>Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Resolved+Three-Dimensional+Molecular+Tracking+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells.</a> Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).</li>
<li>Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tracking+of+individual+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tracking of individual quantum dots.</a> Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).</li>
<li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+in+a+Feedback+Tracking+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope.</a> Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).</li>
<li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja906979j">Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).</li>
<li>McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+Dot+Photon+Statistics+Measured+by+Three-Dimensional+Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking.</a> Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).</li>
<li>Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li>
<li>Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li>
<li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li>
<li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+comparison+of+particle+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li>
<li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li>
<li>Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-helix+microscope+super-resolves+extended+biological+structures+by+localizing+single+blinking+molecules+in+three+dimensions+with+nanoscale+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision.</a> Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701(2012).</li>
<li>Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional%2C+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li>
<li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.osapublishing.org/optica/abstract.cfm?uri=optica-4-3-367">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li>
<li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606(2017).</li>
<li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li>
<li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics%5BTitle%5D)+AND+%22BIOMEDO%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li>
<li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li>
<li>Wang, Q., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+strategy+for+trapping+single+fluorescent+molecules+in+solution+using+the+ABEL+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap.</a> Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).</li>
<li>Fields, A. P., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+tracking+of+a+Brownian+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Optimal tracking of a Brownian particle.</a> Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Obwohl viele Sorten von 3D Einzelkorn tracking-Methoden in den letzten Jahren entstanden sind, ist robuste Echtzeitverfolgung von high-Speed 3D Diffusion bei niedrigen Photon Zählraten mit einer einfachen Einstellung immer noch eine Herausforderung, die ihre Anwendung auf wichtige biologische Grenzen Probleme. Die 3D-DyPLoT-Methode beschrieben in dieser IP-Adressen diese Herausforderungen in mehrfacher Hinsicht. Erstens sind die Anregung und Erkennung Wege vereinfacht erheblich im Vergleich zu anderen Implementierungen A...

Die Entstehung der modernen bildgebenden Verfahren hat ein Fenster um zu sehen, je mehr detaillierte Struktur der zelluläre Phänomene bis hin zum molekularer Ebene geöffnet. Methoden wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)1,2,3, Foto-aktivierte Lokalisierung Mikroskopie (PALM)4,5,6,7 , strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM)8,9,10,11, und stimulierte Emission Depletion-Mikroskopie (STED)12,13, 14 gegangen weit jenseits der Beugungsgrenze, noch nie dagewesene Detail in die Struktur und Funktion von lebenden Zellen zu liefern. Voll zu verstehen, wie diese Systeme Verhalten erfordert jedoch dynamische Informationen sowie Strukturinformationen. Die oben aufgeführten Höchstauflösung Methoden beinhalten einen Kompromiss zwischen Ortsauflösung und zeitlicher Auflösung, Begrenzung der zeitlichen Präzisions mit der dynamische Prozessen sondiert werden können. Eine Methode, die liefert hochpräzise räumliche und zeitliche Auflösung ist RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Wir unterscheiden hier zwischen traditionellen 3D-SPT30 und RT-3D-SPT. Traditional 3D-SPT erfordert lediglich eine Zeitreihe von dreidimensionalen Bilddaten (die entweder mit einem confocal Mikroskop oder einem Epifluoreszenz Mikroskop erworben werden können Angesichts der richtigen Konfiguration). In traditionellen 3D-SPT sind die Koordinaten des Partikels nach der Datenerfassung entschlossen durch Auffinden der Partikel in jedem Bildstapel und die Standorte in aufeinander folgenden Bänden zu verketten, eine Flugbahn zu schaffen. Für diese Methoden ist die ultimative zeitliche Auflösung durch die volumetrische Bildverarbeitung Rate bestimmt. Für konfokale Mikroskope ist dies leicht in der Größenordnung von Sekunden bis zu zehn Sekunden. Für Epifluoreszenz Methoden, wobei der Strahlengang so manipuliert ist, dass die axiale Lage Informationen extrahiert werden kann, ist die zeitliche Auflösung der Kamera Belichtung oder Auslesen zeitlich begrenzt. Diese Epifluorescent-Methoden sind begrenzt im Bereich über dem axiale Informationen gesammelt werden kann, obwohl die jüngsten Fortschritte bei Fourier Flugzeug Phase Masken Design und adaptive Optik weitet diese reicht bis zu 10 µm oder mehr31,32 , 33 , 34.
Im Gegensatz dazu setzt RT-3D-SPT nicht auf einen 3D-Bild Stapel zu erwerben und die Suche nach Partikel nach der Tat. Stattdessen Standort in Echtzeit Informationen über einzelne Punktmelder extrahiert und Feedback werden effektiv "das Teilchen im fokalen Volumen der Objektivlinse durch den Einsatz von piezoelektrischen Bühne Highspeed sperren". Dies ermöglicht kontinuierliche Messung der Position der Partikel begrenzt nur durch wie viele Photonen gesammelt werden können. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode spektrale Verhör des Partikels, wie es über große Entfernungen bewegt. RT-3D-SPT Kräfte wirksam funktioniert ähnlich wie eine Kraft-freie optische Falle für nanoskalige Objekte, wobei die Partikel kontinuierlich sondiert und in Echtzeit ohne die Notwendigkeit für große Laserleistungen oder optische gemessen. Angesichts der Tatsache, dass RT-3D-SPT für fortlaufende Befragung schnell diffusiven Objekte (bis zu 20 µm2/s)25,29 in drei Dimensionen bei niedrigen Photon zählen Preise20,29Mittel bietet, 35, es soll ein Fenster in schnell oder vorübergehende biologische Prozesse wie intrazelluläre Frachtverkehr, Ligand-Rezeptor-Bindung und die extrazelluläre Dynamik der einzelnen Virionen. Zu diesem Punkt wurde jedoch die Anwendung der RT-3D-SPT beschränkt sich auf die wenigen Gruppen arbeiten, um diese Technologie zu fördern.
Eine Barriere ist die Komplexität des optischen Layouts erforderlich durch RT-3D-SPT-Methoden, die verschieden sind. Für die meisten Methoden ist die optische Rückmeldung durch einen piezoelektrischen Bühne zur Verfügung gestellt. Wie die Teilchen macht kleine Bewegungen in X, Y oder Z, Anzeigen von Einzelpunkt-Detektoren sind in Fehlerfunktionen konvertiert und gefüttert wiederum drehen bewegt sich auf einem piezoelektrischen Nanopositionierer High-Speed-die Probe, die Partikelbewegung effektiv entgegenzuwirken Sperren sie im Ort bezogen auf das Objektiv. Zur Messung von kleiner positioneller Bewegungen in X, Y und Z, entweder mehrere Detektoren (4 oder 5 je nach Implementierung)15,18,21 oder mehrere Erregung Flecken (2-4, desto geringer die angewendet werden, kann wenn eine Lock-in-Verstärker dient zur extrahieren Sie X und Y-Position mit einer rotierenden laser-spot)25,28 gelten. Die Überlappung dieser mehrere Erkennung und Emission Flecken erschweren die Systeme zu richten und zu pflegen.
Hier präsentieren wir eine High-Speed-Ziel gesperrt 3D-SPT-Methode mit einem vereinfachten optischen Design 3D-DyPLoT29genannt. 3D-DyPLoT verwendet ein 2D-EOD und ein TAG Objektiv36,37,38 , um dynamisch ein fokussierte Laserspot durch das Objektiv Brennweite Volumen mit einer hohen Rate (50 kHz XY, 70 kHz Z) bewegen. Kombination von Laser-Fokus-Position und der Photon-Ankunftszeit ermöglicht 3D Position der Partikel schnell auch bei niedrigen Photon Zählraten eingeholt werden. 2D-EOD treibt Laserfokus eines Ritters Tour Muster39 mit einer quadratischen Größe von 1 x 1 µm in der XY-Ebene und die TAG-Linse bewegt Laserfokus in axialer Richtung mit einer Reichweite von 2-4 µm. Die 3D Partikel-Position wird durch eine optimierte Position Schätzung Algorithmus29,40 in 3D erreicht. Die Kontrolle über das 3D dynamisch bewegten Laser spot, Photon beginnend mit der Lawine Fotodiode (APD), Echtzeit-Partikel Positionsberechnung, piezoelektrische Bühne Feedback und Datenaufzeichnung erfolgt auf einem Feld programmierbare Gate Array (FPGA).In diesem Protokoll haben wir beschrieben, wie Sie Schritt für Schritt, einschließlich der optischen Achse, Kalibrierung mit festen Partikeln, 3D-DyPLoT Mikroskop bauen und endlich frei Particle Tracking. Als eine Demonstration wurden 110 nm fluoreszierenden Perlen im Wasser für Minuten hintereinander kontinuierlich verfolgt.
Die hier beschriebene Methode ist eine ideale Wahl für alle Anwendungen wo ist es wünschenswert, eine schnell bewegendes fluoreszierende Sonde bei wenig Licht, einschließlich Viren, Nanopartikeln und Vesikel wie Endosomen kontinuierlich zu überwachen. Im Gegensatz zu bisherigen Methoden gibt es nur eine einzige Anregung und einzelne Erkennung Weg, so dass Ausrichtung und Wartung einfach. Darüber hinaus ermöglicht der großen Erfassungsbereich dieses Mikroskop leicht schnell diffundierende Teilchen, während die Fähigkeit, bei niedrigen Signalpegeln (bis 10 kHz) verfolgen diese Methode ideal für Low-Light Anwendungen29macht abholen.

<table><tbody><tr><td>2D Elektrooptischer Deflektor&nbsp;</td><td>ConOptics</td><td>M310A</td><td>2 erforderliches</td></tr><tr><td>Netzteil für EOD</td><td>ConOptics</td><td>412</td><td>wandelt den FPGA-Ausgang in Hochspannung für EOD</td></tr><tr><td>TAG um Objektiv</td><td>TAG Optics</td><td>TAG 2.0</td><td>Wird verwendet, um den Laser entlang der axialen Richtung abzulenken</td></tr><tr><td>XY piezoelektrischer Nanopositionierer</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-PDQ275HS</td><td>Wird verwendet, um die Probe zu bewegen, um das Partikel im objektiven Brennvolumen zu fixieren;</td></tr><tr><td>Z piezoelektrischer Nanoposiitoner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-OP65HS</td><td>Wird verwendet, um die Objektivlinse zu bewegen, um dem diffundierenden Partikel zu folgen</td></tr><tr><td>Mikropositionierer</td><td>MadCity Labs</td><td>MicroDrive</td><td>Wird verwendet, um Proben grob zu positionieren und auszuwerten</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Zeiss</td><td>PlanApo</td><td>Hohe numerische Apertur für beste Empfindlichkeit erforderlich. 100X, 1,49 NA, M27, Zeiss</td></tr><tr><td>sCMOS-Kamera</td><td>PCO</td><td>pco.edge 4.2</td><td>Zur Überwachung der Teilchenposition</td></tr><tr><td>APD</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-ARQH-15</td><td>Niedrigere Dunkelzahlen vorteilhaft</td></tr><tr><td>Field Programmable Gate Array</td><td>National Instruments</td><td>NI-7852r</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td>Tracking Anregungslaser</td><td>JDSU</td><td>FCD488-30</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L1</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L2</td></tr><tr><td>Lochblende</td><td>ThorLabs</td><td>P75S</td><td>PH</td></tr><tr><td>Glan-Thompson Polarisator</td><td>ThorLabs</td><td>GTH5-A</td><td>GT</td></tr><tr><td>Halbwellenplatte</td><td>ThorLabs</td><td>WPH05M-488</td><td>WP</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-75-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-250-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L5</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L6</td></tr><tr><td>dichroitischer Spiegel</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>DC</td></tr><tr><td>Fluoreszenzemissionsfilter</td><td>Chroma</td><td>D535/40m</td><td>F</td></tr><tr><td>10/90 Strahlteiler</td><td>Chroma</td><td>21012</td><td>BS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>190 nm fluoreszierende Nanopartikel</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/9942</td><td></td></tr><tr><td>110 nm fluoreszierende Nanopartikel</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/10617</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545A</td><td></td></tr><tr><td>Powermeter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Thorlabs</td><td>DCC1545M</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Mad City Labs</td><td>RM21</td><td></td></tr></tbody></table>

ein protokoll für echtzeit-3d einzelkorn-tracking

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Echtzeit-dreidimensionale Einzelkorn tracking (RT-3D-SPT) hat das Potenzial, schnell, 3D Prozesse in zellulären Systemen beleuchten. Obwohl verschiedene RT-3D-SPT-Methoden in den letzten Jahren vorgeschlagen haben, bleibt high-Speed-tracking 3D diffundierende Teilchen bei niedrigen Photon Zählraten eine Herausforderung. Darüber hinaus sind RT-3D-SPT-Setups in der Regel komplex und schwierig zu implementieren, Begrenzung ihrer weitverbreitete Anwendung auf biologische Probleme. Dieses Protokoll stellt ein RT-3D-SPT-System namens 3D dynamische Photon Lokalisierung Tracking (3D-DyPLoT), die Partikel mit hoher diffusiven Geschwindigkeit (bis zu 20 µm2/s) verfolgen können bei niedrigen Photon Zählraten (bis 10 kHz). 3D-DyPLoT beschäftigt einen 2D elektrooptischen Deflektor (2D-EOD) und eine einstellbaren akustischen Farbverlauf (TAG) Objektiv zu fahren, die eine einzige konzentrierte sich laser-Spot dynamisch in 3D. In Kombination mit einer optimierten Position Schätzung Algorithmus, kann 3D-DyPLoT auf einzelne Partikel mit hoher Verfolgungsgeschwindigkeit und hohe Lokalisierung Präzision sperren. Aufgrund der einheitlichen Erregung und einzelne Erkennung Pfad Layout ist 3D-DyPLoT robust und einfach einzurichten. Dieses Protokoll beschreibt die 3D-DyPLoT Schritt für Schritt aufbauen. Erstens ist das optische Layout beschrieben. Als nächstes wird das System kalibriert und optimiert durch Raster eine 190 nm fluoreszierende Perle mit piezoelektrischen Nanopositionierer scannen. Schließlich, um Echtzeit-3D tracking-Fähigkeit zu demonstrieren, werden 110 nm fluoreszierenden Perlen im Wasser verfolgt.

Feste Partikel (Abbildung 4) scannen und frei diffundierende 110 nm fluoreszierende Partikel tracking (Abbildung 5) wurden nach der oben genannten Protokolls durchgeführt. Das Teilchen Scannen erfolgte durch den piezoelektrischen Nanopositionierer und bin Photonen bewegen, während gleichzeitig Berechnung des Partikels Position an jedem Punkt im Scan geschätzt. Der Scan Bild zeigt ein Quadrat von sogar Intensität (<strong class="x...

Dieser Protokolldetails, den Bau und Betrieb eines Echtzeit-3D Einzelkorn Tracking-Mikroskops in der Lage Tracking nanoskalige fluoreszierende Sonden bei hohen diffusiven Geschwindigkeiten und geringen Photon Zählraten.

Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Implementierung eines Echtzeit-3D-Mikroskops zur Verfolgung einzelner Partikel. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass ein einzelnes diffundierendes nanoskaliges Objekt kontinuierlich mit photonenbegrenzter zeitlicher Auflösung überwacht werden kann. Diese Technik kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Virologie zu beantworten, z. B. die Verfolgung eines einzelnen Virions durch den gesamten Infektionsprozess.Bereiten Sie das Gerät auf einem optischen Tisch vor. Dieses Setup ist bereit für die Kalibrierung. Zu den Schlüsselkomponenten gehören ein 488-Nanometer-Festkörperlaser, zwei elektrooptische Deflektoren, die sich entlang des Strahlgangs befinden, eine abstimmbare akustische Gradientenlinse und ein Probentisch mit Mikro- und Nanopositionierern.Dieses Schema des Setups enthält weitere Details. Hier ist der Laserstrahlengang zum Probentisch. Die elektrooptischen Deflektoren und die abstimmbare akustische Linse befinden sich entlang des Strahlwegs.Diese Geräte treiben den Laserpunkt dynamisch am Probentisch an. Photonen aus der Probe werden von einer Avalanche-Fotodiode gezählt. Eine Kamera überwacht die Position des Partikels.Die Position der Probe wird mit Hilfe von Mikro- und Nanocontrollern eingestellt. Ein Field Programmable Gate Array steuert den Laserspot, die Berechnung der Teilchenposition in Echtzeit, die Tischrückmeldung und die Photonenzählung. Es müssen zwei Proben vorbereitet werden.Die erste erfordert 190 Nanometer fluoreszierende Kügelchen, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt sind. Verwenden Sie ein Deckglas, um eine Probe mit fixierten Partikeln vorzubereiten. Geben Sie 400 Mikroliter der Bead-Lösung auf das Deckglas.Stellen Sie nun die Probe der frei beweglichen Partikel her. Es werden 110 Nanometer fluoreszierende Kügelchen benötigt, die in Wasser verdünnt werden. Erstellen Sie eine frei bewegliche Partikelprobe, indem Sie 400 Mikroliter der Lösung auf einen Deckglas geben.Bringen Sie die fixierte Partikelprobe zum Mikroskop, um sie zu montieren. Die Probe befindet sich auf dem XY-Nanopositionierer. Schalten Sie den Laser, den Fotodetektor, die Controller für die Strahllinienelemente und die Positionierer ein.Führen Sie den Piezo-Nano-Positionierer in einem geschlossenen Regelkreis aus. Entfernen Sie anschließend den Fluoreszenzemissionsfilter vor dem Fotodetektor. Variieren Sie dann die Z-Position der Probe mit dem Mikropositionierer.Wenn sich die Position ändert, verwenden Sie den Fotodetektor, um die Intensität der Reflexion des Lasers zu überwachen. Maximieren Sie die Intensität, um die Brennebene der Objektivlinse zu identifizieren. Wenn sich die Probe in der Fokusebene befindet, ersetzen Sie den Fluoreszenzemissionsfilter.Arbeiten Sie nun mit der Computersteuerungssoftware. Verwenden Sie eine benutzerdefinierte Software, um die Probe zu rastern. Stellen Sie zunächst einen großen Scanbereich ein, die Differenz zwischen Start und Ende.Hier beträgt der Bereich 10 Mikrometer in Y und 10 Mikrometer in X. Stellen Sie außerdem eine große Schrittweite in jede Richtung ein. Hier sind es 200 Nanometer. Setzen Sie beide Z-Felder auf die zuvor identifizierte Position der Fokusebene.Wenn Sie auf Scan drücken, wird der Raster-Scan gestartet. Starten Sie den Scan. Die Software steuert die elektrooptischen Deflektoren während einer Nachttour, sammelt Zählungen vom Photodetektor, steuert den Nano-Positionierer und führt Positionsberechnungen durch.Der Scan findet ein Partikel, das in der Software durch eine Plata-Fluoreszenz identifizierbar ist. Für jede Stelle im Scan ermittelt die Software auch Schätzungen der Partikelposition in X und Y relativ zur Mitte des Elektroobjekt-Deflektorscans. Nachdem Sie das Partikel gefunden haben, verkleinern Sie den Scanbereich um das Partikel herum auf zwei Mikrometer in X und Y. Verringern Sie außerdem die Schrittweite für beide auf 100 Nanometer.Fügen Sie einen Scanbereich von zwei Mikrometern in Z-Richtung hinzu, um den Fluoreszenzfokus zu begrenzen. Legen Sie die Schrittweite von Z auf 200 Nanometer fest. Starten Sie den 3D-Rasterscan, um den Fluoreszenzfokus zu ermitteln.Die aus dem Scan erzeugten Daten zeigen die Brennebene, bevor die abstimmbare akustische Gradientenlinse eingeschaltet wird. Fahren Sie mit der abstimmbaren akustischen Linseneinstellung in der Steuerungssoftware fort. Klicken Sie zuerst auf Verbinden und dann auf Einschalten.Gehen Sie zum Abschnitt Puls- und Gating-Steuerung und ändern Sie den Ausgangs-Trigger-Modus von RGB auf Multi-Plane. Ändern Sie es dann wieder in RGB, um die Ausgabephase ändern zu können. Verwenden Sie die Schieberegler, um die Ausgangsphase zwischen null Grad, 90 Grad und 270 Grad einzustellen.Gehen Sie als Nächstes zum Abschnitt Frequenzsteuerung. Wählen Sie dort eine Resonanzfrequenz von 68.500 Hertz. Bewegen Sie sich an den oberen Rand des Bildschirms und klicken Sie auf Erweitert.Wählen Sie dann die Registerkarte Einstellungen. Suchen Sie auf dem neuen Bildschirm die maximale Häufigkeit der Nullspalte. Passen Sie es an, um den Frequenzsuchbereich zu ändern.Klicken Sie auf, Kalibrierung speichern und dann Kalibrierung beenden. Kehren Sie zu den Frequenzreglern zurück und ändern Sie die Resonanzfrequenz. Wechseln Sie sofort wieder auf 68.500 Hertz, damit die Kalibrierung wirksam wird.Verwenden Sie im Abschnitt "Amplitudensteuerung" den Schieberegler, um die Amplitude langsam auf 35 % zu erhöhen. Klicken Sie anschließend auf "Resonanz sperren". Wenn die Frequenz gesperrt ist, klicken Sie auf Resonanz entsperren. Kehren Sie zur Rasterscan-Software zurück.Geben Sie zwei Mikrometer-Scanbereiche ein, die auf das Partikel in X und Y zentriert sind.Verwenden Sie eine Schrittweite von 100 Nanometern. Zentrieren Sie das Partikel in einem Bereich von vier Mikrometern in Z, mit einer Schrittweite von 200 Nanometern. In dem resultierenden Abtastbild ist der Beleuchtungsbereich, der das Partikel darstellt, etwa einen Mikrometer breit.Passen Sie auf dieser Grundlage den Parameter für die XY-Skalierung so an, dass die geschätzten Positionen in X und Y zwischen minus 0,5 und 0,5 Mikrometern liegen. Nach einem ähnlichen Verfahren mit der Z-Skala setzen Sie den Nano-Positionierer auf die Nullposition. Schalten Sie den Nano-Positionierer aus, bevor Sie fortfahren.Ersetzen Sie die fixierte Partikelprobe durch die frei bewegliche Partikelprobe. Stellen Sie dann sicher, dass alle Geräte eingeschaltet sind. Lassen Sie den Piezo-Nano-Positionierer im offenen Regelkreis laufen.Stellen Sie am Computer die abstimmbare Software für akustische Verlaufsgläser wie zuvor ein. Entfernen Sie den Fluoreszenzemissionsfilter aus dem Weg zum Fotodetektor. Finden Sie die Fokusebene, indem Sie die Z-Position der Probe variieren und die Intensität der Laserreflexion über den Deckglas maximieren.Nachdem Sie die Fokusebene gefunden haben, erhöhen Sie die Fokusposition um 15 Mikrometer in die Lösung hinein. Ersetzen Sie den Fluoreszenzemissionsfilter. Öffnen Sie die benutzerdefinierte Tracking-Software.Legen Sie die Parameter für die Positionsschätzung auf die Werte fest, die während der Optimierung gefunden wurden. Stellen Sie nun die integralen Regelkonstanten ein, die die Ansprechgeschwindigkeit des Nano-Positionierers vorgeben. Beginnen Sie mit der X-Konstante.Geben Sie einen niedrigen Wert ein und erhöhen Sie ihn langsam. Wenn Schwingungen in der Anzeige der Partikelposition beginnen, notieren Sie sich den Wert der Regelkonstante. Reduzieren Sie die integrale Regelkonstante auf etwa 70 % ihres Wertes bei einsetzender Schwingung.Wiederholen Sie die Schritte mit den Steuerkonstanten Y und Z. Stellen Sie den Trigger so ein, dass die Spurschwelle auf drei Kilohertz verfolgt wird. Stellen Sie das Track-Minimum, den Trigger zum Beenden des Trackings, auf 1,5 Kilohertz ein.Starten Sie das Experiment, indem Sie auf Suchen und dann auf Automatische Nachverfolgung klicken. Dieser Film zeigt das Ergebnis der Verwendung des dreidimensionalen, dynamischen Photonenlokalisierungs-Tracking-Mikroskops, um die Diffusionsbewegung eines 110 Nanometer großen fluoreszierenden Nanopartikels in Wasser zu verfolgen. Die Position des Partikels, gemessen mit der Positionsauslesung des Nanopositionierers, wird auf den 3D-Achsen angezeigt.Der Einschub ist das Auslesen der wissenschaftlichen Seemooskamera. Es zeigt, dass das Partikel vom Tracking-System im Fokusvolumen festgehalten wird. Das Teilchen wurde mehr als zwei Minuten lang verfolgt und seine Position aufgezeichnet.Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als 50 Minuten durchgeführt werden, wenn das System richtig ausgerichtet und die Kalibrierungsparameter eingestellt sind. Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Wirkstoffverabreichung helfen, die Wege der Internalisierung und des Transports von zellulärer Fracht zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein 3D-Einzelteilchen-Tracking-Mikroskop mit Nullzeit bedient.

a-protocol-for-real-time-3d-single-particle-tracking

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und zu verfolgen und dadurch die laterale Beweglichkeit der Rezeptoren, die Größe von Rezeptorkomplexen sowie die Visualisierung transienter Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu analysieren. Dieses Protokoll kann auf andere Membranproteine ausgeweitet werden.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

In diesem Videoprotokoll verfolgen wir - mit hoher Geschwindigkeit und in drei Dimensionen - fluoreszenzmarkierte Lysosomen in lebenden Zellen, mit der orbitalen Tracking-Methode in einem modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

Eine dreidimensionale Particle Tracking Velocimetry (3D-PTV-System) auf der Basis einer Hochgeschwindigkeitskamera mit einem Vier-view Teiler wird hier beschrieben. Die Technik wird in der Nähe von zehn Durchmessern stromabwärts bei Reynolds - Zahl Re ≈ 7,000 auf einen Strahlstrom von einem kreisförmigen Rohr aufgebracht.

Dreidimensionale Particle Tracking Velocimetry für Turbulence Anwendungen: Fall eines Jet Fluss

Eine Methode zur Herstellung katalytisch aktiver Januskolloide, die in Flüssigkeiten "schwimmen" und ihre 3D-Trajektorien bestimmen können, wird vorgestellt.

Vorbereitung und 3D-Tracking von Catalytic Schwimmgeräte

Das Manuskript stellt ein Protokoll für die Leitung von Bett-Last-Sediment-Transport-Experimenten dar, bei denen die bewegten Partikel durch Bildanalyse verfolgt werden. Die experimentelle Einrichtung, die Vorgehensweisen für die Durchführung der Realisierung und die Datenverarbeitung und schließlich werden hier einige Proof-of-Concept-Ergebnisse vorgestellt.

Bildbasierte Lagrange-Partikel-Tracking in Bettlasten-Experimenten

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die einzelnen Partikels tracking Bildanalyse, die quantitative Bewertung des Diffusionskoeffizienten, Arten von Bewegung und Cluster-Größen der einzelnen Partikel erkannt durch Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht.

Bildverarbeitungs-Protokoll für die Analyse der Diffusion und Cluster-Größe von Membranrezeptoren durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Temperatur zu verwenden, um die Fließgeschwindigkeiten dreidimensionaler aktiver Flüssigkeiten zu steuern. Der Vorteil dieser Methode ermöglicht nicht nur die Regelung der Durchflussgeschwindigkeiten vor Ort, sondern auch eine dynamische Steuerung, wie z. B. die regelmäßige Abstimmung der Durchflussgeschwindigkeiten nach oben und unten.

Steuerung der Durchflussgeschwindigkeiten von Mikrotubuli-basierten 3D-Aktivflüssigkeiten mithilfe der Temperatur

Dieses Protokoll beschreibt einen iSCAT-basierten Bildverarbeitungs- und Einzelpartikel-Tracking-Ansatz, der die gleichzeitige Untersuchung der Molekülmasse und des diffusiven Verhaltens von Makromolekülen ermöglicht, die mit Lipidmembranen interagieren. Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Probenvorbereitung, die Konvertierung von Masse in Kontrast, die Filmaufnahme und die Nachbearbeitung werden zusammen mit Anweisungen bereitgestellt, um mögliche Fallstricke zu vermeiden.

Massensensitive Partikelverfolgung zur Charakterisierung der membranassoziierten Makromoleküldynamik

Es wurde gezeigt, dass viele intrinsisch ungeordnete Proteine an der Bildung hochdynamischer biomolekularer Kondensate beteiligt sind, ein Verhalten, das für zahlreiche zelluläre Prozesse wichtig ist. Hier stellen wir eine auf Einzelmolekül-Bildgebung basierende Methode zur Quantifizierung der Dynamik vor, mit der Proteine in biomolekularen Kondensaten in lebenden Zellen miteinander interagieren.

Einzelmolekülmessung der Proteininteraktionsdynamik in biomolekularen Kondensaten

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Beschreibung, wie Proben für die Tracking von Einzelproteinen in festgestützten Lipiddoppelschichten erstellt werden können. Es erklärt außerdem ein einfaches Fluoreszenzmikroskop mit Einzelmolekülempfindlichkeit und hoher Bildrate. Abschließend skizzieren wir das Verfahren zur Extraktion von Einzelprotein-Trajektorien.

Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie

Lernen Sie die Implementierung eines Echtzeit-3D-Einzelteilchen-Tracking-Mikroskops zur kontinuierlichen Beobachtung diffundierender Nanopartikel. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung einzelner Viren während des Infektionsprozesses.

Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking

Weitere Videos entdecken