Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking
3. Januar 2018
Dieser Protokolldetails, den Bau und Betrieb eines Echtzeit-3D Einzelkorn Tracking-Mikroskops in der Lage Tracking nanoskalige fluoreszierende Sonden bei hohen diffusiven Geschwindigkeiten und geringen Photon Zählraten.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Implementierung eines Echtzeit-3D-Mikroskops zur Verfolgung einzelner Partikel. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass ein einzelnes diffundierendes nanoskaliges Objekt kontinuierlich mit photonenbegrenzter zeitlicher Auflösung überwacht werden kann. Diese Technik kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Virologie zu beantworten, z. B. die Verfolgung eines einzelnen Virions durch den gesamten Infektionsprozess.
Bereiten Sie das Gerät auf einem optischen Tisch vor. Dieses Setup ist bereit für die Kalibrierung. Zu den Schlüsselkomponenten gehören ein 488-Nanometer-Festkörperlaser, zwei elektrooptische Deflektoren, die sich entlang des Strahlgangs befinden, eine abstimmbare akustische Gradientenlinse und ein Probentisch mit Mikro- und Nanopositionierern.
Dieses Schema des Setups enthält weitere Details. Hier ist der Laserstrahlengang zum Probentisch. Die elektrooptischen Deflektoren und die abstimmbare akustische Linse befinden sich entlang des Strahlwegs.
Diese Geräte treiben den Laserpunkt dynamisch am Probentisch an. Photonen aus der Probe werden von einer Avalanche-Fotodiode gezählt. Eine Kamera überwacht die Position des Partikels.
Die Position der Probe wird mit Hilfe von Mikro- und Nanocontrollern eingestellt. Ein Field Programmable Gate Array steuert den Laserspot, die Berechnung der Teilchenposition in Echtzeit, die Tischrückmeldung und die Photonenzählung. Es müssen zwei Proben vorbereitet werden.
Die erste erfordert 190 Nanometer fluoreszierende Kügelchen, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt sind. Verwenden Sie ein Deckglas, um eine Probe mit fixierten Partikeln vorzubereiten. Geben Sie 400 Mikroliter der Bead-Lösung auf das Deckglas.
Stellen Sie nun die Probe der frei beweglichen Partikel her. Es werden 110 Nanometer fluoreszierende Kügelchen benötigt, die in Wasser verdünnt werden. Erstellen Sie eine frei bewegliche Partikelprobe, indem Sie 400 Mikroliter der Lösung auf einen Deckglas geben.
Bringen Sie die fixierte Partikelprobe zum Mikroskop, um sie zu montieren. Die Probe befindet sich auf dem XY-Nanopositionierer. Schalten Sie den Laser, den Fotodetektor, die Controller für die Strahllinienelemente und die Positionierer ein.
Führen Sie den Piezo-Nano-Positionierer in einem geschlossenen Regelkreis aus. Entfernen Sie anschließend den Fluoreszenzemissionsfilter vor dem Fotodetektor. Variieren Sie dann die Z-Position der Probe mit dem Mikropositionierer.
Wenn sich die Position ändert, verwenden Sie den Fotodetektor, um die Intensität der Reflexion des Lasers zu überwachen. Maximieren Sie die Intensität, um die Brennebene der Objektivlinse zu identifizieren. Wenn sich die Probe in der Fokusebene befindet, ersetzen Sie den Fluoreszenzemissionsfilter.
Arbeiten Sie nun mit der Computersteuerungssoftware. Verwenden Sie eine benutzerdefinierte Software, um die Probe zu rastern. Stellen Sie zunächst einen großen Scanbereich ein, die Differenz zwischen Start und Ende.
Hier beträgt der Bereich 10 Mikrometer in Y und 10 Mikrometer in X. Stellen Sie außerdem eine große Schrittweite in jede Richtung ein. Hier sind es 200 Nanometer. Setzen Sie beide Z-Felder auf die zuvor identifizierte Position der Fokusebene.
Wenn Sie auf Scan drücken, wird der Raster-Scan gestartet. Starten Sie den Scan. Die Software steuert die elektrooptischen Deflektoren während einer Nachttour, sammelt Zählungen vom Photodetektor, steuert den Nano-Positionierer und führt Positionsberechnungen durch.
Der Scan findet ein Partikel, das in der Software durch eine Plata-Fluoreszenz identifizierbar ist. Für jede Stelle im Scan ermittelt die Software auch Schätzungen der Partikelposition in X und Y relativ zur Mitte des Elektroobjekt-Deflektorscans. Nachdem Sie das Partikel gefunden haben, verkleinern Sie den Scanbereich um das Partikel herum auf zwei Mikrometer in X und Y. Verringern Sie außerdem die Schrittweite für beide auf 100 Nanometer.
Fügen Sie einen Scanbereich von zwei Mikrometern in Z-Richtung hinzu, um den Fluoreszenzfokus zu begrenzen. Legen Sie die Schrittweite von Z auf 200 Nanometer fest. Starten Sie den 3D-Rasterscan, um den Fluoreszenzfokus zu ermitteln.
Die aus dem Scan erzeugten Daten zeigen die Brennebene, bevor die abstimmbare akustische Gradientenlinse eingeschaltet wird. Fahren Sie mit der abstimmbaren akustischen Linseneinstellung in der Steuerungssoftware fort. Klicken Sie zuerst auf Verbinden und dann auf Einschalten.
Gehen Sie zum Abschnitt Puls- und Gating-Steuerung und ändern Sie den Ausgangs-Trigger-Modus von RGB auf Multi-Plane. Ändern Sie es dann wieder in RGB, um die Ausgabephase ändern zu können. Verwenden Sie die Schieberegler, um die Ausgangsphase zwischen null Grad, 90 Grad und 270 Grad einzustellen.
Gehen Sie als Nächstes zum Abschnitt Frequenzsteuerung. Wählen Sie dort eine Resonanzfrequenz von 68.500 Hertz. Bewegen Sie sich an den oberen Rand des Bildschirms und klicken Sie auf Erweitert.
Wählen Sie dann die Registerkarte Einstellungen. Suchen Sie auf dem neuen Bildschirm die maximale Häufigkeit der Nullspalte. Passen Sie es an, um den Frequenzsuchbereich zu ändern.
Klicken Sie auf, Kalibrierung speichern und dann Kalibrierung beenden. Kehren Sie zu den Frequenzreglern zurück und ändern Sie die Resonanzfrequenz. Wechseln Sie sofort wieder auf 68.500 Hertz, damit die Kalibrierung wirksam wird.
Verwenden Sie im Abschnitt "Amplitudensteuerung" den Schieberegler, um die Amplitude langsam auf 35 % zu erhöhen. Klicken Sie anschließend auf "Resonanz sperren". Wenn die Frequenz gesperrt ist, klicken Sie auf Resonanz entsperren. Kehren Sie zur Rasterscan-Software zurück.
Geben Sie zwei Mikrometer-Scanbereiche ein, die auf das Partikel in X und Y zentriert sind.Verwenden Sie eine Schrittweite von 100 Nanometern. Zentrieren Sie das Partikel in einem Bereich von vier Mikrometern in Z, mit einer Schrittweite von 200 Nanometern. In dem resultierenden Abtastbild ist der Beleuchtungsbereich, der das Partikel darstellt, etwa einen Mikrometer breit.
Passen Sie auf dieser Grundlage den Parameter für die XY-Skalierung so an, dass die geschätzten Positionen in X und Y zwischen minus 0,5 und 0,5 Mikrometern liegen. Nach einem ähnlichen Verfahren mit der Z-Skala setzen Sie den Nano-Positionierer auf die Nullposition. Schalten Sie den Nano-Positionierer aus, bevor Sie fortfahren.
Ersetzen Sie die fixierte Partikelprobe durch die frei bewegliche Partikelprobe. Stellen Sie dann sicher, dass alle Geräte eingeschaltet sind. Lassen Sie den Piezo-Nano-Positionierer im offenen Regelkreis laufen.
Stellen Sie am Computer die abstimmbare Software für akustische Verlaufsgläser wie zuvor ein. Entfernen Sie den Fluoreszenzemissionsfilter aus dem Weg zum Fotodetektor. Finden Sie die Fokusebene, indem Sie die Z-Position der Probe variieren und die Intensität der Laserreflexion über den Deckglas maximieren.
Nachdem Sie die Fokusebene gefunden haben, erhöhen Sie die Fokusposition um 15 Mikrometer in die Lösung hinein. Ersetzen Sie den Fluoreszenzemissionsfilter. Öffnen Sie die benutzerdefinierte Tracking-Software.
Legen Sie die Parameter für die Positionsschätzung auf die Werte fest, die während der Optimierung gefunden wurden. Stellen Sie nun die integralen Regelkonstanten ein, die die Ansprechgeschwindigkeit des Nano-Positionierers vorgeben. Beginnen Sie mit der X-Konstante.
Geben Sie einen niedrigen Wert ein und erhöhen Sie ihn langsam. Wenn Schwingungen in der Anzeige der Partikelposition beginnen, notieren Sie sich den Wert der Regelkonstante. Reduzieren Sie die integrale Regelkonstante auf etwa 70 % ihres Wertes bei einsetzender Schwingung.
Wiederholen Sie die Schritte mit den Steuerkonstanten Y und Z. Stellen Sie den Trigger so ein, dass die Spurschwelle auf drei Kilohertz verfolgt wird. Stellen Sie das Track-Minimum, den Trigger zum Beenden des Trackings, auf 1,5 Kilohertz ein.
Starten Sie das Experiment, indem Sie auf Suchen und dann auf Automatische Nachverfolgung klicken. Dieser Film zeigt das Ergebnis der Verwendung des dreidimensionalen, dynamischen Photonenlokalisierungs-Tracking-Mikroskops, um die Diffusionsbewegung eines 110 Nanometer großen fluoreszierenden Nanopartikels in Wasser zu verfolgen. Die Position des Partikels, gemessen mit der Positionsauslesung des Nanopositionierers, wird auf den 3D-Achsen angezeigt.
Der Einschub ist das Auslesen der wissenschaftlichen Seemooskamera. Es zeigt, dass das Partikel vom Tracking-System im Fokusvolumen festgehalten wird. Das Teilchen wurde mehr als zwei Minuten lang verfolgt und seine Position aufgezeichnet.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als 50 Minuten durchgeführt werden, wenn das System richtig ausgerichtet und die Kalibrierungsparameter eingestellt sind. Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Wirkstoffverabreichung helfen, die Wege der Internalisierung und des Transports von zellulärer Fracht zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein 3D-Einzelteilchen-Tracking-Mikroskop mit Nullzeit bedient.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung eines Echtzeit-3D-Mikroskops zur Einzelpartikelverfolgung, das zur Überwachung fluoreszierender Sonden auf Nanoskala konzipiert ist. Diese Technik ermöglicht die kontinuierliche Beobachtung einzelner diffundierender Objekte, selbst unter photonengeschwächten Bedingungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikroskopie
- Einzelpartikel-Tracking
- Virologie
Hintergrund
- Die Echtzeitverfolgung von nanoskaligen Teilchen ist in zahlreichen wissenschaftlichen Bereichen von entscheidender Bedeutung.
- Das Verständnis der Dynamik einzelner Virionen kann Einblicke in Infektionsprozesse ermöglichen.
- Diese Technik verbessert die Fähigkeit, Teilchen bei hohen Diffusionsgeschwindigkeiten zu untersuchen.
- Photonenzähllimitierungen werden durch fortschrittliche optische Aufbauten adressiert.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Mikroskops, das einzelne Teilchen in Echtzeit verfolgen kann.
- Unterstützung der Untersuchung von Virusinfektionen durch die Beobachtung einzelner Virionen.
- Verbesserung der zeitlichen Auflösung bei der Verfolgung nanoskaliger Objekte.
Verwendete Methoden
- Aufbau eines 3D-Einzelpartikel-Tracking-Mikroskops.
- Verwendung eines 488 Nanometer Festkörperlaser.
- Integration von elektrooptischen Ablenkern und einer abstimmbaren akustischen Gradientenlinse.
- Kalibrierung der Apparatur auf einem optischen Tisch mit präziser Positionierung.
Hauptergebnisse
- Das Mikroskop verfolgt erfolgreich fluoreszierende Nanoprobe.
- Nachgewiesene Fähigkeit, Partikel bei niedrigen Photonen-Zählraten zu überwachen.
- Ermöglichte die kontinuierliche Beobachtung einzelner Virionen während der Infektion.
- Lieferte Einblicke in die Dynamik viraler Prozesse.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll stellt eine robuste Methode zur Echtzeit-Partikelverfolgung bereit.
- Es eröffnet neue Forschungsansätze in der Virologie und verwandten Gebieten.
- Die Technik kann unser Verständnis des viralen Verhaltens erheblich verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Das Echtzeit-3D-Einzelteilchen-Tracking ermöglicht die kontinuierliche Beobachtung von nanoskaligen Objekten unter photonengeschwächten Bedingungen und schließt damit eine entscheidende Lücke beim Nachweis schneller, dreidimensionaler zellulärer Prozesse. Diese Fähigkeit unterstützt die mechanistische Risikominimierung in der frühen Forschung, indem sie hochauflösende dynamische Daten zu molekularen Wechselwirkungen und Transportwegen bereitstellt. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung und Lead-Identifizierung, indem sie quantitative, reproduzierbare raumzeitliche Daten liefert, die für fundierte Go/No-Go-Entscheidungen in der Arzneimittelabgabe und Virologieforschung unerlässlich sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Verfolgung einzelner Virionen oder Nanopartikel während des Infektionsprozesses mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.
- Operationaler Wert: Bietet funktionelle Zielstrukturnachweise durch direkte Beobachtung molekularer Dynamiken in nahezu nativen Umgebungen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung durch die Generierung quantitativer Daten zu Partikeldiffusion, Bindung und Transportkinetik unter physiologisch relevanten Bedingungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert quantitative Messungen der abhängigen Variablen (Position, Trajektorie, Diffusionskoeffizient), die für die Standardisierung von Assays und die Bestätigung von Hits unerlässlich sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Herstellung validierter biologischer Systeme für nachgeschaltete Screening-Verfahren durch präzise 3D-Lokalisierung und Verfolgung fluoreszierender Sonden.
- Skalierbarkeit: Unterstützt die Wiederverwendung der Plattform durch ein robustes Einzelanregungs- und Einzeldetektionslayout sowie kalibrierte elektro-optische und akustische Gradientenlinsensteuerung.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckung und präklinische Forschung, indem sie die Echtzeitbeobachtung der zellulären Aufnahme von Frachtstoffen und der damit verbundenen Transportwege ermöglicht, die für die Arzneimittelabgabe relevant sind.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Verringert die Unschärfe bei Modellen zum viralen Eintritt und zum intrazellulären Transport durch die direkte Visualisierung des Verhaltens einzelner Partikel in Lösung.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem sie reproduzierbare, hochpräzise Daten zum Verhalten von Nanopartikeln unter Bedingungen geringer Photonenflussdichte liefert.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung über die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten bis hin zur präklinischen Validierung, insbesondere für Studien, die eine dynamische, nanoskalige Auflösung in drei Dimensionen erfordern.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Wegen, indem sie eine kontinuierliche Verfolgung einzelner Partikel im 3D-Raum unter physiologisch nachgebildeten Bedingungen ermöglicht.
- Screening: Verbessert die Bereitschaft von Assays durch reproduzierbare Lokalisierung und Verfolgung von Partikeln und erleichtert so die zuverlässige Bewertung von Verbindungen oder Nanopartikeln.
- Analytik: Erzeugt quantitative Ergebnisse (Position, Geschwindigkeit, Einschluss), die einen objektiven Vergleich experimenteller Bedingungen und therapeutischer Kandidaten ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem sie Arzneimittelabgabewege und die Dynamik viraler Infektionen in biologisch relevanten Systemen modelliert.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattformfunktion aufgrund ihres modularen optischen Aufbaus, des Kalibrierungsprotokolls und der Anpassungsfähigkeit an verschiedene Probentypen und Verfolgungsziele.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in nanoskaligen biologischen Prozessen verringert werden.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch kalibrierte Raster-Scanning-Verfahren, Algorithmen zur Positionsabschätzung und rückgekoppelte Nano-Positionierung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz und verringert biologische Risiken in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien, indem frühzeitige, datenbasierte Entscheidungen zur Arzneistofftauglichkeit und zur Durchführbarkeit von Wirkstoffabgabemechanismen ermöglicht werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung durch quantitative, hochauflösende Verlaufsdaten, die die Kriterien für die Weiterentwicklung in der Arzneimittelabgabe und antiviralen Wirkstoffentwicklung beeinflussen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in optischer Ausrichtung, Lasersicherheit und Echtzeit-Regelungssystemen, einschließlich FPGA-basierter Rückkopplungsschleifen.
- Basiert auf spezialisierten Messgeräten: 488-nm-Festkörperlaser, 2D elektro-optische Ablenker, akustisch abstimmbare Gradientenlinse, Avalanche-Photodioden und Nano-Positionierstufen.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über Teams hinweg hinsichtlich Kalibrierprotokollen, Parametern der Positionsbestimmung und Abstimmung der integralen Reglerkonstanten zwischen verschiedenen Anwendern und Laboren.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Übergang von fixierten Kügelchenproben zu frei beweglichen Teilchen in viskosen oder komplexen biologischen Medien.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Empfindlichkeit gegenüber Photonen-Zählraten und die Notwendigkeit einer sorgfältigen Optimierung der Verfolgungsschwellen (z. B. 3 kHz Start, 1,5 kHz Ende), um bei schwachen Signalen die Verfolgung aufrechtzuerhalten.
