Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking
January 3rd, 2018
Dieser Protokolldetails, den Bau und Betrieb eines Echtzeit-3D Einzelkorn Tracking-Mikroskops in der Lage Tracking nanoskalige fluoreszierende Sonden bei hohen diffusiven Geschwindigkeiten und geringen Photon Zählraten.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Implementierung eines Echtzeit-3D-Mikroskops zur Verfolgung einzelner Partikel. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass ein einzelnes diffundierendes nanoskaliges Objekt kontinuierlich mit photonenbegrenzter zeitlicher Auflösung überwacht werden kann. Diese Technik kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Virologie zu beantworten, z. B. die Verfolgung eines einzelnen Virions durch den gesamten Infektionsprozess.
Bereiten Sie das Gerät auf einem optischen Tisch vor. Dieses Setup ist bereit für die Kalibrierung. Zu den Schlüsselkomponenten gehören ein 488-Nanometer-Festkörperlaser, zwei elektrooptische Deflektoren, die sich entlang des Strahlgangs befinden, eine abstimmbare akustische Gradientenlinse und ein Probentisch mit Mikro- und Nanopositionierern.
Dieses Schema des Setups enthält weitere Details. Hier ist der Laserstrahlengang zum Probentisch. Die elektrooptischen Deflektoren und die abstimmbare akustische Linse befinden sich entlang des Strahlwegs.
Diese Geräte treiben den Laserpunkt dynamisch am Probentisch an. Photonen aus der Probe werden von einer Avalanche-Fotodiode gezählt. Eine Kamera überwacht die Position des Partikels.
Die Position der Probe wird mit Hilfe von Mikro- und Nanocontrollern eingestellt. Ein Field Programmable Gate Array steuert den Laserspot, die Berechnung der Teilchenposition in Echtzeit, die Tischrückmeldung und die Photonenzählung. Es müssen zwei Proben vorbereitet werden.
Die erste erfordert 190 Nanometer fluoreszierende Kügelchen, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt sind. Verwenden Sie ein Deckglas, um eine Probe mit fixierten Partikeln vorzubereiten. Geben Sie 400 Mikroliter der Bead-Lösung auf das Deckglas.
Stellen Sie nun die Probe der frei beweglichen Partikel her. Es werden 110 Nanometer fluoreszierende Kügelchen benötigt, die in Wasser verdünnt werden. Erstellen Sie eine frei bewegliche Partikelprobe, indem Sie 400 Mikroliter der Lösung auf einen Deckglas geben.
Bringen Sie die fixierte Partikelprobe zum Mikroskop, um sie zu montieren. Die Probe befindet sich auf dem XY-Nanopositionierer. Schalten Sie den Laser, den Fotodetektor, die Controller für die Strahllinienelemente und die Positionierer ein.
Führen Sie den Piezo-Nano-Positionierer in einem geschlossenen Regelkreis aus. Entfernen Sie anschließend den Fluoreszenzemissionsfilter vor dem Fotodetektor. Variieren Sie dann die Z-Position der Probe mit dem Mikropositionierer.
Wenn sich die Position ändert, verwenden Sie den Fotodetektor, um die Intensität der Reflexion des Lasers zu überwachen. Maximieren Sie die Intensität, um die Brennebene der Objektivlinse zu identifizieren. Wenn sich die Probe in der Fokusebene befindet, ersetzen Sie den Fluoreszenzemissionsfilter.
Arbeiten Sie nun mit der Computersteuerungssoftware. Verwenden Sie eine benutzerdefinierte Software, um die Probe zu rastern. Stellen Sie zunächst einen großen Scanbereich ein, die Differenz zwischen Start und Ende.
Hier beträgt der Bereich 10 Mikrometer in Y und 10 Mikrometer in X. Stellen Sie außerdem eine große Schrittweite in jede Richtung ein. Hier sind es 200 Nanometer. Setzen Sie beide Z-Felder auf die zuvor identifizierte Position der Fokusebene.
Wenn Sie auf Scan drücken, wird der Raster-Scan gestartet. Starten Sie den Scan. Die Software steuert die elektrooptischen Deflektoren während einer Nachttour, sammelt Zählungen vom Photodetektor, steuert den Nano-Positionierer und führt Positionsberechnungen durch.
Der Scan findet ein Partikel, das in der Software durch eine Plata-Fluoreszenz identifizierbar ist. Für jede Stelle im Scan ermittelt die Software auch Schätzungen der Partikelposition in X und Y relativ zur Mitte des Elektroobjekt-Deflektorscans. Nachdem Sie das Partikel gefunden haben, verkleinern Sie den Scanbereich um das Partikel herum auf zwei Mikrometer in X und Y. Verringern Sie außerdem die Schrittweite für beide auf 100 Nanometer.
Fügen Sie einen Scanbereich von zwei Mikrometern in Z-Richtung hinzu, um den Fluoreszenzfokus zu begrenzen. Legen Sie die Schrittweite von Z auf 200 Nanometer fest. Starten Sie den 3D-Rasterscan, um den Fluoreszenzfokus zu ermitteln.
Die aus dem Scan erzeugten Daten zeigen die Brennebene, bevor die abstimmbare akustische Gradientenlinse eingeschaltet wird. Fahren Sie mit der abstimmbaren akustischen Linseneinstellung in der Steuerungssoftware fort. Klicken Sie zuerst auf Verbinden und dann auf Einschalten.
Gehen Sie zum Abschnitt Puls- und Gating-Steuerung und ändern Sie den Ausgangs-Trigger-Modus von RGB auf Multi-Plane. Ändern Sie es dann wieder in RGB, um die Ausgabephase ändern zu können. Verwenden Sie die Schieberegler, um die Ausgangsphase zwischen null Grad, 90 Grad und 270 Grad einzustellen.
Gehen Sie als Nächstes zum Abschnitt Frequenzsteuerung. Wählen Sie dort eine Resonanzfrequenz von 68.500 Hertz. Bewegen Sie sich an den oberen Rand des Bildschirms und klicken Sie auf Erweitert.
Wählen Sie dann die Registerkarte Einstellungen. Suchen Sie auf dem neuen Bildschirm die maximale Häufigkeit der Nullspalte. Passen Sie es an, um den Frequenzsuchbereich zu ändern.
Klicken Sie auf, Kalibrierung speichern und dann Kalibrierung beenden. Kehren Sie zu den Frequenzreglern zurück und ändern Sie die Resonanzfrequenz. Wechseln Sie sofort wieder auf 68.500 Hertz, damit die Kalibrierung wirksam wird.
Verwenden Sie im Abschnitt "Amplitudensteuerung" den Schieberegler, um die Amplitude langsam auf 35 % zu erhöhen. Klicken Sie anschließend auf "Resonanz sperren". Wenn die Frequenz gesperrt ist, klicken Sie auf Resonanz entsperren. Kehren Sie zur Rasterscan-Software zurück.
Geben Sie zwei Mikrometer-Scanbereiche ein, die auf das Partikel in X und Y zentriert sind.Verwenden Sie eine Schrittweite von 100 Nanometern. Zentrieren Sie das Partikel in einem Bereich von vier Mikrometern in Z, mit einer Schrittweite von 200 Nanometern. In dem resultierenden Abtastbild ist der Beleuchtungsbereich, der das Partikel darstellt, etwa einen Mikrometer breit.
Passen Sie auf dieser Grundlage den Parameter für die XY-Skalierung so an, dass die geschätzten Positionen in X und Y zwischen minus 0,5 und 0,5 Mikrometern liegen. Nach einem ähnlichen Verfahren mit der Z-Skala setzen Sie den Nano-Positionierer auf die Nullposition. Schalten Sie den Nano-Positionierer aus, bevor Sie fortfahren.
Ersetzen Sie die fixierte Partikelprobe durch die frei bewegliche Partikelprobe. Stellen Sie dann sicher, dass alle Geräte eingeschaltet sind. Lassen Sie den Piezo-Nano-Positionierer im offenen Regelkreis laufen.
Stellen Sie am Computer die abstimmbare Software für akustische Verlaufsgläser wie zuvor ein. Entfernen Sie den Fluoreszenzemissionsfilter aus dem Weg zum Fotodetektor. Finden Sie die Fokusebene, indem Sie die Z-Position der Probe variieren und die Intensität der Laserreflexion über den Deckglas maximieren.
Nachdem Sie die Fokusebene gefunden haben, erhöhen Sie die Fokusposition um 15 Mikrometer in die Lösung hinein. Ersetzen Sie den Fluoreszenzemissionsfilter. Öffnen Sie die benutzerdefinierte Tracking-Software.
Legen Sie die Parameter für die Positionsschätzung auf die Werte fest, die während der Optimierung gefunden wurden. Stellen Sie nun die integralen Regelkonstanten ein, die die Ansprechgeschwindigkeit des Nano-Positionierers vorgeben. Beginnen Sie mit der X-Konstante.
Geben Sie einen niedrigen Wert ein und erhöhen Sie ihn langsam. Wenn Schwingungen in der Anzeige der Partikelposition beginnen, notieren Sie sich den Wert der Regelkonstante. Reduzieren Sie die integrale Regelkonstante auf etwa 70 % ihres Wertes bei einsetzender Schwingung.
Wiederholen Sie die Schritte mit den Steuerkonstanten Y und Z. Stellen Sie den Trigger so ein, dass die Spurschwelle auf drei Kilohertz verfolgt wird. Stellen Sie das Track-Minimum, den Trigger zum Beenden des Trackings, auf 1,5 Kilohertz ein.
Starten Sie das Experiment, indem Sie auf Suchen und dann auf Automatische Nachverfolgung klicken. Dieser Film zeigt das Ergebnis der Verwendung des dreidimensionalen, dynamischen Photonenlokalisierungs-Tracking-Mikroskops, um die Diffusionsbewegung eines 110 Nanometer großen fluoreszierenden Nanopartikels in Wasser zu verfolgen. Die Position des Partikels, gemessen mit der Positionsauslesung des Nanopositionierers, wird auf den 3D-Achsen angezeigt.
Der Einschub ist das Auslesen der wissenschaftlichen Seemooskamera. Es zeigt, dass das Partikel vom Tracking-System im Fokusvolumen festgehalten wird. Das Teilchen wurde mehr als zwei Minuten lang verfolgt und seine Position aufgezeichnet.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als 50 Minuten durchgeführt werden, wenn das System richtig ausgerichtet und die Kalibrierungsparameter eingestellt sind. Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Wirkstoffverabreichung helfen, die Wege der Internalisierung und des Transports von zellulärer Fracht zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein 3D-Einzelteilchen-Tracking-Mikroskop mit Nullzeit bedient.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung eines Echtzeit-3D-Einzelpartikel-Tracking-Mikroskops, das zur Überwachung nanoskaliger fluoreszierender Sonden konzipiert wurde. Diese Technik ermöglicht die kontinuierliche Beobachtung einzelner diffundierender Objekte, selbst unter photonenlimitierten Bedingungen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikroskopie
- Einzelpartikel-Tracking
- Virologie
Hintergrund
- Die Echtzeit-Verfolgung nanoskaliger Partikel ist in verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen von entscheidender Bedeutung.
- Das Verständnis der Dynamik einzelner Virionen kann Einblicke in Infektionsprozesse liefern.
- Diese Technik verbessert die Fähigkeit, Partikel mit hohen Diffusionsgeschwindigkeiten zu untersuchen.
- Photonenzählbeschränkungen werden durch fortschrittliche optische Aufbauten angegangen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Mikroskops, das einzelne Partikel in Echtzeit verfolgen kann.
- Erleichterung der Untersuchung viraler Infektionen durch die Überwachung einzelner Virionen.
- Verbesserung der zeitlichen Auflösung der Verfolgung nanoskaliger Objekte.
Verwendete Methoden
- Konstruktion eines 3D-Einzelpartikel-Tracking-Mikroskops.
- Nutzung eines 488 Nanometer Solid-State-Lasers.
- Einbindung von elektro-optischen Deflektoren und einer einstellbaren akustischen Gradientenlinse.
- Kalibrierung des Apparats auf einem optischen Tisch mit präziser Positionierung.
Hauptergebnisse
- Das Mikroskop verfolgt erfolgreich nanoskalige fluoreszierende Sonden.
- Nachgewiesene Fähigkeit, Partikel bei niedrigen Photonenzählraten zu überwachen.
- Ermöglicht die kontinuierliche Beobachtung einzelner Virionen während der Infektion.
- Liefert Einblicke in die Dynamik viraler Prozesse.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll etabliert eine robuste Methode für die Echtzeit-Partikelverfolgung.
- Es eröffnet neue Möglichkeiten für die Forschung in der Virologie und verwandten Bereichen.
- Die Technik kann unser Verständnis des viralen Verhaltens erheblich verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Real-time 3D single particle tracking enables continuous monitoring of nanoscale objects under photon-limited conditions, addressing a critical gap in observing fast, three-dimensional cellular processes. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by providing high-resolution dynamic data on molecular interactions and trafficking pathways. The method enhances predictive confidence in target validation and lead identification by delivering quantitative, reproducible spatiotemporal data essential for informed go/no-go decisions in drug delivery and virology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking single virions or nanoparticles through infection processes with high spatiotemporal resolution.
- Operational Value: Provides functional target validation through direct observation of molecular dynamics in near-native environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative data on particle diffusion, binding, and transport kinetics under physiologically relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative dependent variable measurements (position, trajectory, diffusion coefficient) essential for assay standardization and hit confirmation.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening via precise 3D localization and tracking of fluorescent probes.
- Scalability: Supports platform reuse through robust single-excitation/single-detection layout and calibrated electro-optic and acoustic gradient lens control.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling real-time observation of cellular cargo internalization and transport pathways relevant to drug delivery.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in viral entry and intracellular trafficking models through direct visualization of single-particle behavior in solution.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing reproducible, high-fidelity data on nanoparticle behavior under low photon flux conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for studies requiring dynamic, nanoscale resolution in three dimensions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling continuous tracking of single particles in 3D space under physiological mimicry.
- Screening: Enhances assay readiness through reproducible particle localization and tracking, facilitating reliable compound or nanoparticle evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs (position, velocity, confinement) that allow objective comparison of experimental conditions and therapeutic candidates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling drug delivery pathways and viral infection dynamics in biologically relevant systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability due to its modular optical layout, calibration protocol, and adaptability to different sample types and tracking objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nanoscale biological processes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through calibrated raster scanning, position estimation algorithms, and feedback-controlled nano-positioning.
- Strategic Value: Improves capital efficiency and reduces late-stage biological risk by enabling early, data-driven decisions on target druggability and delivery mechanism feasibility.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, high-resolution tracking data that inform advancement criteria in drug delivery and antiviral development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and real-time control systems including FPGA-based feedback loops.
- Depends on specialized instrumentation: 488 nm solid-state laser, 2D electro-optic deflectors, tunable acoustic gradient lens, avalanche photodiode, and nano-positioning stages.
- Necessitates cross-team standardization for calibration protocols, position estimation parameters, and integral control constant tuning across users and labs.
- Involves adaptation considerations when transitioning from fixed bead samples to freely moving particles in viscous or complex biological media.
- Practical limitations include sensitivity to photon count rates and the need for careful optimization of tracking thresholds (e.g., 3 kHz start, 1.5 kHz end) to maintain lock-on under low-signal conditions.
