Ein verbessertes Verfahren zur Sammlung von Liquor cerebrospinalis aus narkotisierten Mäuse
19. März 2018
Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Technik für die reichhaltige Sammlung von zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) ohne Kontamination aus Blut. Mit größeren Musterkollektion und Reinheit können weitere Analysen mit CSF, um unser Verständnis von Krankheiten zu fördern, die das Gehirn und das Rückenmark betreffen durchgeführt werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Entnahme von Liquor cerebrospinalis von Mäusen ohne Kontamination durch Blut zu verbessern. Diese Methode bietet eine einfache und zuverlässige Möglichkeit, Liquor für die Überwachung der Biomarker von Nervenerkrankungen zu sammeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Zugabe mit dem Mikromanipulator zur Unterstützung der Liquorentnahme von Mäusen die Kontamination des Blutes während der Entnahme verringert.
Beginnen Sie damit, eine gezogene Glaskapillare in einen Kapillarhalter zu legen, der fest an einem Mikromanipulator befestigt ist. Als nächstes brechen Sie beim Betrachten durch ein Präpariermikroskop mit einer geraden Pinzette die Spitze der geschärften Kapillare, so dass der Innendurchmesser der abgebrochenen Spitze etwa 10 bis 20 Mikrometer beträgt. Befestigen Sie dann einen dünnen Schlauch und eine Spritze am anderen Ende des Kapillarhalters, verbinden Sie den dünnen Schlauch und die Spritze mit einem Dreiwegeventil und schieben Sie das Dreiwegeventil auf Öffnung.
Tauchen Sie dann die Spritze ein, um Verunreinigungen auszustoßen und einen Überdruck im Kapillarröhrchen zu erzeugen. Wiederholen Sie dies einige Male, indem Sie die Spritze vom Dreiwegeventil trennen und wieder anschließen. Dann saugen Sie Luft auf 100 bis 200 Mikroliter an, bevor die Spritze mit dem Dreiwegeventil wieder verbunden wird.
Bewegen Sie den Mikromanipulator mit der Glaskapillare zur Seite, um Schäden während des chirurgischen Eingriffs zu vermeiden. Stellen Sie vor Beginn der Operation sicher, dass die Maus vollständig betäubt wurde, indem Sie alle vier Gliedmaßen einklemmen und beobachten, ob keine Reaktion vorliegt. Schneiden und trimmen Sie dann mit einer Präparierschere die Haare am Hinterkopf der Maus von oberhalb der Augen, zwischen den Ohren bis zum unteren Nacken.
Befestigen Sie den Kopf der Maus mit einem stereotaktischen Rahmenmausadapter. Stellen Sie sicher, dass sich der Kopf nicht bewegen kann und fest im Adapter befestigt ist, indem Sie ihn vorsichtig auf den Kopf der Maus drücken. Schneide mit einer Schere und einer gebogenen Pinzette durch die Haut der Maus im Nacken und dann in der Mitte des Schädels zwischen den Ohren und Augen der Maus.
Ziehen Sie die Haut und das Gewebe auseinander und aus dem Bereich über der Cisterna magna heraus. Während Sie durch das Präpariermikroskop betrachten, präparieren Sie vorsichtig die letzten dünnen Muskelschichten über der Schädelbasis mit einer Pinzette und bewegen Sie diese Muskelschichten zur Seite und aus dem interessierenden Bereich. Sobald die Dura über der Zisterne magna freigelegt ist, wischen Sie die Membran mit einem feuchten Wattestäbchen sauber und trocknen Sie den Bereich dann mit einem trockenen Wattestäbchen.
Die Cisterna magna erscheint dreieckig mit ein bis zwei großen Blutgefäßen, die durch den Bereich verlaufen. Beide Seiten oder zwischen den Blutgefäßen sind optimal für das Einführen von Kapillaren und die Liquorentnahme. Sobald die Cisterna magna freigelegt ist, richten Sie die Glaskapillare mit dem Mikromanipulator so aus, dass sich der geschärfte Punkt in einem Winkel von 30 bis 45 Grad direkt hinter der Membran befindet.
Tauchen Sie dann die Spritze ein- oder mehrmals ein und bewegen Sie den Kolben dann 100 bis 200 Mikroliter zurück, um sicherzustellen, dass keine Verunreinigungen vorhanden sind und in der Glaskapillare ein Unterdruck herrscht. Bewegen Sie dann die Kapillarspitze näher an die Membran, bis ein Widerstand zu sehen ist, jedoch ohne die Membran zu durchstechen. Klopfen Sie auf die Bedienelemente des Mikromanipulators, um das Kapillarrohr vorsichtig durch die Membran zu klopfen.
Liquor sollte automatisch in das Kapillarrohr gezogen werden, sobald die Öffnung durchstochen wurde. Lassen Sie die Kapillare an Ort und Stelle, um langsam Liquor zu sammeln. Wenn der Liquor nicht mehr fließt, ziehen Sie die Spritze langsam etwa 50 Mikroliter nach oben, um mehr Unterdruck in der Kapillare zu erzeugen.
In 10 bis 30 Minuten werden zehn bis 15 Mikroliter Liquor gesammelt. Sobald das gewünschte Volumen an Liquor gesammelt wurde, schließen Sie den Schlauch, indem Sie das Dreiwegeventil verschieben, um die mit dem Schlauch verbundene Spritze zu schließen und zu entfernen. Öffnen und schließen Sie den Schlauch, um einen ausgeglichenen Druck in der Kapillare, dem Schlauch und dem Bereich außerhalb der Kapillare zu erzeugen.
Schließen Sie dann die Spritze wieder an, bevor Sie die Glaskapillare vorsichtig mit dem Mikromanipulator von der Maus entfernen. Legen Sie anschließend das Entnahmeröhrchen mit einem Mikroliter 20X Proteaseinhibitor unter die geschärfte Spitze der Glaskapillare. Öffnen Sie den Schlauch und tauchen Sie die Spritze vorsichtig ein.
Der Liquor sollte aus der Kapillare in das Entnahmeröhrchen fließen. Nach der Entnahme wird der Liquor pulszentrifugiert, um die Probe mit dem Proteaseinhibitor am Boden des Entnahmeröhrchens zu mischen. Liquorproben können aliquotiert und dann für die weitere Analyse bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.
Liquor, der von APP/PS1-Mäusen entnommen wurde, zeigte einen signifikanten Anstieg der Spiegel von humanem A beta 42 im Alter von 12 Monaten. In Wildtyp-Mäusen wurde kein humanes A beta 42 nachgewiesen. Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren in einer Stunde durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Blutgefäße beim Einführen der Kapillare zu vermeiden und während der Liquorentnahme nur geringfügige Anpassungen mit dem Mikromanipulator vorzunehmen, um eine Kontamination mit Blut zu vermeiden.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Entnahme von Liquor cerebrospinalis (CSF) aus Mäusen mit minimaler Blutkontamination. Durch den Einsatz eines Mikromanipulators verbessert diese Technik die Probenreinheit und das Probenvolumen und ermöglicht so eine bessere Analyse von Biomarkern bei neurologischen Erkrankungen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Liquorzerebrospinalisanalyse
- Forschung zu neurologischen Erkrankungen
Hintergrund
- CSF ist entscheidend für das Verständnis von Erkrankungen des Gehirns und des Rückenmarks.
- Kontamination durch Blut während der Entnahme kann die Forschungsergebnisse beeinträchtigen.
- Verbesserte Entnahmemethoden können die Probenintegrität für die Biomarkeranalyse verbessern.
- Diese Technik zielt darauf ab, die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen zu erleichtern.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur CSF-Entnahme aus Mäusen.
- Minimierung der Blutkontamination während des Entnahmeprozesses.
- Ermöglichung einer genaueren Überwachung von Biomarkern für neurologische Erkrankungen.
Verwendete Methoden
- Die Methode verwendet einen Mikromanipulator mit einer Glaskapillare für die präzise CSF-Entnahme aus der Cisterna magna.
- Mäuse werden ordnungsgemäß anästhesiert, und chirurgische Techniken werden angewendet, um die Cisterna magna für die Kapillarenführung freizulegen.
- Es werden keine Multiomics-Workflows referenziert; der Fokus liegt auf der CSF-Entnahme.
- Der Vorgang kann mit Übung in etwa einer Stunde abgeschlossen werden.
- CSF wird nach der Entnahme mit einem Proteasehemmer zur Konservierung gemischt.
Hauptergebnisse
- Die Technik ermöglicht die Entnahme von 10 bis 15 Mikrolitern CSF innerhalb von 10 bis 30 Minuten.
- CSF, das von APP/PS1-Mäusen entnommen wurde, zeigte einen signifikanten Anstieg der humanen A beta 42-Spiegel bei 12 Monaten.
- Kein A beta 42 wurde in Proben von Wildtyp-Mäusen nachgewiesen.
- Die Effizienz des Verfahrens und die Fähigkeit, Blutkontamination zu vermeiden, wurden erfolgreich nachgewiesen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert eine effektive Methode zur Gewinnung von CSF aus Mäusen bei gleichzeitiger Minimierung der Kontamination.
- Die erhöhte Reinheit und das Volumen des gesammelten CSF können die Biomarkeranalyse in der Forschung zu neurologischen Erkrankungen verbessern.
- Es trägt zu einem besseren Verständnis der Liquor-Dynamik bei neurologischen Störungen bei.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Reliable cerebrospinal fluid (CSF) collection is essential for biomarker discovery in neurodegenerative disease research, where sample purity directly impacts data quality and target validation confidence. This method addresses a critical bottleneck in murine neuroscience workflows by enabling higher-yield, low-contamination CSF extraction, supporting more robust mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. Improved CSF accessibility enhances translational continuity from target identification to preclinical biomarker monitoring.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through biomarker analysis in a disease-relevant system with reduced mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Provides reproducible access to CSF for longitudinal monitoring of target engagement and pathway modulation.
- Predictive Value: Supports biomarker-based go/no-go decisions by improving confidence in target-related molecular changes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers purified CSF samples suitable for quantitative biomarker assays, enhancing screening reliability.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, reducing variability in downstream analytical workflows.
- Scalability: Enables consistent CSF collection across cohorts, supporting assay validation and reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment from discovery through preclinical validation using disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Allows monitoring of target biomarkers like human A beta 42 in APP/PS1 mice, strengthening predictive confidence.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven progression decisions based on detectable biomarker changes in neural disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a reliable upstream sample source for biomarker analysis, bridging target validation and lead optimization phases.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through biomarker measurement in CSF.
- Screening: Enables assay-ready sample generation with consistent volume and purity for compound evaluation.
- Analytics: Yields quantitative biomarker readouts (e.g., human A beta 42) that facilitate comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects CSF biomarker dynamics to preclinical disease progression in genetic models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable capability for CSF collection across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through cleaner, higher-volume biomarker data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of CSF collection across laboratories and studies.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failed experiments due to contaminated or insufficient samples.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reliable biomarker fluctuations in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery and micromanipulator operation for precise capillary positioning.
- Dependent on dissection microscopy, stereotaxic framing, and fluid handling instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of surgical and collection protocols to ensure reproducibility.
- Adaptation to other models may require anatomical adjustments due to variations in cisterna magna accessibility.
- Practical limitations include dependence on operator skill and potential physiological variability in CSF yield.
