Ein verbessertes Verfahren zur Sammlung von Liquor cerebrospinalis aus narkotisierten Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Entnahme von Liquor cerebrospinalis von Mäusen ohne Kontamination durch Blut zu verbessern. Diese Methode bietet eine einfache und zuverlässige Möglichkeit, Liquor für die Überwachung der Biomarker von Nervenerkrankungen zu sammeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Zugabe mit dem Mikromanipulator zur Unterstützung der Liquorentnahme von Mäusen die Kontamination des Blutes während der Entnahme verringert.

Beginnen Sie damit, eine gezogene Glaskapillare in einen Kapillarhalter zu legen, der fest an einem Mikromanipulator befestigt ist. Als nächstes brechen Sie beim Betrachten durch ein Präpariermikroskop mit einer geraden Pinzette die Spitze der geschärften Kapillare, so dass der Innendurchmesser der abgebrochenen Spitze etwa 10 bis 20 Mikrometer beträgt. Befestigen Sie dann einen dünnen Schlauch und eine Spritze am anderen Ende des Kapillarhalters, verbinden Sie den dünnen Schlauch und die Spritze mit einem Dreiwegeventil und schieben Sie das Dreiwegeventil auf Öffnung.

Tauchen Sie dann die Spritze ein, um Verunreinigungen auszustoßen und einen Überdruck im Kapillarröhrchen zu erzeugen. Wiederholen Sie dies einige Male, indem Sie die Spritze vom Dreiwegeventil trennen und wieder anschließen. Dann saugen Sie Luft auf 100 bis 200 Mikroliter an, bevor die Spritze mit dem Dreiwegeventil wieder verbunden wird.

Bewegen Sie den Mikromanipulator mit der Glaskapillare zur Seite, um Schäden während des chirurgischen Eingriffs zu vermeiden. Stellen Sie vor Beginn der Operation sicher, dass die Maus vollständig betäubt wurde, indem Sie alle vier Gliedmaßen einklemmen und beobachten, ob keine Reaktion vorliegt. Schneiden und trimmen Sie dann mit einer Präparierschere die Haare am Hinterkopf der Maus von oberhalb der Augen, zwischen den Ohren bis zum unteren Nacken.

Befestigen Sie den Kopf der Maus mit einem stereotaktischen Rahmenmausadapter. Stellen Sie sicher, dass sich der Kopf nicht bewegen kann und fest im Adapter befestigt ist, indem Sie ihn vorsichtig auf den Kopf der Maus drücken. Schneide mit einer Schere und einer gebogenen Pinzette durch die Haut der Maus im Nacken und dann in der Mitte des Schädels zwischen den Ohren und Augen der Maus.

Ziehen Sie die Haut und das Gewebe auseinander und aus dem Bereich über der Cisterna magna heraus. Während Sie durch das Präpariermikroskop betrachten, präparieren Sie vorsichtig die letzten dünnen Muskelschichten über der Schädelbasis mit einer Pinzette und bewegen Sie diese Muskelschichten zur Seite und aus dem interessierenden Bereich. Sobald die Dura über der Zisterne magna freigelegt ist, wischen Sie die Membran mit einem feuchten Wattestäbchen sauber und trocknen Sie den Bereich dann mit einem trockenen Wattestäbchen.

Die Cisterna magna erscheint dreieckig mit ein bis zwei großen Blutgefäßen, die durch den Bereich verlaufen. Beide Seiten oder zwischen den Blutgefäßen sind optimal für das Einführen von Kapillaren und die Liquorentnahme. Sobald die Cisterna magna freigelegt ist, richten Sie die Glaskapillare mit dem Mikromanipulator so aus, dass sich der geschärfte Punkt in einem Winkel von 30 bis 45 Grad direkt hinter der Membran befindet.

Tauchen Sie dann die Spritze ein- oder mehrmals ein und bewegen Sie den Kolben dann 100 bis 200 Mikroliter zurück, um sicherzustellen, dass keine Verunreinigungen vorhanden sind und in der Glaskapillare ein Unterdruck herrscht. Bewegen Sie dann die Kapillarspitze näher an die Membran, bis ein Widerstand zu sehen ist, jedoch ohne die Membran zu durchstechen. Klopfen Sie auf die Bedienelemente des Mikromanipulators, um das Kapillarrohr vorsichtig durch die Membran zu klopfen.

Liquor sollte automatisch in das Kapillarrohr gezogen werden, sobald die Öffnung durchstochen wurde. Lassen Sie die Kapillare an Ort und Stelle, um langsam Liquor zu sammeln. Wenn der Liquor nicht mehr fließt, ziehen Sie die Spritze langsam etwa 50 Mikroliter nach oben, um mehr Unterdruck in der Kapillare zu erzeugen.

In 10 bis 30 Minuten werden zehn bis 15 Mikroliter Liquor gesammelt. Sobald das gewünschte Volumen an Liquor gesammelt wurde, schließen Sie den Schlauch, indem Sie das Dreiwegeventil verschieben, um die mit dem Schlauch verbundene Spritze zu schließen und zu entfernen. Öffnen und schließen Sie den Schlauch, um einen ausgeglichenen Druck in der Kapillare, dem Schlauch und dem Bereich außerhalb der Kapillare zu erzeugen.

Schließen Sie dann die Spritze wieder an, bevor Sie die Glaskapillare vorsichtig mit dem Mikromanipulator von der Maus entfernen. Legen Sie anschließend das Entnahmeröhrchen mit einem Mikroliter 20X Proteaseinhibitor unter die geschärfte Spitze der Glaskapillare. Öffnen Sie den Schlauch und tauchen Sie die Spritze vorsichtig ein.

Der Liquor sollte aus der Kapillare in das Entnahmeröhrchen fließen. Nach der Entnahme wird der Liquor pulszentrifugiert, um die Probe mit dem Proteaseinhibitor am Boden des Entnahmeröhrchens zu mischen. Liquorproben können aliquotiert und dann für die weitere Analyse bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Liquor, der von APP/PS1-Mäusen entnommen wurde, zeigte einen signifikanten Anstieg der Spiegel von humanem A beta 42 im Alter von 12 Monaten. In Wildtyp-Mäusen wurde kein humanes A beta 42 nachgewiesen. Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren in einer Stunde durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Blutgefäße beim Einführen der Kapillare zu vermeiden und während der Liquorentnahme nur geringfügige Anpassungen mit dem Mikromanipulator vorzunehmen, um eine Kontamination mit Blut zu vermeiden.