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Zweidimensionaler Gelelektrophorese (2DGE) ist eine Technik, die Tausende von Biomolekülen aus einer Mischung auflösen kann. Diese Technik beinhaltet zwei verschiedene Trennverfahren zusammen gekuppelt: isoelektrischen Fokussierung (IEF) und Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Dies trennt physikalisch Verbindungen über zwei Achsen eines Gels durch ihre isoelektrischen Punkte (eine elektrochemische Eigenschaft) und ihren Molekulargewichten.
Das Verfahren in diesem Video deckt die wichtigsten Konzepte der 2DGE und ein allgemeines Verfahren zur Charakterisierung der Zusammensetzung einer komplexen Proteinlösung. Drei Beispiele für diese Technik sind unter der Rubrik Anwendungen, einschließlich der Biomarker-Erkennung für Krankheit Initiierung und Fortschritt, Kontrollbehandlung bei Patienten und die Untersuchung von Proteinen nach posttranslationale Modifikation (PTM) gezeigt.
Zweidimensional, oder 2D, Gelelektrophorese ist eine Technik, die unter Verwendung zwei verschiedene Trennverfahren, die Tausenden von Proteinen aus einer einzigen Mischung trennen können. Eine der Techniken, SDS-PAGE oder Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, nicht vollständig allein komplexe Stoffgemische trennen. 2D Gelelektrophorese Paare der SDS-PAGE auf eine zweite Methode, isoelektrischen Fokussierung oder IEF, die trennt auf isoelektrischen Punkte, so dass für die Lösung von potenziell alle Proteine in einer Zelle lysate. Dieses Video zeigt, dass die Grundsätze der 2D gel-Elektrophorese, ein allgemeines Verfahren, und einige seiner biomedizinische Anwendungen.
2D Gelelektrophorese beginnt mit IEF als die erste Dimension. Jedes Protein hat einen pH-Wert, der isoelektrischen Punkt oder pI, genannt, wo die Nettoladung ist null. Wenn ein Protein in einem elektrischen Feld ausgesetzt wird, bewegt sie in Richtung der Elektrode mit entgegengesetzter Ladung. Proben von Interesse sind immobilisierte pH-Gradienten oder IPG, Streifen verladen die Ampholyten, Moleküle mit saure und basische Gruppen eingegraben haben. Ein elektrisches Feld wird dann auf die pH Steigung Streifen, verursacht die Proteine zu migrieren, bis zum Erreichen des pH-Wertes Abgleich ihrer pI, wo sie verlieren ihre Nettoladung angewendet.
Vor dem Ausführen der zweiten Dimension, die eingebettete Proteine mit SDS, Denaturierung sie und bietet eine einheitliche negative Ladung behandelt. Einmal abgeschlossen, werden die IPG-Streifen auf einem Polyacrylamid-Gel platziert. Ein angewandter elektrisches Feld zieht die Proteine in Richtung der Anode mit größere Proteine langsam durch das Gel.
Sobald die Proteinmischung nach pI und Molekulargewicht abgetrennt wurde, die Proteom-Karte ist mit Flecken visualisiert und interessierender Proteine identifiziert.
Nun, da wir die Grundsätze der 2D Gelelektrophorese besprochen haben, gehen Sie wir über eine typische Laborverfahren.
Bevor das Experiment durchgeführt werden kann, müssen die Proteine in Medien solubilisiert. Solubilisierung der Probe erfolgt durch de-Aggregation Proteine mit einer Kombination von chaotropen Agenten für Störung der Wasserstoff-Bindung Interaktionen, nichtionische Detergentien, zu verhindern, ändern die Proteine kostenlos, Reduktionsmittel, Disulfid-Bindungen aufzubrechen und puffert. Um störende reichlich Proteinen und anderen Molekülen zu entfernen, wird das Material nacheinander durch Zentrifugation und Sammlung von der daraus resultierenden Pellet extrahiert; gefolgt von der Behandlung mit Endonuklease, ein Enzym verwendet, um keine DNA zu verbrauchen, die mit dem Experiment stören würde.
Sobald die Proteine solubilisiert haben, sind IPG Streifen durch das Ausspülen mit einem Streifen-Reinigungslösung vorbereitet und kopfüber trocknen gelassen. Jeder Streifen wird dann ein Streifen-Halter-Nummer zugewiesen. Einmal fertig, ist der Streifen in einer langsamen, gleitenden Bewegung vom negativ zum Pluspol der zelluläre Extrakt verladen. Zum Zwecke der Rehydratation wird feucht Löschpapier auf die Elektrode und unter die Gel-Streifen gelegt; die IPG-Streifen werden dann auf das IEF-Instrument gesäumt. Ein hoher elektrischer Strom angewendet, und die Proteine beginnen zu migrieren.
Nach Abschluss der ersten Dimension ist das Gel für SDS-PAGE in einer Gießvorrichtung bereit. Die IPG-Streifen werden behandelt werden, indem sie unten im SDS-haltigen Gleichgewichtherstellung Puffer. Die Elektrophorese-Einheit ist mit dem Zusatz von Elektrophorese Puffer vorbereitet. Die behandelten IPG-Streifen werden mit einer Pinzette, platziert die Gel-Platten und versiegelt mit Agarose-Abdichtung Lösung gesammelt. Eine Spannungsquelle gilt dann ein elektrisches Feld, das gehalten wird, bis die schnellste Bewegung Proteine 1 cm über dem Boden des Gels sind.
Nach Abschluss der Elektrophorese müssen die Proteine visualisiert werden. Traditionell erfolgt dies durch Färbung mit Coomassie-Blau oder Silber-Nitrat. Interessierenden Proteine werden durch Western-Blot Analyse aus dem Gel übertragen, und analysiert.
Ein zweiter Ansatz Identifikation beinhaltet Exzision der Proteine aus dem Gel, verdauen sie, als sie durch Massenspektrometrie analysiert.
Nun, da wir ein Verfahren überprüft haben, betrachten wir einige der Anwendungen für 2D Gelelektrophorese.
Einer der häufigsten Verwendungszwecke für diese Technik ist die Identifizierung von Molekülen Krankheit Initiation und Progression beteiligt. 2D Gelelektrophorese, gekoppelt mit Massenspektrometrie, erkennt die Up oder Down-Regulierung spezifischer Proteine erkrankten Bereiche im Vergleich zu gesunden.
Darüber hinaus eignet sich die 2D Gelelektrophorese im Anschluss an der Fortschritts des Patienten als Reaktion auf eine mögliche therapeutische Droge. Patienten an verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung können Proben entnommen werden. Auf diese Weise können 2D Gelelektrophorese gepaart mit Western-Blot oder Massenspektrometrie Analyse Proteinen assoziiert mit negativen Reaktionen wie Entzündung erkennen; oder das Fehlen von Proteinen in einem gemilderten Zustand.
Ein weiteres Einsatzgebiet für 2D Gelelektrophorese ist die Untersuchung von Protein-Struktur und Funktion nach posttranslationale Modifikation oder PTM, die Ergänzungen zu den Proteinen, die nach ihrer Übersetzung von mRNA. PTM können eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich Protein signaling, Genexpression regulieren oder oxidativen Schäden verursachen. 2D Gelelektrophorese reagiert empfindlich auf Veränderungen wie Methylierung oder Acetylierung, die eine Verschiebung in pI sowie das Molekulargewicht verursachen können.
Sie haben nur Jupiters Video auf 2D Gelelektrophorese angesehen. Dieses Video beschrieben die Prinzipien der Technik, eine typische Versuchsdurchführung und einige ihrer Anwendungen auf dem Gebiet der Biomedizin.
Danke fürs Zuschauen!
Die zweidimensionale oder 2D-Gelelektrophorese ist eine Technik, bei der zwei unterschiedliche Trennmethoden verwendet werden, mit denen Tausende von Proteinen aus einer einzigen Mischung getrennt werden können. Eine der Techniken, SDS-PAGE oder Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, kann komplexe Gemische allein nicht vollständig trennen. Die 2D-Gelelektrophorese koppelt die SDS-PAGE an eine zweite Methode, die isoelektrische Fokussierung oder IEF, die auf der Grundlage isoelektrischer Punkte trennt und so die Auflösung potenziell aller Proteine in einem Zelllysat ermöglicht. Dieses Video zeigt die Prinzipien der 2D-Gelelektrophorese, ein allgemeines Verfahren und einige seiner biomedizinischen Anwendungen.
Die2D-Gelelektrophorese beginnt mit IEF als erster Dimension. Jedes Protein hat einen pH-Wert, den sogenannten isoelektrischen Punkt oder pI, bei dem die Nettoladung Null ist. Wenn ein Protein einem elektrischen Feld ausgesetzt wird, bewegt es sich mit entgegengesetzter Ladung auf die Elektrode zu. Die interessierenden Proben werden auf immobilisierte pH-Gradienten-Streifen (IPG) geladen, in die Ampholyte eingebettet sind, Moleküle, die sowohl saure als auch basische Gruppen enthalten. Dann wird ein elektrisches Feld an den pH-Gradientenstreifen angelegt, wodurch die Proteine wandern, bis sie den pH-Wert erreichen, der ihrem pI entspricht, wo sie ihre Nettoladung verlieren.
Vor dem Durchlaufen der zweiten Dimension werden die eingebetteten Proteine mit SDS behandelt, wodurch sie denaturiert und für eine gleichmäßige negative Ladung bereitgestellt werden. Nach Fertigstellung werden die IPG-Streifen auf ein Polyacrylamid-Gel aufgebracht. Ein angelegtes elektrisches Feld zieht die Proteine zur Anode, während sich größere Proteine langsamer durch das Gel bewegen.
Nachdem das Proteingemisch nach pI und Molekulargewicht getrennt wurde, wird die Proteomkarte mit Hilfe von Färbungen visualisiert und die interessierenden Proteine identifiziert.
Nachdem wir nun die Prinzipien der 2D-Gelelektrophorese besprochen haben, gehen wir auf ein typisches Laborverfahren ein.
Bevor das Experiment durchgeführt werden kann, müssen die Proteine in Medien solubilisiert werden. Die Solubilisierung der Probe wird durch die Deaggregation von Proteinen mit einer Kombination aus chaotropen Mitteln zur Unterbrechung von Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen, nichtionischen Detergenzien zur Verhinderung einer Veränderung der Ladung der Proteine, Reduktionsmitteln zum Aufbrechen von Disulfidbindungen und Puffern erreicht. Um störende reichlich vorhandene Proteine und andere Moleküle zu entfernen, wird das Material nacheinander durch Zentrifugation und Sammlung des resultierenden Pellets extrahiert. gefolgt von einer Behandlung mit Endonukleasauf, einem Enzym, das verwendet wird, um jegliche DNA zu verbrauchen, die das Experiment stören würde.
Sobald die Proteine löslich sind, werden die IPG-Streifen durch Spülen mit einer Streifenreinigungslösung vorbereitet und auf dem Kopf stehend zum Trocknen gelassen. Jedem Streifen wird dann eine Streifenhalternummer zugewiesen. Sobald er fertig ist, wird der Zellextrakt in einer langsamen, gleitenden Bewegung vom negativen zum positiven Ende auf die Streifen geladen. Zum Zwecke der Rehydrierung wird feuchtes Löschpapier auf die Elektrode und unter die Gelstreifen gelegt; Die IPG-Streifen werden dann auf das IEF-Instrument aufgebracht. Ein hoher elektrischer Strom wird angelegt, und die Proteine beginnen zu wandern.
Nach Fertigstellung der ersten Dimension wird das Gel für SDS-PAGE in einer Gießapparatur hergestellt. Die IPG-Streifen werden behandelt, indem sie mit der bedruckten Seite nach unten in einen SDS-haltigen Äquilibrierungspuffer gelegt werden. Die Elektrophoreseeinheit wird unter Zugabe von Elektrophoresepuffer vorbereitet. Die behandelten IPG-Streifen werden mit einer Pinzette gesammelt, auf die Gelplatten gelegt und mit Agarose-Versiegelungslösung versiegelt. Eine Spannungsquelle legt dann ein elektrisches Feld an, das so lange gehalten wird, bis die sich am schnellsten bewegenden Proteine 1 cm vom Boden des Gels entfernt sind.
Nach Abschluss der Elektrophorese müssen die Proteine sichtbar gemacht werden. Traditionell erfolgt dies durch Färben mit Coomassie-Blau- oder Silbernitrat. Interessante Proteine können aus dem Gel übertragen und durch Western-Blot-Analyse analysiert werden.
Ein zweiter Identifizierungsansatz besteht darin, die Proteine aus dem Gel zu entfernen, sie zu verdauen und dann mit Hilfe der Massenspektrometrie zu analysieren.
Nachdem wir nun ein Verfahren überprüft haben, schauen wir uns einige der Anwendungen für die 2D-Gelelektrophorese an.
Eine der häufigsten Anwendungen für diese Technik ist die Identifizierung von Molekülen, die an der Entstehung und dem Fortschreiten der Krankheit beteiligt sind. Die 2D-Gelelektrophorese in Verbindung mit der Massenspektrometrie kann die Hoch- oder Herunterregulierung bestimmter Proteine in erkrankten Bereichen im Vergleich zu gesunden Bereichen nachweisen.
Darüber hinaus ist die 2D-Gelelektrophorese nützlich, um den Fortschritt des Ansprechens der Patienten auf ein potenzielles therapeutisches Medikament zu verfolgen. Proben können von Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung der Behandlung entnommen werden. Auf diese Weise kann die 2D-Gelelektrophorese in Verbindung mit Western-Blot- oder Massenspektrometrie-Analysen Proteine nachweisen, die mit negativen Reaktionen wie Entzündungen verbunden sind; oder das Fehlen von Proteinen in einem gelinderten Zustand.
Eine weitere Anwendung der 2D-Gelelektrophorese ist die Untersuchung der Proteinstruktur und -funktion nach posttranslationaler Modifikation (PTM), bei der es sich um Zusätze zu Proteinen nach ihrer Translation aus mRNA handelt. PTMs können eine Vielzahl von Funktionen regulieren, einschließlich Proteinsignalisierung, Genexpression oder oxidative Schäden. Die 2D-Gelelektrophorese reagiert empfindlich auf Modifikationen wie Methylierung oder Acetylierung, die eine Verschiebung des pI sowie des Molekulargewichts verursachen können.
Sie haben gerade das Video von JoVE über die 2D-Gelelektrophorese gesehen. Dieses Video beschreibt die Prinzipien der Technik, ein typisches experimentelles Verfahren und einige ihrer Anwendungen im Bereich der Biomedizin.
Danke fürs Zuschauen!
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