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Die Proteinkristallisation ist der Prozess der Gewinnung einer gitterförmigen festen Form eines Proteins. Diese Kristalle sind besonders wertvoll für Strukturbiologen, da sie bei der Untersuchung der Proteinfunktion helfen. Andere Techniken, wie z.B. die Massenspektrometrie oder SDS-PAGE, können nur Aufschluss über die eindimensionale Struktur von Proteinen geben. Die Proteinkristallisation wird durch die Techniken der rekombinanten Proteinexpression und der Röntgenbeugung ergänzt. Dieses Video zeigt die Prinzipien der Proteinkristallisation, ein allgemeines Laborverfahren und einige seiner Anwendungen im biochemischen Bereich.
Der erste Schritt, der in diesem Prozess erforderlich ist, besteht darin, Milligrammmengen sehr reines Protein zu erhalten, typischerweise unter Verwendung der rekombinanten Proteinexpression. Das Gen, das dem interessierenden Protein entspricht, wird in einen Expressionsvektor kloniert, und das exprimierte Protein wird mit einem Affinitätstag, wie z. B. Polyhistidin, fusioniert, um die Reinigung durch Affinitätschromatographie zu unterstützen. Weitere Informationen finden Sie im Video dieser Sammlung zur Affinitätschromatographie.
Die Bildung des gereinigten Proteins zu Kristallen hängt von der richtigen Kombination vieler Faktoren ab, darunter pH-Wert, Ionenstärke, Konzentrationen von Fällungsmittel und Protein, Temperatur und Gleichgewichtsgeschwindigkeit. Die am häufigsten verwendete Methode ist die Dampfdiffusion, von der es zwei Kategorien gibt: hängender Tropfen und sitzender Tropfen. Ein Tröpfchen, das reines Protein, Puffer und Fällungsmittel enthält, bei dem es sich um einen ionischen Feststoff handelt, der Wassermoleküle bindet, die Wasserverfügbarkeit für das Protein verringert und eine höhere Proteinkonzentration nachahmt, befindet sich in einer geschlossenen Mikrovertiefung mit einem Reservoir mit einer höher konzentrierten Mischung aus demselben Puffer und Fällungsmittel. Zu Beginn sind die Konzentrationen von Protein und Fällungsmittel zu gering, um eine Kristallisation zu verursachen. Im Verlauf des Experiments verdampft Wasser aus dem Tröpfchen und sammelt sich im Reservoir; Eine Abnahme der Wassermenge im Tröpfchen führt dazu, dass das System übersättigt wird und es zu einer Keimbildung mit anschließender Kristallisation kommen kann. Der Nettotransfer von Wasser aus dem Tröpfchen befindet sich im Gleichgewicht, und das System wird aufrechterhalten, bis der Prozess abgeschlossen ist.
Um die 3D-Struktur zu visualisieren, wird die Röntgenbeugung verwendet. Um Röntgendaten von einem Kristall zu erhalten, wird er in einen monochromatischen Röntgenstrahl gelegt, wo er dem Strahl in allen Winkeln ausgesetzt wird. Jede Belichtung liefert ein Bild, bei dem jeder Fleck eine gebeugte Röntgenstrahlung ist, die aus dem Kristall austritt und von einem Detektor registriert wird. Die Daten werden kombiniert, um ein Modell der Anordnung der Atome im Kristall zu erstellen. Die resultierende Kristallstruktur zeigt die 3-dimensionale Anordnung der Atome mit einer typischen Auflösung von 2 Ångström.
Nachdem wir nun die Prinzipien der Proteinkristallisation behandelt haben, schauen wir uns ein verallgemeinertes Protokoll an.
Zu Beginn des Verfahrens wird ein Expressionsvektor, der das interessierende Gen enthält, in Zellen umgewandelt. Die Zellen werden inkubiert und in der Mid-Log-Phase wird die Expression durch Zugabe eines Induktors wie IPTG initiiert, der die Transkription der mRNA des Gens auslöst. Nach der Proteinexpression wird das Rohmaterial in Lysepuffer suspendiert und anschließend durch Zentrifugation geklärt.
Das geklärte Lysat wird dann auf eine Nickelsäule geladen, und das Polyhistidin-markierte Protein bindet an die Säule, während alle anderen Biomoleküle weggespült werden.
Sobald mehrere Milligramm reines Protein gewonnen wurden, ist es bereit für die Kristallisation durch Dampfdiffusion. Ein 24-Well-Hänge-/Sitztablett ist mit unterschiedlichen Konzentrationen von Natriumchlorid und Natriumacetat-Pufferlösungen gefüllt. Bei der sitzenden Drop-Methode werden gleiche Volumina des Proteins und der Reservoirlösung auf das Regal über jeder Vertiefung pipettiert, und dann wird das Tablett mit transparentem Klebeband abgedeckt. Das Tablett wird dann in eine Inkubationskammer gestellt, und die Vertiefungen werden am nächsten Tag und dann alle paar Tage auf Wachstum überwacht.
Sobald ein geeigneter Kristall erhalten wurde, ist er bereit für die Röntgenbeugungsanalyse. Der Kristall wird auf ein Goniometer montiert, um den Kristall in ausgewählten Ausrichtungen zu positionieren. Der Kristall wird mit einem monochromatischen Röntgenstrahl aus allen Winkeln beleuchtet, wodurch ein Beugungsmuster entsteht. Die Software wandelt die zweidimensionalen Bilder, die in unterschiedlichen Ausrichtungen aufgenommen wurden, in ein dreidimensionales Modell der Dichte der Elektronen im Kristall um, indem sie die Positionen der Atome im Kristall bestimmt.
Nachdem wir nun ein Verfahren überprüft haben, sehen wir uns einige nützliche Anwendungen der Proteinkristallisation und eine andere Kristallisationstechnik an.
Die Proteinkristallisation kann für die Entwicklung von In-silico-Wirkstoffen verwendet werden. Die dreidimensionale Struktur des Polymerase-Basisproteins 2 des Influenzavirus, das mit Virusinfektionen bei Säugetieren in Verbindung gebracht wird, wurde durch Kristallisation und Röntgenbeugung bestimmt. Potenzielle Bindungsstellen im Protein werden visualisiert, und mit Hilfe eines Andockprogramms wurde ein dreidimensionales Molekül entworfen, das sich in eine Spalte im Protein einfügt.
Die Co-Kristallisation von Protein-DNA-Komplexen ist ebenfalls eine nützliche Technik. DNA-bindende Proteine modulieren eine Vielzahl biologischer Funktionen wie Transkription, DNA-Polymerisation und DNA-Reparatur; Und die Kristallstrukturen dieser Komplexe können Aufschluss über die Funktion, den Mechanismus und die Art der spezifischen Wechselwirkung geben. Das E. coli-Protein SeqA, ein negativer Regulator der DNA-Replikation, wurde mit hemimethylierter DNA cokristallisiert.
Integrale Membranproteine wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren oder GCPRs sind aufgrund ihrer begrenzten polaren Oberfläche, die für die Bildung von Kristallgitterkontakten zur Verfügung steht, schwer zu kristallisieren, was zur Entwicklung der Fusionsprotein-gestützten Proteinkristallisation geführt hat. Gene, die für den ?2-adrenergen Rezeptor, einen GCPR und ein Lysozym kodieren, wurden in einen Expressionsvektor eingefügt. Die Kristallisation des ?2AR-Lysozym-Fusionsproteins wurde aufgrund der erhöhten extrazellulären hydrophilen Oberfläche über dem natürlich hydrophoben ?2AR erreicht, die durch das Lysozym bereitgestellt wird und für die Bildung von Packungswechselwirkungen im Kristallgitter notwendig ist.
Sie haben gerade das Video von JoVE über die Proteinkristallisation gesehen. Dieses Video beschreibt seine Prinzipien, ein verallgemeinertes Protokoll und einige seiner Anwendungen im biomedizinischen Bereich. Danke fürs Zuschauen!
