Elektrophoretische Mobilität Shift Assay (EMSA)

EMSA, der elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay, auch bekannt als Gel-Shift-Assay, ist ein vielseitiges und empfindliches biochemisches Verfahren. EMSA klärt die Bindung zwischen Proteinen und Nukleinsäuren auf, indem es eine Verschiebung der Banden in der Gelelektrophorese nachweist.

In diesem Video werden die Grundsätze der EMSA beschrieben, ein allgemeines Verfahren vorgestellt und einige Anwendungen erläutert.

DNA-Replikation, -Transkription und -Reparatur sowie die RNA-Verarbeitung sind wichtige biochemische Prozesse. Sie alle beinhalten die Bindung zwischen Proteinen und Nukleinsäuren. Viele schwere Krankheiten und Störungen sind mit Veränderungen in dieser Bindung verbunden. EMSA ist eine Technik zur qualitativen Bestimmung, ob ein bestimmtes Protein an eine bestimmte Nukleinsäure bindet. Zuerst wird die Nukleinsäure markiert, in der Regel mit radioaktivem Phosphor-32, um eine Sonde zu erzeugen. Dann werden das Testprotein und die Nukleinsäuresonde gemischt. Wenn ein Protein an eine Nukleinsäuresonde bindet, hat der resultierende Komplex eine größere Masse und eine andere Konformation als die Nukleinsäure allein.

Nach der Bindung werden die Komplexe mit Gelelektrophorese analysiert. Bei dieser Technik zwingt ein elektrisches Feld Makromoleküle, durch eine Gelmatrix zu wandern. Die Komponenten trennen sich nach Masse, Ladung und Konformation. Die Elektrophorese kann Protein-DNA-Komplexe von ungebundenen Sonden trennen. Da sie unterschiedliche Massen und Konformationen haben, wandern sie unterschiedlich schnell durch das Gel und trennen sich. Die Trennung ist dank des Vorhandenseins des radioaktiven Phosphors leicht zu erkennen und beweist, dass das Protein erfolgreich an die gegebene Nukleinsäure bindet. Um die Identifizierung des Proteins zu verifizieren, wird bei einem “Supershift-Assay” ein Antikörper mit einer bekannten Affinität zu dem Protein verwendet. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, dass die Komplexität weiter verschoben und die Auflösung erhöht wird.

Nachdem wir nun die Prinzipien gesehen haben, sehen wir es uns im Labor an.

Um den Eingriff zu beginnen, muss das Protein isoliert werden. Zu diesem Zweck werden molekularbiologische Techniken verwendet, um das Protein in Zellen zu exprimieren und dann zu reinigen.

Die Nukleinsäure wird amplifiziert und markiert, um eine Sonde zu erstellen. Die Markierung erfolgt durch 10-minütige Inkubation mit dCTP, das radioaktiven Phosphor-32 enthält. Eine strahlensichere Werkbank und Schutzausrüstung sind erforderlich.

Anschließend wird das Gel vorbereitet. Das Gel muss nicht denaturierend sein, um zu verhindern, dass das Protein seine Konformation verändert und sich während der Elektrophorese möglicherweise von der Sonde löst. Polyacrylamid-Gele haben Porengrößen von 5 bis 20 nm und eignen sich für kurze Sonden mit einer Länge von bis zu 100 Basenpaaren. Agarose-Gele haben Porengrößen von 70-700 nm und sind nützlich für größere Sonden.

Nachdem das Protein und die Nukleinsäuresonde nun vorbereitet sind, fahren wir mit der Bindung fort. Eine TRIS-Pufferlösung wird hergestellt und das Protein und die Sonde werden hinzugefügt. Der pH-Wert sollte den physiologischen Bedingungen ähneln und die Salzkonzentration ausreichend sein, um zu verhindern, dass das Protein schwache Bindungen mit Nicht-Ziel-Nukleinsäuren bildet. Die Reaktion läuft 20-30 Minuten bei 4 °C ab.

Der nächste Schritt ist die Elektrophorese. Es wird ein Puffer mit geringer Ionenstärke und einem pH-Wert verwendet, der dem bei der Bindungsreaktion verwendeten entspricht. Es entsteht ein “Caging-Effekt”, der Komplexe stabilisiert, die Beweglichkeit erhöht und die Wärmeentwicklung reduziert. Nach der Elektrophorese werden die Bestandteile des Gels auf Filterpapier übertragen. In einem dunklen Raum wird das Filterpapier dann mit Film belichtet. Wenn das Protein an die Sonde bindet, sind zwei unterschiedliche markierte Regionen im Transfer sichtbar. Eine repräsentiert den Komplex und eine separate die ungebundene Sonde. Die Trennung zeigt, dass das Protein erfolgreich an die Nukleinsäure gebunden hat.

Nachdem wir nun das grundlegende Verfahren gesehen haben, schauen wir uns einige Anwendungen an.

Chromatin ist der dicht gepackte Komplex aus DNA und Proteinen, der in eukaryotischen Zellen vorkommt. Chromatin-Remodeling-Enzyme modifizieren die Struktur, um die DNA für die Transkription zu öffnen. Da sich dadurch die Beweglichkeit des Komplexes verändert, kann EMSA verwendet werden, um die Bindungsaktivität des Enzyms zu untersuchen.

Ein alternativer Ansatz zur Markierung nutzt die Wechselwirkung zwischen DNA und dem Methyltransferase-Enzym. Ein Cofaktor kann so modifiziert werden, dass er über die Methyltransferase dauerhaft an die DNA bindet. Anstatt mit Phosphor-32 zu markieren, wird der Cofaktor an Biotin konjugiert, was vorteilhaft ist, da es nicht radioaktiv ist. Da der Cofaktor in seiner Bindung ortsspezifisch ist, ist er für die Genotypisierung, den Methylierungsnachweis und die Genübertragung relevant. Die biotinilierten Nukleinsäuren werden durch ultraviolette Fluoreszenz detektiert.

Wenn Umweltreize Histidinkinasen, einen “Reaktionsregulator”, aktivieren, phosphoryliert ist. Dies wiederum bindet an die DNA und beeinflusst die Transkription, was von der EMSA untersucht werden kann. Zum Beispiel ein Reaktionsregler in? Es wurde gezeigt, dass Desulfovibrio vulgaris an das interessierende Gen bindet. EMSA wurde verwendet, um zu überprüfen, ob die Bindung stattgefunden hat.

Sie haben sich gerade das Video von JoVE über den elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungs-Assay angesehen. Sie sollten nun die Funktionsprinzipien, die Schritte in seinem Verfahren und die wichtigsten Betriebsparameter verstehen.

Danke fürs Zuschauen!