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Protein-Protein-Wechselwirkungen spielen bei einer Vielzahl biologischer Funktionen eine bedeutende Rolle. Die meisten Protein-Protein-Wechselwirkungen und ihre biologischen Wirkungen müssen noch identifiziert werden. Co-Immunpräzipitation (CoIP) und Pull-down-Assays sind zwei eng verwandte Methoden zur Identifizierung stabiler Protein-Protein-Wechselwirkungen. In diesem Video werden die Prinzipien der beiden Assays, ihre allgemeinen Laborverfahren und die Anwendung dieser Techniken erläutert.
CoIP- und Pull-down-Assays sind Varianten der Immunpräzipitation, einer Methode zur selektiven Isolierung einer Proteinspezies aus einer komplexen Lösung. In einem Immunpräzipitationsexperiment wird einem Antikörper, der für ein Zielprotein spezifisch ist, erlaubt, einen Immunkomplex mit diesem Ziel in der Probe zu bilden. Der Komplex wird dann auf einem festen Träger eingefangen, typischerweise Protein A, das an eine Sepharosekugel gebunden ist. Nicht eingefangene Proteine werden durch Zentrifugationsschritte entfernt. Das Protein wird dann aus dem Antikörper und dem festen Träger freigesetzt, indem es in reduzierendem SDS-PAGE-Probenladepuffer gekocht wird.
Die Co-Immunpräzipitation wird auf die gleiche Weise durchgeführt, mit dem Unterschied, dass intakte Proteinkomplexe auf dem festen Träger eingefangen werden. Der Antikörper bindet an das Zielprotein, das wiederum an ein anderes Protein gebunden ist, auf das der Antikörper nicht abzielt. Wie bei der Immunpräzipitation wird der Proteinkomplex aus dem Antikörper und dem festen Träger freigesetzt, indem er in einem reduzierenden SDS-PAGE-Probenladepuffer gekocht wird.
Pull-down-Assays ähneln der Co-Immunpräzipitation und unterscheiden sich nur durch die Verwendung eines "Köder"-Proteins im Gegensatz zu einem Antikörper. Durch molekularbiologische Techniken wird dieses Köderprotein mit einem Affinitäts-Tag versehen, wie z. B. einer Reihe von Histidinresten. Diese Affinitäts-Tags werden in "Chromatographie-basierte Biomolekül-Trennungen" beschrieben. Das Protein wird dann auf einem immobilisierten Affinitätsliganden eingefangen, der für den Tag spezifisch ist. Das gefangene Protein wird dann mit einer Probe inkubiert, die Proteine enthält, die mit dem "Köder" Komplexe bilden. Der Proteinkomplex wird von der Affinitätsunterstützung befreit, indem er mit einer Lösung gewaschen wird, die einen kompetitiven Analyten enthält, der spezifisch für die Markierung auf dem "Köder"-Protein ist. Pull-down-Assays sind nützlich, um Proteininteraktionen zu bestätigen, die durch Co-Immunpräzipitation vorhergesagt werden, und um unbekannte Proteininteraktionen zu entdecken.
Nachdem nun die Prinzipien der Co-Immunpräzipitation und der Pull-Down-Assays besprochen wurden, schauen wir uns ihre Laborverfahren an.
Lassen Sie uns zunächst über die Co-Immunpräzipitation sprechen. Zu einer Reihe von Mikrofuge-Röhrchen wird folgendes hinzugefügt: PBS-Puffer und eine 50%ige Lösung von Protein A-Sepharose, einem Harz-Protein-Komplex, der an den Antikörper bindet. Die Mikrofuge-Röhrchen werden gedreht, um eine korrekte Verteilung zu gewährleisten, und dann wird das Harz mit zusätzlichem PBS-Puffer gewaschen. Zelllysat, das das gewünschte Protein enthält, und 2 μg Antikörper werden in die Mikrofuge-Röhrchen gegeben, und die Mischung wird 1 h lang bei 4 μC gedreht. Die Kügelchen werden durch Zentrifugation pelletiert, der Überstand wird verworfen und die Kügelchen dreimal mit Puffer erneut gewaschen, um nicht gebundenes Protein zu entfernen. Die Beads, die den Antikörper-Protein-Komplex enthalten, dienen zur Reduktion des SDS-PAGE-Probenladepuffers, zur Entfernung des Komplexes aus dem Antikörper und zur Analyse durch SDS-PAGE und Immunblotting.
Nun gehen wir auf das Vorgehen bei Pull-Down-Assays ein: Das "Köder"-Protein wird in einem Plasmid mit dem passenden Affinitäts-Tag exprimiert. Nach Erreichen des Wachstums in der logaritarischen Phase werden die Zellen lysiert und dann zentrifugiert. Suspendierte Streptavidin-Sepharose-Kügelchen, die mit Biotin markiertes "Köder"-Protein einfangen, werden in ein Mikrofuge-Röhrchen pipettiert. Anschließend werden die Kügelchen zentrifugiert und der Überstand vorsichtig durch Aspiration entfernt. Die Kügelchen werden dann mit Puffer gewaschen, zentrifugiert und der Überstand entfernt.
Zellen, die das vermeintliche Protein "Beute" enthalten, das eine Affinität zum Protein "Köder" hat, werden durch Zentrifugation geerntet. Der Überstand wird dann in das Mikrofurogenröhrchen gegeben, das das Harz enthält, und bei 4 ? C für 3 h auf einem Shaker. Das Harz wird dann zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Harz gewaschen, um das nicht gebundene Protein zu entfernen. Dem Harz wird Elutionspuffer zugesetzt, und die Mischung wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wird das Harz zentrifugiert, und der Überstand, der den gewünschten Komplex enthält, wird durch Immunblotting analysiert.
Nachdem wir nun die Verfahren überprüft haben, schauen wir uns einige der nützlichen Anwendungen von Co-Immunpräzipitation und Pull-Down-Assays an.
Die Co-Immunpräzipitation kann nützlich sein, um den Wirkmechanismus von Enzymen besser zu verstehen. Myxovirus- oder Mx-Resistenzproteine hemmen eine Vielzahl von Viren, einschließlich der Influenza A, für die der Mechanismus nur unzureichend verstanden ist. Die Co-Immunpräzipitation wurde verwendet, um die Interaktion zwischen dem Mx1-Protein der Maus und dem Influenza-Nukleoprotein zu untersuchen.
Pull-down-Assays haben sich als nützlich erwiesen, um die Wirkung von Second Messengern zu untersuchen, bei denen es sich um Proteine handelt, die ein Signal aus der zellulären Umgebung übermitteln. Sie sind Bestandteil eines Signalwegs, bei dem mehrere Proteine als Reaktion auf Umweltreize interagieren. Kalziumionen wirken als sekundäre Botenstoffe, indem sie an Calmodulin binden, das wiederum an eine Vielzahl von Proteinen bindet und so viele Arten von biologischen Reaktionen vermittelt. Ohne das Kalzium kann das Protein nicht an das Calmodulin binden. Ein Pull-down-Assay wurde durchgeführt, um die Fähigkeit von Proteinen zu testen, in Gegenwart oder Abwesenheit von Kalziumionen an Calmodulin zu binden.
Co-Immunpräzipitations- und Pull-down-Assays werden im Allgemeinen zur Analyse stabiler oder starker Proteininteraktionen verwendet, jedoch nicht von transienten. Eine kürzlich erfolgte Entwicklung bei Pull-Down-Assays, der HaloTag, hat die Untersuchung transienter Proteininteraktionen vereinfacht. HaloTag ist ein genetisch kodierter Proteinfusions-Tag, der mit dem interessierenden Protein fusioniert ist und in der Lage ist, chemisch mit einem festen Haloalkan-Träger zu reagieren. Wenn eine funktionelle Analyse gewünscht wird, könnte dann der Proteinkomplex ohne den Tag in seiner Gesamtheit durch Inkubation mit Tabak-Etch-Virusprotease isoliert werden.
Sie haben sich gerade das Video von JoVE über Co-Immunpräzipitation und Pull-Down-Assays angesehen. Dieses Video beschreibt die Prinzipien der beiden Methoden, die allgemeinen Laborverfahren und einige ihrer Anwendungen.
Danke fürs Zuschauen!
