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Co-Immunopräzipitation (CoIP) und Pulldown-Assays sind eng verwandte Methoden, stabiles Protein-Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren. Diese Methoden beziehen sich auf Immunopräzipitation, eine Methode für die Trennung ein Zielprotein an einen Antikörper aus ungebundenen Proteine gebunden. Im CoIP, ist ein Antikörper gebundene Proteine selbst verpflichtet, ein anderes Protein, das nicht mit dem Antikörper bindet, danach erfolgt ein Trennverfahren, das bewahrt die Proteinprotein komplexe. Der Unterschied in der Pulldown-Assays ist, dass die Affinität-Tags Köder Proteine ersetzen Antikörper und Affinitätschromatographie wird verwendet, um Protein-Protein-komplexe zu isolieren.
Dieses Video erklärt CoIP, Pulldown-Assays und deren Umsetzung im Labor. Ein Schritt für Schritt Protokoll für jede Technik wird abgedeckt, einschließlich der Reagenzien, Apparate und Instrumente verwendet, um zu reinigen und gebundene Proteine zu analysieren. Abschnitt "Programme" dieses Video beschreibt darüber hinaus ein Verfahren zur Untersuchung, wie Myxovirus Proteine hemmen Influenza Nucleoprotein, eine Untersuchung über die Rolle von Calcium-Ionen in Calmodulin über ein Pulldown-Assay und eine modifizierte Pulldown-Assay für Charakterisierung von transienten Protein-Interaktionen.
Protein-Protein-Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von biologischen Funktionen. Die Mehrheit der Protein-Protein-Wechselwirkungen und ihre biologischen Wirkungen muss noch identifiziert werden. Co-Immunopräzipitation oder CoIP und Pulldown-Assays sind zwei eng verwandte Methoden zur Identifizierung von stabilen Proteinprotein Interaktionen. Dieses Video wird die Grundsätze der beiden Assays, ihrer allgemeinen Laborverfahren und Anwendungen dieser Techniken abdecken.
CoIP und Pulldown-Assays sind Varianten des Immunopräzipitation, eine Methode zur Isolierung von selektiv ein Protein-Arten aus einer komplexen Lösung. In einem Experiment Immunopräzipitation darf ein Antikörper, der spezifisch für ein Zielprotein einen immun Komplex mit diesem Ziel in der Stichprobe zu bilden. Der Komplex wird dann auf eine solide Unterstützung, in der Regel eine Schranke, eine Perle Sepharose Protein erfasst. Alle Proteine, die nicht erfasst werden durch Zentrifugation Schritte entfernt. Das Protein wird dann von der Antikörper und solide Unterstützung durch Kochen bei der Verringerung der SDS-PAGE Probenbeladung Puffer freigegeben.
Co-Immunopräzipitation erfolgt auf die gleiche Weise, außer dass intakte Proteinkomplexe auf die solide Unterstützung erfasst werden. Der Antikörper bindet an das Zielprotein, die wiederum an ein anderes Protein gebunden ist, die nicht durch die Antikörper richtet. Wie Immunopräzipitation erscheint der Proteinkomplex aus Antikörper und solide Unterstützung durch Kochen bei der Verringerung der SDS-PAGE Probenpuffer laden.
Pulldown-Assays sind ähnlich wie co-Immunopräzipitation, unterscheiden sich nur in der Verwendung eines Proteins "Köder", im Gegensatz zu einem Antikörper. Durch molekularbiologische Techniken ist dieser Köder-Protein mit einer Affinität-Tag, z. B. eine Reihe von Histidin Rückständen entwickelt. Diese Affinität-Tags sind im "Chromatographie-basierte Biomolekül Trennungen." beschrieben. Das Protein wird dann auf einem immobilisierten Affinität Liganden spezifisch für den Tag erfasst. Das aufgenommene Protein wird dann mit einer Probe inkubiert mit Proteinen, die komplexe mit den "Köder" bilden. Der Protein-Komplex wird von der Affinität Unterstützung befreit, durch Waschen mit einer Lösung, die eine wettbewerbsfähige Analyt-spezifische für die Beschriftung auf dem "Köder" Protein. Pulldown-Assays sind nützlich für die Bestätigung von Protein-Interaktionen von co-Immunopräzipitation vorhergesagt und für die Entdeckung unbekannter Proteininteraktionen.
Nun, da die Prinzipien von co-Immunopräzipitation und Pulldown-Assays diskutiert worden sind, schauen Sie sich bitte an ihren Laborverfahren.
Ersten sprechen wir über co-Immunopräzipitation. Zu einer Reihe von Microfuge Rohren, wird Folgendes hinzugefügt: PBS-Puffer und eine 50 % ige Lösung von Protein A-Sepharose, ein Harz-Protein-Komplex, der an der Antikörper bindet. Die Microfuge Röhren sind gedreht, um die korrekte Verteilung zu gewährleisten, und dann wird das Harz mit zusätzlichen PBS-Puffer gewaschen. Zelle lysate, enthält das gewünschte Protein 2 μg Antikörper werden hinzugefügt, um die Microfuge Röhren und die Mischung wird für 1 h bei 4 ° c gedreht Die Perlen sind pelleted durch Zentrifugieren, Überstand wird verworfen, und die Perlen gewaschen wieder dreimal mit Puffer, nicht gebundenen Proteins zu entfernen. Die Perlen den Antikörper-Protein-Komplex, die enthalten sind bei der Verringerung der SDS-PAGE Probenbeladung Puffer, zur Entfernung von der Anlage aus der Antikörper und für die Analyse von SDS-PAGE und Immunoblotting.
Jetzt werden wir das Verfahren für Pulldown-Assays diskutieren: "Köder" Protein wird in ein Plasmid mit dem entsprechenden Affinität Tag ausgedrückt. Nach dem Log-Phase Wachstum erreichen, sind die Zellen lysiert und dann zentrifugiert. Abgehängte Streptavidin-Sepharose-Perlen, die Biotin-Tags "Köder" Protein zu erfassen, sind in ein Microfuge Röhrchen pipettiert. Die Perlen sind dann zentrifugiert und der Überstand vorsichtig durch Absaugen entfernt. Die Perlen werden dann gewaschen, mit Puffer, zentrifugiert, und der Überstand entfernt.
Zellen, die das vermeintliche "Beute" Protein, das eine Affinität für das "Köder" Protein hat, werden durch Zentrifugation geerntet. Der Überstand ist dann das Microfuge Rohr, enthält das Harz hinzugefügt und bei 4 ° C für 3 h auf einem Schüttler inkubiert. Das Harz wird dann zentrifugiert, der Überstand entfernt, und das Harz gewaschen, um nicht gebundenen Proteins zu entfernen. Elution Buffer wird hinzugefügt, um das Harz und die Mischung wird bei Raumtemperatur für 30 min auf einem Schüttler inkubiert. Das Harz wird dann zentrifugiert und der Überstand mit der gewünschten Anlage durch Immunoblotting analysiert.
Nun, da wir die Verfahren überprüft haben, betrachten wir einige der nützlichen Anwendungen von co-Immunopräzipitation und Pulldown-Assays.
Co-Immunopräzipitation kann in besseres Verständnis der Enzyme Wirkmechanismus nützlich sein. Myxovirus- oder Mx-Widerstand-Proteine hemmen eine Vielzahl von Viren, einschließlich der Influenza-A, bei denen der Mechanismus schlecht verstanden wird. Co-Immunopräzipitation wurde verwendet, um die Interaktion zwischen Maus Mx1 Protein und Grippe Nucleoprotein zu studieren.
Pulldown-Assays haben sich bewährt bei der Untersuchung der Auswirkungen von sekundären Botenstoffen, die Proteine, die ein Signal von der zellulären Umgebung kommunizieren. Sie sind ein Bestandteil von einem Signalweg, wo mehrere Proteine als Reaktion auf ökologische Hinweise interagieren. Calcium-Ionen wirken als sekundäre Botenstoffe durch die Bindung an Calmodulin, die wiederum eine Vielzahl von Proteinen, bindet viele Arten von biologischen Reaktionen zu vermitteln. Ohne das Kalzium kann nicht das Protein an die Calmodulin binden.
Co-Immunopräzipitation und Pulldown-Assays sind üblich für die Analyse von stabilen oder stark Protein-Interaktionen, aber nicht vergänglich. Eine neuere Entwicklung in Pulldown-Assays, die HaloTag, wurde die Studie von transienten Proteininteraktionen vereinfacht; HaloTag ist ein genetisch codierte Protein Fusion-Tag, mit dem Protein des Interesses, chemisch reagieren mit einem festen Träger Tetrafluormethan verschmolzen. Auf Wunsch Funktionsanalyse ist das Protein komplex und abzüglich der Tag in seiner Gesamtheit dann isoliert werden konnte durch Inkubation mit Tabak Ätzen Virus-Protease.
Sie haben nur Jupiters Video auf co-Immunopräzipitation und Pulldown-Assays angesehen. Dieses Video beschrieben die Grundsätze der beiden Methoden, die allgemeine Laborverfahren und einige ihrer Anwendungen.
Danke fürs Zuschauen!
Co-Immunpräzipitation (CoIP) und Pull-down-Assays sind eng verwandte Methoden, um stabile Protein-Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren. Diese Methoden stehen im Zusammenhang mit der Immunpräzipitation, einer Methode zur Trennung eines an einen Antikörper gebundenen Zielproteins von ungebundenen Proteinen. Bei CoIP wird ein antikörpergebundenes Protein selbst an ein anderes Protein gebunden, das nicht an den Antikörper bindet, gefolgt von einem Trennprozess, bei dem der Protein-Protein-Komplex erhalten bleibt. Der Unterschied bei Pull-Down-Assays besteht darin, dass affinitätsmarkierte Köderproteine Antikörper ersetzen und die Affinitätschromatographie zur Isolierung von Protein-Protein-Komplexen verwendet wird.
In diesem Video werden CoIP, Pull-Down-Assays und deren Implementierung im Labor erläutert. Es wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für jede Technik behandelt, einschließlich der Reagenzien, Geräte und Instrumente, die zur Reinigung und Analyse gebundener Proteine verwendet werden. Darüber hinaus wird im Anwendungsbereich dieses Videos ein Verfahren zur Untersuchung der Hemmung von Influenza-Nukleoproteinen durch Myxovirus-Proteine, eine Untersuchung der Rolle von Calciumionen in Calmodulin über einen Pull-down-Assay und ein modifizierter Pull-down-Assay zur Charakterisierung transienter Proteininteraktionen beschrieben.
Protein-Protein-Wechselwirkungen spielen bei einer Vielzahl biologischer Funktionen eine bedeutende Rolle. Die meisten Protein-Protein-Wechselwirkungen und ihre biologischen Wirkungen müssen noch identifiziert werden. Co-Immunpräzipitation (CoIP) und Pull-down-Assays sind zwei eng verwandte Methoden zur Identifizierung stabiler Protein-Protein-Wechselwirkungen. In diesem Video werden die Prinzipien der beiden Assays, ihre allgemeinen Laborverfahren und die Anwendung dieser Techniken erläutert.
CoIP- und Pull-down-Assays sind Varianten der Immunpräzipitation, einer Methode zur selektiven Isolierung einer Proteinspezies aus einer komplexen Lösung. In einem Immunpräzipitationsexperiment wird einem Antikörper, der für ein Zielprotein spezifisch ist, erlaubt, einen Immunkomplex mit diesem Ziel in der Probe zu bilden. Der Komplex wird dann auf einem festen Träger eingefangen, typischerweise Protein A, das an eine Sepharosekugel gebunden ist. Nicht eingefangene Proteine werden durch Zentrifugationsschritte entfernt. Das Protein wird dann aus dem Antikörper und dem festen Träger freigesetzt, indem es in reduzierendem SDS-PAGE-Probenladepuffer gekocht wird.
Die Co-Immunpräzipitation wird auf die gleiche Weise durchgeführt, mit dem Unterschied, dass intakte Proteinkomplexe auf dem festen Träger eingefangen werden. Der Antikörper bindet an das Zielprotein, das wiederum an ein anderes Protein gebunden ist, auf das der Antikörper nicht abzielt. Wie bei der Immunpräzipitation wird der Proteinkomplex aus dem Antikörper und dem festen Träger freigesetzt, indem er in einem reduzierenden SDS-PAGE-Probenladepuffer gekocht wird.
Pull-down-Assays ähneln der Co-Immunpräzipitation und unterscheiden sich nur durch die Verwendung eines "Köder"-Proteins im Gegensatz zu einem Antikörper. Durch molekularbiologische Techniken wird dieses Köderprotein mit einem Affinitäts-Tag versehen, wie z. B. einer Reihe von Histidinresten. Diese Affinitäts-Tags werden in "Chromatographie-basierte Biomolekül-Trennungen" beschrieben. Das Protein wird dann auf einem immobilisierten Affinitätsliganden eingefangen, der für den Tag spezifisch ist. Das gefangene Protein wird dann mit einer Probe inkubiert, die Proteine enthält, die mit dem "Köder" Komplexe bilden. Der Proteinkomplex wird von der Affinitätsunterstützung befreit, indem er mit einer Lösung gewaschen wird, die einen kompetitiven Analyten enthält, der spezifisch für die Markierung auf dem "Köder"-Protein ist. Pull-down-Assays sind nützlich, um Proteininteraktionen zu bestätigen, die durch Co-Immunpräzipitation vorhergesagt werden, und um unbekannte Proteininteraktionen zu entdecken.
Nachdem nun die Prinzipien der Co-Immunpräzipitation und der Pull-Down-Assays besprochen wurden, schauen wir uns ihre Laborverfahren an.
Lassen Sie uns zunächst über die Co-Immunpräzipitation sprechen. Zu einer Reihe von Mikrofuge-Röhrchen wird folgendes hinzugefügt: PBS-Puffer und eine 50%ige Lösung von Protein A-Sepharose, einem Harz-Protein-Komplex, der an den Antikörper bindet. Die Mikrofuge-Röhrchen werden gedreht, um eine korrekte Verteilung zu gewährleisten, und dann wird das Harz mit zusätzlichem PBS-Puffer gewaschen. Zelllysat, das das gewünschte Protein enthält, und 2 μg Antikörper werden in die Mikrofuge-Röhrchen gegeben, und das Gemisch wird 1 h lang bei 4 °C gedreht. Die Kügelchen werden durch Zentrifugation pelletiert, der Überstand wird verworfen und die Kügelchen dreimal mit Puffer erneut gewaschen, um nicht gebundenes Protein zu entfernen. Die Beads, die den Antikörper-Protein-Komplex enthalten, dienen zur Reduktion des SDS-PAGE-Probenladepuffers, zur Entfernung des Komplexes aus dem Antikörper und zur Analyse durch SDS-PAGE und Immunblotting.
Nun gehen wir auf das Vorgehen bei Pull-Down-Assays ein: Das "Köder"-Protein wird in einem Plasmid mit dem passenden Affinitäts-Tag exprimiert. Nach Erreichen des Wachstums in der logaritarischen Phase werden die Zellen lysiert und dann zentrifugiert. Suspendierte Streptavidin-Sepharose-Kügelchen, die mit Biotin markiertes "Köder"-Protein einfangen, werden in ein Mikrofuge-Röhrchen pipettiert. Anschließend werden die Kügelchen zentrifugiert und der Überstand vorsichtig durch Aspiration entfernt. Die Kügelchen werden dann mit Puffer gewaschen, zentrifugiert und der Überstand entfernt.
Zellen, die das vermeintliche Protein "Beute" enthalten, das eine Affinität zum Protein "Köder" hat, werden durch Zentrifugation geerntet. Der Überstand wird dann in das Mikrofugenröhrchen mit dem Harz gegeben und 3 h lang bei 4 °C auf einem Schüttler inkubiert. Das Harz wird dann zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Harz gewaschen, um das nicht gebundene Protein zu entfernen. Dem Harz wird Elutionspuffer zugesetzt, und die Mischung wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wird das Harz zentrifugiert, und der Überstand, der den gewünschten Komplex enthält, wird durch Immunblotting analysiert.
Nachdem wir nun die Verfahren überprüft haben, schauen wir uns einige der nützlichen Anwendungen von Co-Immunpräzipitation und Pull-Down-Assays an.
Die Co-Immunpräzipitation kann nützlich sein, um den Wirkmechanismus von Enzymen besser zu verstehen. Myxovirus- oder Mx-Resistenzproteine hemmen eine Vielzahl von Viren, einschließlich der Influenza A, für die der Mechanismus nur unzureichend verstanden ist. Die Co-Immunpräzipitation wurde verwendet, um die Interaktion zwischen dem Mx1-Protein der Maus und dem Influenza-Nukleoprotein zu untersuchen.
Pull-down-Assays haben sich als nützlich erwiesen, um die Wirkung von Second Messengern zu untersuchen, bei denen es sich um Proteine handelt, die ein Signal aus der zellulären Umgebung übermitteln. Sie sind Bestandteil eines Signalwegs, bei dem mehrere Proteine als Reaktion auf Umweltreize interagieren. Kalziumionen wirken als sekundäre Botenstoffe, indem sie an Calmodulin binden, das wiederum an eine Vielzahl von Proteinen bindet und so viele Arten von biologischen Reaktionen vermittelt. Ohne das Kalzium kann das Protein nicht an das Calmodulin binden. Ein Pull-down-Assay wurde durchgeführt, um die Fähigkeit von Proteinen zu testen, in Gegenwart oder Abwesenheit von Kalziumionen an Calmodulin zu binden.
Co-Immunpräzipitations- und Pull-down-Assays werden im Allgemeinen zur Analyse stabiler oder starker Proteininteraktionen verwendet, jedoch nicht von transienten. Eine kürzlich erfolgte Entwicklung bei Pull-Down-Assays, der HaloTag, hat die Untersuchung transienter Proteininteraktionen vereinfacht. HaloTag ist ein genetisch kodierter Proteinfusions-Tag, der mit dem interessierenden Protein fusioniert ist und in der Lage ist, chemisch mit einem festen Haloalkan-Träger zu reagieren. Wenn eine funktionelle Analyse gewünscht wird, könnte dann der Proteinkomplex ohne den Tag in seiner Gesamtheit durch Inkubation mit Tabak-Etch-Virusprotease isoliert werden.
Sie haben sich gerade das Video von JoVE über Co-Immunpräzipitation und Pull-Down-Assays angesehen. Dieses Video beschreibt die Prinzipien der beiden Methoden, die allgemeinen Laborverfahren und einige ihrer Anwendungen.
Danke fürs Zuschauen!
Protein-Protein-Wechselwirkungen spielen bei einer Vielzahl biologischer Funktionen eine bedeutende Rolle. Die meisten Protein-Protein-Wechselwirkungen und ihre biologischen Wirkungen müssen noch identifiziert werden. Co-Immunpräzipitation (CoIP) und Pull-down-Assays sind zwei eng verwandte Methoden zur Identifizierung stabiler Protein-Protein-Wechselwirkungen. In diesem Video werden die Prinzipien der beiden Assays, ihre allgemeinen Laborverfahren und die Anwendung dieser Techniken erläutert.
CoIP- und Pull-down-Assays sind Varianten der Immunpräzipitation, einer Methode zur selektiven Isolierung einer Proteinspezies aus einer komplexen Lösung. In einem Immunpräzipitationsexperiment wird einem Antikörper, der für ein Zielprotein spezifisch ist, erlaubt, einen Immunkomplex mit diesem Ziel in der Probe zu bilden. Der Komplex wird dann auf einem festen Träger eingefangen, typischerweise Protein A, das an eine Sepharosekugel gebunden ist. Nicht eingefangene Proteine werden durch Zentrifugationsschritte entfernt. Das Protein wird dann aus dem Antikörper und dem festen Träger freigesetzt, indem es in reduzierendem SDS-PAGE-Probenladepuffer gekocht wird.
Die Co-Immunpräzipitation wird auf die gleiche Weise durchgeführt, mit dem Unterschied, dass intakte Proteinkomplexe auf dem festen Träger eingefangen werden. Der Antikörper bindet an das Zielprotein, das wiederum an ein anderes Protein gebunden ist, auf das der Antikörper nicht abzielt. Wie bei der Immunpräzipitation wird der Proteinkomplex aus dem Antikörper und dem festen Träger freigesetzt, indem er in einem reduzierenden SDS-PAGE-Probenladepuffer gekocht wird.
Pull-down-Assays ähneln der Co-Immunpräzipitation und unterscheiden sich nur durch die Verwendung eines "Köder"-Proteins im Gegensatz zu einem Antikörper. Durch molekularbiologische Techniken wird dieses Köderprotein mit einem Affinitäts-Tag versehen, wie z. B. einer Reihe von Histidinresten. Diese Affinitäts-Tags werden in "Chromatographie-basierte Biomolekül-Trennungen" beschrieben. Das Protein wird dann auf einem immobilisierten Affinitätsliganden eingefangen, der für den Tag spezifisch ist. Das gefangene Protein wird dann mit einer Probe inkubiert, die Proteine enthält, die mit dem "Köder" Komplexe bilden. Der Proteinkomplex wird von der Affinitätsunterstützung befreit, indem er mit einer Lösung gewaschen wird, die einen kompetitiven Analyten enthält, der spezifisch für die Markierung auf dem "Köder"-Protein ist. Pull-down-Assays sind nützlich, um Proteininteraktionen zu bestätigen, die durch Co-Immunpräzipitation vorhergesagt werden, und um unbekannte Proteininteraktionen zu entdecken.
Nachdem nun die Prinzipien der Co-Immunpräzipitation und der Pull-Down-Assays besprochen wurden, schauen wir uns ihre Laborverfahren an.
Lassen Sie uns zunächst über die Co-Immunpräzipitation sprechen. Zu einer Reihe von Mikrofuge-Röhrchen wird folgendes hinzugefügt: PBS-Puffer und eine 50%ige Lösung von Protein A-Sepharose, einem Harz-Protein-Komplex, der an den Antikörper bindet. Die Mikrofuge-Röhrchen werden gedreht, um eine korrekte Verteilung zu gewährleisten, und dann wird das Harz mit zusätzlichem PBS-Puffer gewaschen. Zelllysat, das das gewünschte Protein enthält, und 2 μg Antikörper werden in die Mikrofuge-Röhrchen gegeben, und die Mischung wird 1 h lang bei 4 μC gedreht. Die Kügelchen werden durch Zentrifugation pelletiert, der Überstand wird verworfen und die Kügelchen dreimal mit Puffer erneut gewaschen, um nicht gebundenes Protein zu entfernen. Die Beads, die den Antikörper-Protein-Komplex enthalten, dienen zur Reduktion des SDS-PAGE-Probenladepuffers, zur Entfernung des Komplexes aus dem Antikörper und zur Analyse durch SDS-PAGE und Immunblotting.
Nun gehen wir auf das Vorgehen bei Pull-Down-Assays ein: Das "Köder"-Protein wird in einem Plasmid mit dem passenden Affinitäts-Tag exprimiert. Nach Erreichen des Wachstums in der logaritarischen Phase werden die Zellen lysiert und dann zentrifugiert. Suspendierte Streptavidin-Sepharose-Kügelchen, die mit Biotin markiertes "Köder"-Protein einfangen, werden in ein Mikrofuge-Röhrchen pipettiert. Anschließend werden die Kügelchen zentrifugiert und der Überstand vorsichtig durch Aspiration entfernt. Die Kügelchen werden dann mit Puffer gewaschen, zentrifugiert und der Überstand entfernt.
Zellen, die das vermeintliche Protein "Beute" enthalten, das eine Affinität zum Protein "Köder" hat, werden durch Zentrifugation geerntet. Der Überstand wird dann in das Mikrofurogenröhrchen gegeben, das das Harz enthält, und bei 4 ? C für 3 h auf einem Shaker. Das Harz wird dann zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Harz gewaschen, um das nicht gebundene Protein zu entfernen. Dem Harz wird Elutionspuffer zugesetzt, und die Mischung wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wird das Harz zentrifugiert, und der Überstand, der den gewünschten Komplex enthält, wird durch Immunblotting analysiert.
Nachdem wir nun die Verfahren überprüft haben, schauen wir uns einige der nützlichen Anwendungen von Co-Immunpräzipitation und Pull-Down-Assays an.
Die Co-Immunpräzipitation kann nützlich sein, um den Wirkmechanismus von Enzymen besser zu verstehen. Myxovirus- oder Mx-Resistenzproteine hemmen eine Vielzahl von Viren, einschließlich der Influenza A, für die der Mechanismus nur unzureichend verstanden ist. Die Co-Immunpräzipitation wurde verwendet, um die Interaktion zwischen dem Mx1-Protein der Maus und dem Influenza-Nukleoprotein zu untersuchen.
Pull-down-Assays haben sich als nützlich erwiesen, um die Wirkung von Second Messengern zu untersuchen, bei denen es sich um Proteine handelt, die ein Signal aus der zellulären Umgebung übermitteln. Sie sind Bestandteil eines Signalwegs, bei dem mehrere Proteine als Reaktion auf Umweltreize interagieren. Kalziumionen wirken als sekundäre Botenstoffe, indem sie an Calmodulin binden, das wiederum an eine Vielzahl von Proteinen bindet und so viele Arten von biologischen Reaktionen vermittelt. Ohne das Kalzium kann das Protein nicht an das Calmodulin binden. Ein Pull-down-Assay wurde durchgeführt, um die Fähigkeit von Proteinen zu testen, in Gegenwart oder Abwesenheit von Kalziumionen an Calmodulin zu binden.
Co-Immunpräzipitations- und Pull-down-Assays werden im Allgemeinen zur Analyse stabiler oder starker Proteininteraktionen verwendet, jedoch nicht von transienten. Eine kürzlich erfolgte Entwicklung bei Pull-Down-Assays, der HaloTag, hat die Untersuchung transienter Proteininteraktionen vereinfacht. HaloTag ist ein genetisch kodierter Proteinfusions-Tag, der mit dem interessierenden Protein fusioniert ist und in der Lage ist, chemisch mit einem festen Haloalkan-Träger zu reagieren. Wenn eine funktionelle Analyse gewünscht wird, könnte dann der Proteinkomplex ohne den Tag in seiner Gesamtheit durch Inkubation mit Tabak-Etch-Virusprotease isoliert werden.
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