Name: Zubereitung frische retinalen Scheiben von Erwachsenen Zebrafisch für Ex Vivo Imaging-Experimente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Lernen Sie die Präparation frischer Netzhautscheiben von erwachsenen Zebrafischen für Ex-Vivo-Imaging-Experimente. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Calciumionen-Dynamiken in spezifischen retinalen Zelltypen.

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Wir danken Ralph Nelson und Daniel Possin für durchdachte Beratung bei der Entwicklung dieses Protokoll, und Eva Ma Ashley und George Gail Stanton zur Erzeugung von stabilen transgenen Zebrafisch-Linien. Die Arbeit wurde unterstützt durch NSF GRFP 2013158531, M.G., NIH NEI 5T32EY007031, W.C. und M.G. und EY026020, j.h. und S.B.

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<li>Kioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intramitochondrial+ATP+levels+identifies+G0%2FG1+switch+gene+2+as+a+positive+regulator+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).</li>
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<li>Neuhauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetic+approaches+to+visual+system+development+and+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish.</a> J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).</li>
<li>Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mutation+in+the+Cone-Specific+pde6+Gene+Causes+Rapid+Cone+Photoreceptor+Degeneration+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish.</a> J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).</li>
<li>Gross, J., Perkins, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mutants+as+models+for+congenital+ocular+disorders+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans.</a> Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).</li>
<li>Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-Type+Cone+Photoreceptors+Persist+Despite+Neighboring+Mutant+Cone+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration.</a> J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).</li>
<li>Wang, T. -M., Holzhausen, L., Kramer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+an+optogenetic+pH+sensor+reveals+that+protons+mediate+lateral+inhibition+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina.</a> Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).</li>
<li>Van Hook, M., Thoreson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Whole-cell+Recordings+from+Photoreceptors+and+Second-order+Neurons+in+an+Amphibian+Retinal+Slice+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation.</a> J. Vis. Exp. (76), e50007(2013).</li>
<li>Connaughton, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+retinal+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish retinal slice preparation.</a> Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).</li>
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<li>George, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptojanin+1+is+required+for+endolysosomal+trafficking+of+synaptic+proteins+in+cone+photoreceptor+inner+segments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments.</a> PLoS ONE. 9 (1), e84394(2014).</li>
<li>George, A. Synaptojanin1 is involved in endolysosomal trafficking in cone photoreceptors (Doctoral dissertation). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://hdl.handle.net/1773/33102">http://hdl.handle.net/1773/33102</a> (2015).</li>
<li>Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+homologous+recombination-mediated+genome+engineering+in+zebrafish+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases.</a> Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).</li>
<li>Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , Poster abstract (2015).</li>
<li>Kanow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+Maintain+Distinct+Ca2%2B+Pools+in+Cone+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).</li>
<li>Uckermann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+staining+by+vital+dyes+of+M%C3%BCller+glial+cells+in+retinal+wholemounts%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts.</a> Glia. 45 (1), 59-66 (2003).</li>
<li>Johnson, S., Rabinovitch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+excised+tissue+using+vital+dyes+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cytometry%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy.</a> Current protocols in cytometry. , Chapter 9, Unit 9.39 (2012).</li>
<li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Ca2%2B+Dynamics+in+Cone+Photoreceptor+Axon+Terminals+of+the+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina.</a> J. Vis. Exp. (99), (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Ex-Vivo Bildgebung frische Zebrafisch retinalen Scheiben erweist sich ein vielseitiges Werkzeug für das Studium Photorezeptor Biologie20,21,22und ist einzigartig, da es ermöglicht Analyse einzelner Zellen in eine Reife, voll differenzierte Netzhaut. Mit etwas Übung ist es möglich, mehrere Experimente mit Gewebe von Fischen, auch mit seriellen Scheiben aus dem gleichen Teil der Netzhaut. Zusätzlich zu den Herausforderung...

Der Zebrabärbling (Danio Rerio) hat in medizinischen und grundlegende wissenschaftliche Forschung1, aufgrund seiner geringen Größe, schnelle Entwicklung und vertebrate Organsysteme verbreitet werden. Die natürliche Transparenz des zebrafischlarven in Kombination mit bewährten Methoden für die Transgenese konnten detaillierte Visualisierung zellulärer Prozesse in ein lebendes Tier. Eine Reihe von genetisch codierte fluoreszierende Biosensoren haben spezifische Zebrafisch Zellen zur Erkennung von Ca2 + 2, Wasserstoffperoxid3, apoptotischen Aktivierung4 und ATP5ins Visier genommen.
In-Vivo Bildgebung von zebrafischlarven führte zum Durchbruch auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, einschließlich der Zuordnung von Gehirn Schaltungen6 und Arzneimittelentwicklung für zentrale Nervensystem Erkrankungen7. Zebrafisch eignen sich gut für Vision Forschung, weil ihre Netzhaut sind mit laminarer Struktur und Neuron Typen der höheren Wirbeltiere, und sie zeigen robuste visuelle Verhalten8,9. Verschiedene Arten von retinalen Degenerationen analog zur menschlichen Krankheit wurden erfolgreich modelliert und im Zebrafisch10,11, einschließlich live Darstellung der einzelnen Fotorezeptoren degeneriert innerhalb einer Netzhaut-2untersucht, 12.
Während in Vivo Larven Zebrafisch-Bildgebung ein wertvolles Instrument ist, wird es schwieriger, wenn Fische wachsen und sich entwickeln Pigmentierung, und einige pharmakologischen Behandlungen können kein ganzes Tier zu durchdringen. Darüber hinaus ändern bestimmte zelluläre Prozesse mit Entwicklung und Alter, machen spätere Zeitpunkte für Verständnis-Funktion und das Fortschreiten der Krankheit bei erwachsenen Tieren. Biochemische Methoden wie Immunoblot, Quantitiative PCR, O2 Verbrauch und Metabolomic Analysen liefern wichtige Hinweise zur Biologie der Netzhaut als Ganzes, aber es ist schwer zu erkennen, Beiträge der einzelnen Zelltypen betroffen Erkrankung. Isolierte netzhautgewebe ex Vivo Imaging umgeht diese Probleme, und während imaging-flach montierten Netzhaut bietet einen Ausblick auf die äußere Netzhaut13, tiefere inneren Netzhaut Eigenschaften verdunkelt. Transversale Retinal Scheiben, wie die in festen immunhistochemische Analysen einen klaren Überblick über alle Schichten und Zelltypen ermöglichen bieten aber nur eine Momentaufnahme der dynamischen Prozesse in der normalen Funktion und Krankheit.
Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Erzeugung von ex-Vivo quer retinalen Scheiben aus Erwachsenen Zebrafisch für die Bildgebung. Es ähnelt dem Verfahren zur Herstellung von Amphibien und Zebrafisch retinaler Scheiben für elektrophysiologische und morphologische Studien14,15, mit wichtigen Änderungen für Zeitraffer- ex Vivo mit confocal imaging Mikroskopie. Fluoreszenz Antworten von Biosensoren oder Farbstoffen in Scheiben werden in Echtzeit mit einem konfokalen Mikroskop überwacht, während liefern pharmakologische Wirkstoffe mit Perfusion. Während die Methode für die Photorezeptoren imaging entwickelt wurde, kann es, es zu benutzen, zur Visualisierung von Müller-Zellen, Bipolarzellen, horizontalen Zellen, amakrinen Zellen oder retinalen Ganglienzellen mit entsprechenden fluoreszierende Markierungen möglich sein. Darüber hinaus können die Scheiben mit Zelle durchlässig Fluoreszenzfarbstoffen Bericht Zellviabilität, vesikuläre Transport, mitochondriale Funktion oder Redox-Zustand geladen werden. Diese vielseitige Vorbereitung ermöglicht Visualisierung einer breiten Palette von subzellulären Prozessen in der Netzhaut, einschließlich Ca2 + Dynamik, Signaltransduktion und metabolischen Zustand.

<table><tbody><tr><td>Zebrafisch</td><td>University of Washington South Lake Union Aquatics Facility</td><td></td><td>Bestände werden als stabile transgene Linien im eigenen Haus aufbewahrt</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-090-843</td><td>für Vaseline Spritze</td></tr><tr><td>3-mL Slip Tip Spritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-436</td><td>für Vaseline</td></tr><tr><td>Spritze 20g 3,8 cm Slip Tip</td><td>Nadel Fisher Scientific</td><td>14-826-5B</td><td>für Vaseline Spritze</td></tr><tr><td>glatt 7 cm x 2,5 cm Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>für Augenmuscheldissektion, Schnittkammer</td></tr><tr><td>Seche Vite Klarlack</td><td>Amazon</td><td>B00150LT40</td><td>für Schnittkammer</td></tr><tr><td>18 mm x 18 mm #1 Glasdeckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td>für bildgebende Leitern</td></tr><tr><td>geschmacksneutrales Zahnwachs</td><td>Amazon</td><td>B01K8WNL5A</td><td>für die Bildgebung von Leitern</td></tr><tr><td>mit doppelschneidiger Rasierklinge</td><td>Stoelting</td><td>51427</td><td>für das Schneiden</td></tr><tr><td>von Gewebeschneidemaschinen mit digitalem Mikrometer</td><td>Stoelting</td><td>51415</td> für Filterpapier zum <td>Schneiden von Geweben</td></tr><tr><td>- weiß gerasterte Mischzellulose, 13 mm Durchmesser, 0,45 &; Mikro; m Porengröße</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWG01300</td><td>Filterpapier zur Befestigung von Netzhäuten</td></tr><tr><td>10 cm Petrischale</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>für Fischeuthanasie, Sezier, Bildgebung Leitermontage</td></tr><tr><td>15 cm Applikatorstift aus Holz mit glatter Spitze</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-112</td><td>für Drahtösen-Schlaufenwerkzeug</td></tr><tr><td>30 g (0,25 mm Durchmesser) Wolframdraht</td><td>Fisher</td><td>Scientific AA10408G6</td><td>für Drahtaugenschlaufenwerkzeug</td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td>Bestandteil der Nahrungsergänzungsmittel-Stammlösung</td></tr><tr><td>Natrium-L-Lactat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L7022</td><td>Bestandteil der Nahrungsergänzungsmittel-Stammlösung</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2256</td><td>Bestandteil der Nahrungsergänzungsmittel-Stammlösung</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>Bestandteil der Nahrungsergänzungsmittel-Stammlösung</td></tr><tr><td>&nbsp; L-Glutathion, reduziert</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>Bestandteil der Ergänzungsstoff-Stammlösung</td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td>Bestandteil der Ergänzungs-Stammlösung</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Bestandteil der Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>Bestandteil der Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td>Komponente der Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8282</td><td>Komponente der Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>MgCl2 &middot; 6H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0250</td><td>Komponente der Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>Komponente der Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152</td><td>Komponente aus Na+-frei Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-003-063</td><td>Komponente aus Na+</s>up-frei Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Bestandteil der Na+-freien Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>50 mL konisches Zentrifugenröhrchen</td><td>Denville Scientific</td><td>C1062-P</td><td>Behälter für Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>Vannas Schere - 8 cm, abgewinkelte 5 mm Klingen</td><td>World Precision Instruments</td><td>501790</td><td>Mikroschere für die Augenmuschel-Dissektion</td></tr><tr><td>Schweizer Pinzette - #5, 11 cm, gerade, 0,06 x 0,07 mm Spitzen</td><td>World Precision Instruments</td><td>504510</td><td>Feine Pinzette zum Diszieren und Schneiden von Scheiben</td></tr><tr><td>Einschneidige</td><td>Rasierklingen Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>zum Dissektion und Trimmen der Augenmuschel Filterpapier</td></tr><tr><td>EMD Millipore Filterzange</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX6200006P</td><td>Flachzange für das Handling von nassem Filterpapier</td></tr><tr><td>C12 558/568 BODIPY</td><td>Fisher Scientific</td><td>D3835</td><td>färbt lebende Zellkerne; Inkubieren 5 & Mikro; g/mL für 15 min bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Propidiumiodid (PI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td>färbt tote Zellkerne; inkubieren 5 & Mikro; g/mL für 20 min bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific</td><td>62249</td><td>färbt lebende Zellkerne; inkubiert 5 & Mikro; g/mL für 20 min bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin, Methylester (TMRM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T668</td><td>färbt funktionelle, negativ geladene Mitochondrien; inkubiert 1 nM für 30 min bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Gewebeperfusionskammer</td><td>Cell MicroControls</td><td>BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]</td><td>Bildgebungskammer für Injektion oder Perfusion</td></tr><tr><td>2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Desoxyglucose (NBDG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>N13195</td><td>fluoreszierendes Glukoseanalogon, das Zebrafischen 30 Minuten vor der Euthanasie oral verabreicht</td></tr> wird <tr><td>Konfokalmikroskop Olympus Laserscanning Konfokalmikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>zur Visualisierung der Fluoreszenz von Schnitten mit Einzelzellauflösung</td></tr><tr><td>Carbonylcyanid 3-chlorphenylhydrazon (CCCP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2759</td><td>experimentelles Reagenz, das die mitochondriale Atmung abliert; Schneiden bis zu einer Endkonzentration von 1 & Mikro behandeln; M</td></tr><tr><td>Miniatur-Aspirator-Positionierer</td><td>Cell MicroControls</td><td>FL-1</td><td>für Perfusions-Perfusionsverteiler</td></tr><tr><td>, Gas-Bubbler-Verteiler, Durchflussventil, 60cc Spritzenhalter</td><td>Warner Instruments</td><td>diverse</td><td>für Perfusion</td></tr></tbody></table>

zubereitung frische retinalen scheiben von erwachsenen zebrafisch für ex vivo imaging-experimente

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Die Netzhaut ist ein komplexes Gewebe, die initiiert und die ersten Schritte der Vision integriert. Funktionsstörung des retinalen Zellen ist ein Markenzeichen von vielen blendenden Krankheiten, und zukünftige Therapien abhängen, wie verschiedene Retinal grundlegende Verständnis, dass Zellen normal zu funktionieren. Gewinnung solcher Informationen mit biochemischen Methoden hat schwierig erwiesen, da Beiträge von bestimmten Zelltypen in der Netzhaut Zellmilieu vermindert werden. Live retinale Bildgebung bieten einen Überblick über zahlreiche biologische Prozesse auf subzellulärer Ebene, dank einer wachsenden Zahl von genetisch codierte fluoreszierende Biosensoren. Jedoch wurde diese Technik bisher beschränkt, Kaulquappen und zebrafischlarven, die äußersten Netzhaut Schichten der isolierten Netzhaut oder niedriger Auflösung Bildgebung der Netzhaut mit lebenden Tieren. Hier präsentieren wir eine Methode zur Erzeugung von live ex Vivo retinalen Scheiben aus Erwachsenen Zebrafisch für live Imaging über konfokalen Mikroskopie. Dieses Präparat liefert Quere Scheiben mit allen Schichten der Netzhaut und die meisten Zelltypen sichtbar für die Durchführung von konfokalen bildgebender Untersuchungen mit Perfusion. Transgene Zebrafisch mit dem Ausdruck ihrer fluoreszierende Proteine oder Biosensoren in bestimmten retinalen Zelltypen oder Organellen sind einzellige Informationsextraktion aus eine intakte Netzhaut verwendet. Darüber hinaus können retinale Scheiben mit fluoreszierenden indikatorfarbstoffen, die Methode Vielseitigkeit hinzu geladen werden. Dieses Protokoll wurde entwickelt für imaging Ca2 + im Zebrafisch-Zapfen-Photorezeptoren, aber mit richtigen Marker könnte es um Ca2 + oder Metaboliten in Müller-Zellen, bipolar und horizontalen Zellen, Mikroglia, amakrinen Zellen oder Retinal Messen angepasst werden Ganglienzellen. Das retinale Pigmentepithel wird aus Scheiben entfernt, so ist diese Methode nicht geeignet für das Studium dieser Zelltyp. Mit etwas Übung ist es möglich, seriellen Scheiben von einem Tier für mehrere Experimente zu generieren. Diese anpassungsfähige Technik ist ein leistungsstarkes Tool für die Beantwortung vieler Fragen über retinale Zellbiologie, Ca2 +und Energie-Homöostase.

Stabile Positionierung und transversale Ausrichtung der Scheiben sind Schlüssel für erfolgreiche Bildbearbeitung mit Injektion oder Perfusion pharmakologischer Substanzen. Sorgfältig prüfen Sie und positionieren Sie Scheiben vor konfokale Bildgebung zu, wie notwendig, um sicherzustellen, dass alle Schichten der Netzhaut sind sichtbar (Abbildung 2A, Teil Ii). Wenn eine Scheibe gedreht wird leicht nach vorne (Abb. 2A, Slice-Iii), B...

Imaging netzhautgewebe kann einzellige Informationen liefern, die von den traditionellen biochemischen Methoden gesammelt werden kann nicht. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Netzhaut Scheiben von Zebrafisch für die konfokale Bildgebung. Fluoreszierende genetisch codierten Sensoren oder indikatorfarbstoffen erlaubt Visualisierung von zahlreichen biologischen Prozessen in verschiedenen retinalen Zelltypen.

Zubereitung frische retinalen Scheiben von Erwachsenen Zebrafisch für Ex Vivo Imaging-Experimente

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, frische Scheiben von Zebrafisch-Netzhäuten für Experimente vorzubereiten, die eine Live-Bildgebung von fluoreszierenden Proteinen oder Biosensoren erfordern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Sehforschung zu beantworten, wie z.B. die physiologische und metabolische Rolle von Kalziumionen in bestimmten Zelltypen und zellulären Kompartimenten innerhalb einer Netzhaut. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie räumliche und zeitliche Informationen über wichtige Metaboliten und Signalmoleküle in lebenden Geweben liefert.Um das retinale Pigmentepithel (RPE) aus dem Zebrafisch entfernen zu können, wird der Fisch eine Stunde lang dunkel angepasst, bevor Gewebeschnitte gemacht werden. Für eine Schnittkammer malen Sie Nagellacklinien auf eine Folie. Malen Sie mit klarem Nagellack schmale Linien, um ein Rechteck zu erstellen.Malen Sie den Lack einmal neu, wenn er trocken ist. Wenn die Kammer für statische Bildgebung oder Injektionsexperimente mit minimalem Lösungsfluss verwendet wird, tragen Sie mit einer Spritze zwei parallele Streifen Vaseline auf ein Deckglas auf, die einen Zentimeter lang und 0,5 Zenti

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieser Artikel beschreibt einen Ansatz zur Zebrafisch Retina mit und ohne Pigmentepithel angebracht, von einem bis drei Tagen der Befruchtung Embryonen microdissect.

Mikrodissektion von Zebrafisch Embryonale Augentücher

In diesem Video werden Techniken für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Zeitraffer-Imaging wird verwendet, um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses zu...

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

Das Video demonstriert eine Methode zur Kultivierung primärer retinaler Ganglienzellen aus Zebrafischembryonen. Embryonen im Frühstadium werden dissektioniert, um die Augen zu isolieren, die anschließend mechanisch in eine Suspension aus retinalen Ganglienzellen dissoziiert werden. Diese Zellsuspension wird auf Deckgläsern kultiviert, die mit Klebeproteinen beschichtet sind, um die Axonentwicklung zu erleichtern.

Erzeugung von primären retinalen Ganglienzellkulturen aus Zebrafischembryonen

Imaging von zerebrovaskulären Entwicklung in Zebrafisch-Larven beschrieben. Techniken zur 3D-Bildgebung zu erleichtern und zu ändern zerebrovaskuläre Entwicklung mit chemischen Behandlungen sind ebenfalls vorhanden.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Wir stellen eine effiziente Methode zur retrograden Markierung von retinalen Ganglienzellen (RGCs) in adulten Zebrafischen vor.

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen im erwachsenen Zebrafisch mit Fluoreszenzfarbstoffen

Mehrere leichte Schäden Protokolle, um Schäden Photorezeptoren beschrieben worden und folglich induzieren eine Netzhautregeneration Reaktion in erwachsenen Zebrafisch. Dieses Protokoll beschreibt ein verbessertes Verfahren, das in pigmentierten Tieren verwendet werden kann und dass Schäden, die überwiegende Mehrheit der lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen über die gesamte Netzhaut.

A Novel leichte Schäden Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafisch

Zebrabärbling retinale Regeneration hat meist unter Verwendung von Festnetzhäuten untersucht. Allerdings dynamische Prozesse wie interkinetic Kern Migration treten während der regenerativen Reaktion und erfordern Live-Cell-Imaging die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir Kultur und Abbildungsbedingungen Interkinetic Kern Migration (INM) in Echtzeit unter Verwendung von Multiphotonen-Mikroskopie zu überwachen.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur subzellulären Protein Lokalisierung auf Zebrafisch Netzhaut Ergebnisse korrelieren Höchstauflösung Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie Bilder scannen.

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

Hier diskutieren wir eine Methode-Protokoll ermöglicht eine einfache Analyse der Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch retinalen Gefäßsystem als eine schnelle Auslesung in Einstellungen des langfristigen vaskuläre Krankheiten Neoangiogenese und strukturelle Veränderungen verbunden.

Diabetes durch die Augen eines Fisches zu studieren: Mikrodissektion, Visualisierung und Analyse von den Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Retinal Gefäßsystem

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines genetisch kodierten Wasserstoffperoxid (H2O2)-Biosensors in kultivierten Zebrafischneuronen und Larven zur Beurteilung der physiologischen Signalfunktionen vonH2O2während der Entwicklung des Nervensystems. Es kann auf verschiedene Zelltypen angewendet und mit experimentellen Behandlungen modifiziert werden, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in der allgemeinen Entwicklung zu untersuchen.

ROS Live Cell Imaging während der neuronalen Entwicklung

Der Artikel erklärt, wie man Augen von lebenden Zebrafischlarven chirurgisch entfernt, als ersten Schritt zur Untersuchung, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums beeinflusst. Darüber hinaus enthält der Artikel Informationen über Larvenanästhesie, Fixierung und Hirndissektion, gefolgt von Immunhistochemie und konfokaler Bildgebung.

Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

Lernen Sie die Präparation frischer Netzhautscheiben von erwachsenen Zebrafischen für Ex-Vivo-Imaging-Experimente. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Calciumionen-Dynamiken in spezifischen retinalen Zelltypen.

Zubereitung frische retinalen Scheiben von Erwachsenen Zebrafisch für Ex Vivo Imaging-Experimente

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