Engineering-"Golden" Fluoreszenz durch Selektionsdruck Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren und Protein-Analyse durch Massenspektrometrie und Fluoreszenz

Das Ziel dieses Experiments ist es, eine kanonische Aminosäure durch eine nicht-kanonische Aminosäure für die rekombinante Proteinproduktion durch selektiven Druckeinbau zu ersetzen, um das neuartige fluoreszierende Goldprotein herzustellen. Mit dem Verfahren des selektiven Druckeinbaus sollen Proteine mit neuartigen chemischen Eigenschaften hergestellt werden. Dies ist besonders nützlich, wenn versucht wird, die Funktion von Proteinen zu verstehen oder zu beeinflussen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie relativ einfach durchzuführen ist, da sie der üblichen rekombinanten Proteinproduktion ähnelt. Die zeit- und wellenlängenkorrelierte Fluoreszenz ist hilfreich, um die Dynamik des angeregten Zustands des modifizierten Proteins zu untersuchen, was wiederum das Verständnis des Einflusses der in das Chromophor eingebrachten nicht-kanonischen Aminosäure auf die optischen Eigenschaften erleichtert. SPI kann prinzipiell auf jede Proteinproduktionsumgebung angewendet werden, für die auxotrophe Stämme und chemisch definierte Medien zur Verfügung stehen.

Dazu gehören auch andere Bakterienstämme und auch Säugetierzellkulturen. Das Timing und die Einrichtung der Expressionsbedingungen sind entscheidend, da es zwingend erforderlich ist, die Produktion des nicht-modifizierten Wildtyp-Proteins zu unterdrücken. Deshalb müssen bestimmte Parameter wie die Temperatur, der Zeitpunkt der Induktion oder die Zusammensetzung des Kulturmediums optimiert werden.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir nach ersten Untersuchungen von Proteinextrakt mit methylhaltigen Aminosäuren wie Selenomethionin. Das Verfahren wird von Almut Pelzer, einer Studentin aus meinem Labor, vorgeführt. Um dieses Verfahren zu beginnen, transformieren Sie auxotrophe Tryptophan-E.coli-Zellen mit dem Expressionsplasmid für ECFP.

Verwenden Sie eine einzelne Kolonie, um eine Vorkultur von fünf Millilitern LB-Medium, ergänzt mit Ampicillin, in einem Kulturröhrchen zu inokulieren. Über Nacht bei 37 Grad Celsius und 200 U/min inkubieren. Am nächsten Tag werden 100 Milliliter des supplementierten NMM19-Mediums mit einem Milliliter der Nachtkultur in einem Ein-Liter-Erlenmeyerkolben beimpft.

Inkubieren Sie die Kultur dann über Nacht in einem Orbitalschüttler bei 200 U/min und 30 Grad Celsius. Messen Sie am nächsten Tag alle 30 Minuten die optische Dichte bei 600 Nanometern, bis sich der Wert über 30 Minuten um weniger als 0,05 ändert. Als nächstes zentrifugieren Sie die Kultur bei 5.000 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten, um die Bakterienzellen zu ernten.

Entsorgen Sie den Überstand durch Dekantieren. Resuspendieren Sie die Zellen in NMM19-Medium, das mit Ampicillin ergänzt ist, auf ein Gesamtvolumen von 100 Millilitern. Übertragen Sie diese Suspension zurück in denselben Erlenmeyerkolben.

4-Amino-Indol bis zu einer Endkonzentration von einem Millimolar zugeben. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius und 200 U/min in einem Orbitalschüttler. Nach 30 Minuten geben Sie IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,5 Millimolar in die Kultur, um die Expression des Zielgens zu induzieren.

Über Nacht in einem Orbitalschüttler bei 30 Grad Celsius und 200 U/min inkubieren. Am nächsten Tag ernten Sie die Bakterienzellen, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 5.000 g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand durch Dekantieren.

Frieren Sie das Zellpellet bei minus 20 Grad Celsius oder minus 80 Grad Celsius ein, bis es für die Aufreinigung des Zielproteins bereit ist. Bereiten Sie zunächst das bakterielle Zelllysat vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem Sie die Chromatographiesäule gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet haben, verwenden Sie einen Bindungspuffer, um die immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographiesäule auszugleichen.

Laden Sie das Lysat bis zur Fertigstellung auf die Säule. Beachten Sie das goldfarbene Protein, das an das Chromatographieharz gebunden ist. Waschen Sie die Säule mit Bindepuffer.

Dann eluieren Sie das Zielprotein mit Elutionspuffer. Sammeln und poolen Sie alle eluierten Fraktionen, die fluoreszierendes Goldprotein enthalten, das an der sichtbaren goldenen Farbe zu erkennen ist. Bereiten Sie danach eine Dialysemembran mit einem Molekulargewichtsgrenzwert zwischen 5.000 und 10.000 gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.

Dialysieren Sie eine Ein-Milliliter-Probe gegen mindestens 100 Milliliter Puffer für mindestens zwei Stunden. Verwenden Sie zunächst MS-Puffer, um die Proteinprobe auf 0,1 Milligramm pro Milliliter zu verdünnen, so dass das endgültige Volumen 80 Mikroliter beträgt. Vorsichtig pipettieren, um zu mischen.

Füllen Sie die Lösung in ein MS-Autosampler-Fläschchen mit Glaseinsatz und verschließen Sie es mit einer Kappe. Schnippen Sie das Fläschchen, um Luftblasen zu entfernen. Bereiten Sie anschließend einen Rohling mit MS-Puffer in einer zweiten Durchstechflasche vor.

Legen Sie beide Fläschchen in den HPLC-Autosampler. Bereiten Sie danach das MS-Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und kalibrieren Sie es. Stellen Sie das Injektionsvolumen des Autosamplers auf fünf Mikroliter für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ein, die mit der Lichtlaufzeit-Massenspektrometrie der Elektrospray-Ionisation gekoppelt ist.

Legen Sie eine Arbeitsliste für den leeren Lauf an, gefolgt vom GdFP-Beispiellauf. Weisen Sie das Injektionsvolumen und die entsprechenden Positionen der Autosampler-Fläschchen zu und führen Sie die Arbeitsliste aus. Bereiten Sie zunächst eine goldfluoreszierende Proteinlösung und den Detektor für die zeit- und wellenlängenkorrelierte Einzelphotonenzählung vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Mit Hilfe einer Einzelphotonen-Zählsoftware wird die Fluoreszenzemission mit einer Zählrate von etwa 200.000 Photonen pro Sekunde erfasst, bis etwa 10.000 Zählungen im Erfassungsmaximum der Fluoreszenzzerfallskurven akkumuliert sind. Ersetzen Sie danach die Probenküvette durch eine ein Zentimeter große Quarzküvette, die mit kolloidaler Kieselsäure in PBS-Puffer gefüllt ist. Nehmen Sie den Laserfilter heraus und stellen Sie das Gitter für die Erfassung von 470-Nanometer-Photonen im zentralen Kanal des Detektors ein.

Erwerben Sie dann die instrumentelle Reaktionsfunktion, bis etwa 10.000 Zählungen im Emissionsmaximum akkumuliert sind. Konvertieren, passen und plotten Sie die resultierenden Daten, wie im Textprotokoll beschrieben, um die zerfallsassoziierten Spektren zu erhalten, die die Abhängigkeit der Fluoreszenzabklingzeiten von der Emissionswellenlänge darstellen. In dieser Studie wird die Massenspektrometrie verwendet, um zu bestätigen, dass die spektral rotverschobene grün fluoreszierende Protein-Typ-Fluorophor-Variante, die als goldfluoreszierendes Protein bezeichnet wird, erfolgreich hergestellt wird.

Während Wildtyp-ECFP nach der Chromophorreifung eine berechnete Proteinmasse von 28.283,9 Dalton aufweist, beträgt die entsprechende Masse des fluoreszierenden Goldproteins 28.313,9 Dalton. Das entfaltete ESI-MS-Spektrum des fluoreszierenden Goldproteins weist einen Hauptmassenpeak bei etwa 28.314,1 Dalton auf, der vom theoretischen Wert um weniger als 10 ppm abweicht. Dies bestätigt den Einbau der nicht-kanonischen Aminosäure durch selektiven Druckeinbau.

Das Absorptionsspektrum von ECFP hat zwei charakteristische Maxima bei 434 Nanometern und 452 Nanometern. Im Gegensatz dazu zeichnet sich das fluoreszierende Goldprotein durch eine breite rotverschobene Absorptionsbande aus, deren Maximum bei 466 Nanometern liegt. Während das Absorptionsmaximum von EGFP weiter auf 488 Nanometer verschoben ist, bedeutet das Fluoreszenzemissionsspektrum des fluoreszierenden Goldproteins und die entsprechende Stokes-Verschiebung von GdFP, dass es das am stärksten rotverschobene aller Derivate des fluoreszierenden Proteins Aequorea victoria ist.

Die zeitaufgelöste Fluoreszenzemission, die durch Einzelphotonenzählung überwacht wird, ist hier dargestellt. Die Zerfallskurven zeigen bei 600 Nanometern einen etwas schnelleren Fluoreszenzzerfall als bei 550 Nanometern. Die Fluoreszenzemission von goldfluoreszierendem Protein hängt stark vom pH-Wert ab, wie es für viele grün fluoreszierende Proteinvarianten typisch ist.

Wie hier zu sehen ist, gibt es eine deutliche Abnahme der Fluoreszenz bei niedrigerem pH-Wert, obwohl die spektralen Eigenschaften konstant bleiben. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in drei Tagen durchgeführt werden, wenn man von Kolonien aus transformierten Bakterienzellen oder von gefrorenen Glycerinbeständen ausgeht. Bei diesem Verfahren ist es wichtig sicherzustellen, dass die Zielaminosäure aufgebraucht ist.

Das ncAA muss von der Zelle aufgenommen, biokompatibel und von dem gewählten auxotrophen Stamm in Proteine eingebaut werden. Nach diesem Verfahren kann eine Vielzahl von Proteinen für technische Zwecke erzeugt werden. Abhängig vom Zielprotein können Methoden, wie z.B. Proteinstabilitätsanalysatoren, enzymatische Aktivitätsassays, Fluoreszenzspektroskopie oder Proteinkristallisation, verwendet werden, um den Einfluss der nicht-kanonischen Aminosäure auf funktionelle und strukturelle Eigenschaften zu beschreiben.

Nach ihrer Entwicklung erwies sich diese Technik als sehr nützlich auf dem Gebiet der synthetischen Biologie, da sie mit neuen Proteinen und Proteomen versorgt wurde. Damit werden die chemischen Kapazitäten für das Protein-Engineering erweitert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man nicht-kanonische Aminosäuren durch selektiven Druckeinbau in rekombinante Proteine einbaut, wie man die Einführung einer künstlichen Aminosäure durch Massenspektrometrie verifiziert und wie man ein fluoreszierendes Protein durch zeitaufgelöste Fluoreszenz analysiert.