Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation und Bioinformatik-Pipeline, um genetische Determinanten der konstitutionelle Krankheit zu bewerten

Das übergeordnete Ziel des gezielten Next-Generation-Sequencing ist es, die genetischen Determinanten verschiedener Konstitutionskrankheiten aufzuklären, indem der Schwerpunkt auf genomischen Regionen von besonderem Interesse liegt. Diese Methode kann uns helfen, wichtige Fragen zur genetischen Ideologie einer Krankheit zu beantworten, insbesondere wenn bereits bekannte genetische Assoziationen vorliegen. Diese Technik ist hocheffizient.

Es produziert Millionen von Reads in kurzer Zeit, wir erhalten sie zu relativ geringen Kosten, es gibt einen relativ geringen Rechenaufwand, insbesondere wenn wir es mit anderen Next-Generation-Sequencing-Ansätzen vergleichen. Die Implikationen der Technik erstrecken sich auf die Diagnose neurodegenerativer Erkrankungen, die phänotypisch und genetisch heterogen sind, aber viele bekannte assoziierte genetische Loci haben. Obwohl diese Methode speziell auf neurodegenerative Erkrankungen ausgerichtet ist, könnte sie auch auf verschiedene andere konstitutionelle Erkrankungen mit zuvor identifizierten genomischen Regionen von Interesse angewendet werden.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die bioinformatische Verarbeitung, die für die abschließende Analyse seltener Varianten erforderlich ist, rechenintensiv sein und viele Fehlerquellen schaffen kann. Bei diesem Verfahren werden menschliche Blutproben in drei, vier Milliliter EDTA K2-Röhrchen entnommen, so dass ein Gesamtvolumen von etwa 12 Millilitern entsteht. Zentrifugieren Sie die Blutproben 20 Minuten lang bei 750-facher Schwerkraft.

Dadurch wird jede Probe in eine obere Plasmaphase, eine dünne mittlere Phase der Leukozyten und eine untere Phase der Erythrozyten fraktioniert. Pipettieren Sie das Plasma mit einer Einweg-Transferpipette von der Oberseite der Blutprobe ab. In mehrere 500-Mikroliter-Aliquots dosieren und bei minus 80 Grad Celsius für zukünftige biochemische Analysen lagern.

Extrahieren Sie DNA aus der Blutprobe mit einem Blutextraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die extrahierte DNA wird dann verwendet, um eine Sequenzierungsbibliothek für die Sequenzierung der nächsten Generation vorzubereiten. Suchen Sie nach Abschluss der Sequenzierungsausführung auf einem Computer die Dateien in der cloudbasierten Computingumgebung, indem Sie im Navigationsbereich Ausführungen auswählen.

Wählen Sie die entsprechende Sequenzierungsausführung aus, um zur Seite mit der Ausführungszusammenfassung zu navigieren. Wählen Sie Herunterladen aus, um Daten aus der Cloud abzurufen. Wählen Sie im angezeigten Dialogfeld die FASTQ-Dateien als Dateityp aus, der heruntergeladen werden soll, und klicken Sie auf Herunterladen.

Navigieren Sie auf der Seite Ausführungszusammenfassung der Cloud-basierten Computingumgebung zu Diagramme, um die Qualität der Sequenzierungsausführung mit den verschiedenen Zahlen zu analysieren, die von der Computingumgebung erzeugt werden. Suchen Sie auf der Seite Run Charts die Abbildung Data By Cycle, wählen Sie unter Chart die Option Intensity und unter Channel die Option All Channels aus, um das Signalintensitätsdiagramm zu erstellen. Wählen Sie im Bereich "Laufnavigation" die Registerkarte "Indizierungs-QC" aus, um das Histogramm der Indizierungsqualitätskontrolle zu finden, das sich auf der rechten Seite der Seite befindet.

Klicken Sie auf der Seite Ausführungszusammenfassung der Cloud-basierten Computing-Umgebung im Navigationsbereich Ausführen auf Metriken, um zu den Qualitätsmetriken zu navigieren. Stellen Sie unter Dichte Kelvin pro Quadratmillimeter sicher, dass die Clusterdichte des Sequenzierungslaufs innerhalb des vom verwendeten Anreicherungskit empfohlenen Bereichs liegt. In diesem Fall 1.200 bis 1.400 Kelvin pro Millimeter zum Quadrat.

Stellen Sie unter Gesamtprozentsatz größer oder gleich Q30 sicher, dass der Wert größer oder gleich 85 % ist, was die Qualität der Sequenzierungslesevorgänge widerspiegelt. Stellen Sie unter Ausgerichtet sicher, dass der Wert dem Prozentsatz der Positivkontrolle entspricht, die in den Sequenzlauf einbezogen wurde. Wenn z. B. eine Positivkontrolle von 1 % verwendet wird, beträgt der erwartete ausgerichtete Prozentsatz ungefähr 1 bis 5 %, und Abweichungen innerhalb weniger Dezimalstellen sind akzeptabel.

Beginnen Sie diesen Prozess, indem Sie FASTQ-Sequenzierungs-Reads in die Datenverarbeitungssoftware importieren. Klicken Sie im Navigationsbereich mit der rechten Maustaste und wählen Sie Neuer Ordner. Benennen Sie den Ordner so, dass Klarheit über den ausgeführten Sequenzlauf besteht.

Wählen Sie in der Symbolleiste oben die Option Importieren und wählen Sie aus der Dropdown-Liste die Plattform aus, mit der die Sequenzierung durchgeführt wurde. Für die Zwecke von ONDRISeq wird Ilumina ausgewählt. Navigieren Sie im Dialogfeld zu den FASTQ-Dateien aus dem Sequenzlauf, der gerade verarbeitet wird, und wählen Sie sie aus.

Klicken Sie in den allgemeinen Optionen des Dialogfelds auf das Kästchen neben Gepaarte Lesevorgänge, wenn bei der Sequenzierung gepaarte Endchemien verwendet wurden. Wählen Sie in den Informationen zum gekoppelten Lesen des Dialogfelds die Option Gepaartes Ende aus, wenn die vorwärts gelesene FASTQ-Datei vor dem umgekehrten Lesevorgang in der Dateiliste angezeigt wird. Legen Sie die minimale Entfernung für gekoppelte Lesevorgänge auf eins und die maximale Entfernung auf 1000 fest.

Wählen Sie in den Ilumina-Optionen des Dialogfelds die Option Fehlgeschlagene Lesevorgänge entfernen. Wählen Sie in der Dropdown-Liste Qualitätsbewertung die NGS-Pipeline aus, die für die Sequenzierung verwendet wurde. Wählen Sie unten im Dialogfeld Weiter aus.

Wählen Sie Speichern und Unterordner pro Batch-Einheit erstellen aus. Wählen Sie unten im Dialogfeld Weiter aus. Wählen Sie den Ordner aus, der zuvor erstellt wurde.

Hier werden die FASTQ-Dateien importiert. Wählen Sie unten im Dialogfeld Fertigstellen aus und warten Sie, bis die FASTQ-Dateien importiert wurden. Klicken Sie auf die Registerkarte Prozesse, um den Status des Dateiimports anzuzeigen.

Entwerfen Sie als Nächstes einen Workflow innerhalb der Software, um die Neusequenzierung und den Variantenaufruf gemäß den Anweisungen des Herstellers durchzuführen. Das Entwerfen des Workflows für die Neusequenzierung und den Variantenaufruf ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens. Unser Team recherchierte Best Practices und nutzte Versuch und Irrtum, um den robustesten Workflow zu finden, der unseren Anforderungen entspricht.

Um die importierten FASTQ-Sequenzierungs-Lesedateien über den benutzerdefinierten Bioinformatik-Workflow auszuführen, beginnen Sie damit, den Workflow in der Toolbox der Software zu identifizieren und darauf zu doppelklicken. Suchen Sie im angezeigten Dialogfeld die Ordner mit den FASTQ-Dateien, die im Navigationsbereich importiert wurden. Markieren Sie alle Ordner, indem Sie sie im Navigationsbereich auswählen und dann auf das Kästchen neben Stapel klicken.

Verwenden Sie den Pfeil nach rechts, um die Dateien in ausgewählte Elemente zu verschieben. Klicken Sie unten im Dialogfeld auf Weiter. Überprüfen Sie im Dialogfeld die Stapelübersicht, um sicherzustellen, dass die richtigen FASTQ-Dateien ausgewählt wurden, und klicken Sie dann auf Weiter.

Überprüfen Sie die Schritte des Workflows im Dialogfeld, um sicherzustellen, dass beim Entwerfen des Workflows die richtigen Dateien und Exportspeicherorte ausgewählt wurden. Zu diesen Schritten gehören das Zuordnen von Lesevorgängen zur Referenzsequenz, das Entfernen doppelter zugeordneter Lesevorgänge, das Erstellen von Statistiken für Zielregionen, das Exportieren von BAM-Dateien, das Exportieren von tabulatorgetrenntem Text, das Filtern basierend auf Überlappung und das Exportieren von VCF-Dateien. Wählen Sie im letzten Schritt des Dialogfelds, Ergebnisbehandlung, die Option Im Eingabeordner speichern.

Klicken Sie unten im Dialogfeld auf Fertig stellen. Der letzte Schritt besteht darin, eine Variantenannotation für die VCF-Datei jedes Samples durchzuführen, wie im Textprotokoll beschrieben. Die in diesem Video gezeigten Methoden wurden auf 528 DNA-Proben von Personen angewendet, die in ONDRI aufgenommen wurden.

Die Proben wurden auf dem ONDRISeq-Panel in 22 Läufen mit 24 Proben pro Lauf durchgeführt. Insgesamt wurde festgestellt, dass die Sequenzierungsdaten von hoher Qualität sind, mit einer durchschnittlichen Stichprobenabdeckung von 78 Mal. Durchschnittlich 95,6 % der Lesevorgänge wurden mit der Referenzsequenz abgeglichen, und bei allen ONDRISeq-Läufen wurden mehr als 90 % der Lesevorgänge zugeordnet.

Von den zugeordneten Lesevorgängen 92,0 % und ein Phred-Score größer oder gleich Q30. Um den Nutzen dieses gezielten NGS-Workflows zu demonstrieren, wird das Beispiel eines 68-jährigen männlichen Parkinson-Patienten vorgestellt, der einen reduzierten N-Über-Output zeigt. Die annotierte Varianz wird kuratiert, um diejenigen zu identifizieren, die am wahrscheinlichsten von klinischer Bedeutung sind, wie durch die roten Kästchen gekennzeichnet.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Schritte angemessen auf die Sequenzierungsplattform, das verwendete Anreicherungskit und die Bedürfnisse der Forschung abzustimmen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Genetik, um qualitativ hochwertige, regionsspezifische Daten zu erhalten und gleichzeitig kostengünstiger zu bleiben als ihre Gegenstücke für das gesamte Exom und das gesamte Genom.