Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen schnellen und effizienten Genaufschluss durch CRISPR/Cas9 und primäre hämatopoetische Vorläuferzellen unter Verwendung eines Ribonukleoprotein-Ansatzes zu erreichen. Diese Methode kann Schlüsselfragen auf dem Gebiet der normalen und malignen Hämatopoese beantworten, wie z.B. die molekularen und phänotypischen Folgen des Verlusts des Gens X.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie extrem einfach, schnell und kostengünstig ist. Die geschätzte Zeit von der Versuchskonzeption bis zur Durchführung beträgt weniger als eine Woche.

Obwohl diese Methode für hämatopoetische Vorläuferzellen optimiert wurde, kann sie auch auf andere Zelltypen angewendet werden, wie z. B. primäre T-Zellen, hämatopoetische Zelllinien von Mäusen und Menschen sowie primäre Leukämieproben. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir erkannten, dass andere CRISPR/Cas9-Verabreichungsansätze, einschließlich Plasmide und Viren, entweder toxisch für unsere Zellen waren oder langsame Durchlaufzeiten hatten. Um Single-Guide-RNAs von Interesse zu entwerfen, navigieren Sie zunächst zur CRISPRscan-Website.

Drücken Sie basierend auf der interessierenden Zelle die Maustaste oder die Mensch-Taste, geben Sie dann das interessierende Gen in das UCSC-Suchfeld ein und klicken Sie auf Go. Vergrößern Sie als Nächstes das Exon, das Sie anvisieren möchten. Überprüfen Sie, ob Single-Guide-RNA-Zielsequenzen unter der Überschrift CRISPRscan-Vorhersagen auf Genen aufgeführt sind.

Klicken Sie anschließend auf eine Ziel-Single-Guide-RNA, die als grünes Rechteck gekennzeichnet ist, und kopieren Sie die vollständige Sequenz, die unter der Oligo-Sequenz angezeigt wird. Fügen Sie dann die Sequenz in ein Textdokument ein. Fügen Sie als Nächstes die Nukleotide ATAGC an die drei Primzahlen der Sequenz hinzu.

Geben Sie die Bestellung für die Sequenz in voller Länge auf. Um nun das DNA-Template für die Single-Guide-RNA zu synthetisieren, lösen Sie die Single-Guide-RNA-Forward- und Universal-Reverse-Primer auf und verdünnen Sie sie. Geben Sie dann alle Reagenzien in ein PCR-Röhrchen, um die überlappende PCR durchzuführen.

Nachdem Sie die PCR-Reaktion konstituiert haben, legen Sie das Röhrchen in einen Thermocycler und führen Sie das Programm aus. Sobald das Programm abgeschlossen ist, reinigen Sie das PCR-Produkt mit DNA-Aufreinigungssäulen. Verdünnen Sie die DNA in 11,5 Mikrolitern Elutionspuffer.

Verwenden Sie dann den Elutionspuffer als Rohling auf dem Spektralphotometer. Messen Sie die Konzentration der Proben-DNA auf dem Spektralphotometer. Mischen Sie zunächst die eluierte DNA, die Desoxynukleotidphosphate, den Reaktionspuffer und die T7-RNA-Polymerase-Enzymmischung in den PCR-Streifenröhrchen.

Anschließend wird die Probe vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Tragen Sie anschließend das RNase-Reinigungsmittel auf, um RNase von den verwendeten Handschuhen zu entfernen. Passen Sie dann das Volumen jeder RNA-Probe mit nukleasefreiem Wasser auf 50 Mikroliter an.

Reinigen Sie die RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zum Schluss eluieren Sie die RNA in 50 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Verwenden Sie zunächst das nukleasefreie Wasser, um das Spektralphotometer auszublenden und messen Sie dann die Konzentration der eluierten RNA.

Verwenden Sie den Trypanblau-Ausschluss, um die Anzahl der Zellen zu zählen. Sammeln Sie für jedes Replikat 200.000 lebensfähige Zellen pro Replikat und fügen Sie dann phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzu, um die Zellen zu waschen. Dann die Tube sieben Minuten lang mit 300 mal g drehen.

Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig entfernen. Während der Zentrifugation inkubieren Sie 1,5 Mikrogramm Cas9 mit einem Mikrogramm der gesamten Single-Guide-RNA 20 bis 30 Minuten lang in einem PCR-Röhrchen. Dies dient dazu, die Cas9-sgRNA-RNP-Komplexe für jedes Replikat vorzubereiten.

Nach Berechnung des Volumens des erforderlichen Resuspensionspuffers T lösen Sie das erhaltene Zellpellet in dem Resuspensionspuffer T auf. Geben Sie dann 10 Mikroliter der gelösten Zellsuspension in das PCR-Röhrchen mit den Cas9-sgRNA RNP-Komplexen. Schalten Sie anschließend die Elektroporationseinheit ein. Schieben Sie die Küvette in den Küvettenhalter.

Geben Sie dann drei Milliliter Puffer E hinzu. Stellen Sie die Bedingungen an der Elektroporationsvorrichtung ein. Um die Elektroporation durchzuführen, halten Sie zuerst die Elektroporationspipette, fahren Sie dann die Klaue aus und greifen Sie die Scheibe in die Pipettenspitze, dann drücken Sie die Pipette fest nach unten, um die Spitze zu sichern. Mischen Sie anschließend die Probe, indem Sie sie 10 Mal auf und ab pipettieren.

Entnehmen Sie 10 Mikroliter der Probe und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Führen Sie anschließend die Spitze direkt in den elektrolytischen Puffer in der Elektroporationsküvette ein. Klicken Sie dann auf dem Bildschirm auf Start.

Lassen Sie die vollständige Meldung auf dem Bildschirm erscheinen. Nehmen Sie dann die Pipette aus der Küvette. Geben Sie anschließend den Inhalt aus der Küvette in die mit dem neuen HSPC-Nährmedium gefüllte Vertiefung.

Um die Wirksamkeit der Cas9-sgRNA-RNP-Elektroporation zu untersuchen, werden HSPCs, die aus den Mäusen isoliert wurden, mit Single-Guide-RNase elektroporiert, die entweder auf GFP oder tdTomato abzielt. Diese HSPCs exprimierten ubiquitär GFP oder tdTomato. Die durchflusszytometrische Analyse zeigt einen Verlust der GFP- oder tdTomato-Expression in den HSPCs auf Proteinebene von etwa 75 bzw. 74 %.

Anschließend wird ein T7-Endonuklease-1-basierter Assay mit PCR-amplifizierter DNA aus dem GFP-Locus der elektroporierten Zellen durchgeführt. Dies dient dazu, die Effizienz der Gendisruption von GFP zu quantifizieren. Die ImageJ-Software wird verwendet, um das Verhältnis der Intensitäten der gespaltenen zu den ungespaltenen Banden zu berechnen, um den Prozentsatz der Spaltung zu berechnen.

Die Wirksamkeit von drei verschiedenen Single-Guide-RNAs, die auf humanes CD45 abzielen, wird in der HL-60 AML-Zelllinie getestet. Die Durchflusszytometrie zeigt, dass Single-Guide-RNA1 mit einer Knockout-Effizienz von 98 % im Vergleich zur Kontrolle die effizienteste ist. Dann wird der CD45-Knockout auch in primären CD34-positiven HSPCs aus menschlichem Nabelschnurblut unter Verwendung von Single-Guide-RNA1 durchgeführt.

Die durchflusszytometrische Analyse zeigt fast 80% der Zellen mit einem Verlust von CD45 ohne Veränderung der CD34-Expression im Vergleich zu nur Cas9. Um die Transplantation von humanen CD45-Knockout-HSPCs zu untersuchen, werden Knochenmark- und Milzzellen von CD34-positiven retroorbital transfizierten NSG-Mäusen für die Analyse entnommen, wobei editierte Zellen als HLA-ABC-positiv und CD45-negativ gezeigt werden. Einmal gemeistert, kann dieses Protokoll in drei Tagen abgeschlossen werden, wenn es korrigiert durchgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, alle Oberflächen und Reagenzien RNase-frei zu halten, einen effizienten Genaufschluss mit mehreren Techniken zu überprüfen und die richtigen experimentellen Kontrollen zu verwenden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Cas9-sgRNA-Ribonukleoproteine entwerfen, synthetisieren und in hämatopoetische Vorläuferzellen transfizieren, um einen schnellen und effizienten Genaufschluss zu erzielen.