Mikrodissektion primäre renale Gewebe Segmente und Einbindung mit neuartigen Gerüst-freie Konstrukt-Technologie

Das übergeordnete Ziel dieses mikroskopischen Dissektionsverfahrens ist es, diskrete Segmente von lebendem Nierengewebe mit intakter Nierenarchitektur für Tissue-Engineering-Anwendungen zu isolieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Tissue Engineering zu beantworten, wie z.B. können ganze Segmente von isoliertem Primärorgangewebe steril entnommen und in Kultur am Leben erhalten werden? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Segmente eine intakte Nierenarchitektur enthalten, im Gegensatz zur Verwendung von Zelllinien zur Nachbildung eines komplexen Organs mit über 26 verschiedenen Zelltypen.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Nierenerkrankungen im Endstadium, da diese Konstrukte die Filtration verbessern und den Patienten helfen können, die Dialyse zu meiden. Tragen Sie während der Operation die richtige chirurgische Ausrüstung, einschließlich einer Maske und einer Kappe, um das Risiko einer Kontamination zu minimieren. Bemühen Sie sich ebenfalls, die Sterilität durchgehend aufrechtzuerhalten.

Beginnen Sie mit den Vorbereitungen, indem Sie den Operationstisch drapieren. Öffnen Sie anschließend die Packung mit den autoklavierten Instrumenten auf den sterilen Abdeckungen. Sie müssen drei kleine Hämostaten, eine feine Pinzette mit Zähnen, eine feine Pinzette ohne Zähne und eine gerade Irisschere enthalten.

Decken Sie die Mitte des Operationstisches mit einem zweiten, nicht gefensterten OP-Tuch ab. Bereiten Sie vor der Einrichtung des Operationssaals 50 Milliliter mit Antibiotika ergänztes DBPS vor und aliquotieren Sie fünf Milliliter in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Betäuben Sie nun eine acht bis 12 Wochen alte C57 Black Six-Maus und überwachen Sie regelmäßig den Grad der Anästhesie, indem Sie ihren Pedalreflex mit einem festen Zehenkneifen beurteilen.

Verwenden Sie anschließend eine Haarentfernungscreme, um alle Haare aus dem ventralen Rumpfbereich zu entfernen, und spülen Sie die Creme und das Haar mit destilliertem Wasser ab. Schieben Sie dann die Maus auf den Operationstisch und platzieren Sie sie in Rückenlage unter dem nicht gefensterten Tuch. Schneide nun ein zwei Zentimeter großes quadratisches Fenster in den Faltenwurf über dem Bauch der Maus aus.

Schrubben Sie dann die exponierte Haut dreimal mit Povidon-Jod, gefolgt von 70% Ethanol, um die Haut zu sterilisieren und die Vorbereitungen für die Operation abzuschließen. Beginnen Sie die Operation mit einer feinen Pinzette mit Zähnen und Irisschere. Machen Sie einen drei bis vier Zentimeter großen Hautschnitt parallel zur Mittellinie, einen halben Zentimeter links von der Mittellinie.

Fassen Sie anschließend das Bauchfell mit einer feinen Zange ohne Zähne und schneiden Sie mit einer Irisschere ein, um in die Bauchhöhle einzudringen. Tragen Sie dann Hämostatika auf die oberen und unteren Seitenränder der Haut und des Peritoneums auf, um die Spannung lateral zu erhöhen und die Exposition zu erhöhen. Verschieben Sie nun den Darminhalt vorsichtig nach rechts vom Bauch, um die linke Niere freizulegen.

Legen Sie dann vorsichtig Zug auf die Niere, um sie aus dem Bauch zu heben. Legen Sie nun ein Blutstillungsmittel über den Hilum der Niere und durchtrennen Sie mit einer Irisschere den Harnleiter und die Nierengefäße. Übertragen Sie dann die Niere in das Röhrchen mit 1%pen-strep DBPS auf Eis.

Bringen Sie dieses Röhrchen zur Verarbeitung in eine sterile Kulturhaube. Dort geben Sie die Niere in eine 60-Millimeter-Petrischale und spülen sie zweimal mit frischen fünf Millilitern DPBS, das Kalzium und Magnesium enthält. Nach der zweiten Wäsche hängen Sie die Niere in frischen fünf Millilitern DBPS in einer neuen 60-Millimeter-Schale.

Bereiten Sie dann eine zusätzliche Petrischale mit nur fünf Millilitern DBPS für die spätere Verwendung vor. Verwenden Sie weiterhin sterile Techniken wie sterile Handschuhe, chirurgische Maske und Bouffant, um das Kontaminationsrisiko zu minimieren. Drapieren Sie dann den Tischbereich und den Bereich um das Stereomikroskop

Legen Sie anschließend Kunststoff-Klebefolien auf die Fokusknöpfe des Mikroskops und besprühen Sie sie mit 70%Ethanol. Schalten Sie dann die doppelte Schwanenhalsbeleuchtung ein, um die Bühne zu beleuchten. Öffnen Sie nun auf den sterilen Vorhängen eine Packung sterilisierter Instrumente, die eine feine Pinzette ohne Zähne, einen Skalpellgriff, eine Skalpellklinge mit der Nummer 15, zwei gerade Hämostaten und zwei 30,5-Gauge-Hohlbohrnadeln enthalten.

Setzen Sie die Klinge mit der Nummer 15 auf den Skalpellgriff und befestigen Sie ein Blutstillmittel an jeder Nadeladapternabe, um Nadeldissektionsinstrumente herzustellen. Übertragen Sie nun die beiden Schalen, eine mit der Niere in DPBS und die andere nur mit DPBS, in den Mikroskopbereich. Nehmen Sie den Deckel der Nierenschale ab und fokussieren Sie das Mikroskop auf die vordere oder hintere Oberfläche der Niere mit 3,2- bis 4-facher Vergrößerung.

Verwenden Sie dann mit der nicht dominanten Hand eine feine Pinzette ohne Zähne, um die Niere am unteren und oberen Pol der Niere zu durchstechen und gegen die Schale zu drücken. Verwenden Sie dann mit der dominanten Hand die Klinge Nummer 15, um die durchscheinende faserige Kapselschicht von der freiliegenden Oberfläche zu entfernen. Rasieren Sie die oberflächlichsten 0,5 Millimeter von der freiliegenden Oberfläche der Nierenoberfläche, um den Rest der Kapsel zu entfernen.

Fahren Sie fort, indem Sie die Klinge Nummer 15 verwenden, um eine umgekehrte Gewebepyramide aus dem entkapselten Bereich zu präparieren, die etwa zwei Quadratmillimeter groß ist. Übertragen Sie dann das Gewebe in die saubere Schale von DBPS und entsorgen Sie den Rest der Niere. Fokussieren Sie sich nun auf das präparierte Gewebe und verringern Sie die Vergrößerung auf das 1,5- bis 2,0-fache.

Schneiden Sie das Gewebefragment mit den beiden blutstillenden Nadelinstrumenten als Schneidwerkzeuge in immer kleinere Stücke, bis die Gewebesegmente die Größe der Nadelspitzen oder kleiner haben. Etwa 50 Segmente sollen produziert werden. Dies ist ein kritischer Teil des Verfahrens.

Jedes Segment muss sich dem Durchmesser der 30-1/2-Gauge-Nadelspitze annähern, um große Segmente zu vermeiden, die die Diffusion behindern könnten. Bringen Sie das Gewebe wieder in die Gewebekulturhaube zurück und entfernen Sie das DPBS mit einer P1000-Mikropipette. Geben Sie dann fünf Millimeter DMEM zurück, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Pen-Streptokokken.

Kultivieren Sie dann das Gewebe oder implantieren Sie es sofort in zelluläre Konstrukte. Die Lebensfähigkeit der intakten Nierensegmente, die durch das beschriebene Verfahren hergestellt wurden, wurde über drei Tage in Kultur unter Verwendung eines Lebensfähigkeitsassays untersucht. Grün fluoreszierendes Calcium AM ist mit intrazellulärer Esteraseaktivität vorhanden, die auf lebende Zellen hinweist.

Rot fluoreszierendes Ethidium-Homodimer-1 ist mit Verlust der Integrität der Plasmamembran zu sehen. Nachdem die Nierensegmente in gerüstfreie endotheliale Fibroblastenkonstrukte eingebettet waren, wurden sie am dritten Tag mit den zellulären Konstrukten integriert, um intakte Strukturen zu bilden. Die Konstrukte behielten ihr prävaskuläres endotheliales Netzwerk bei, das durch Markierung mit dem von-Willebrand-Faktor gezeigt wurde.

Nierenepithelzellen sind in grün markiert mit Cytokertain-18 zu sehen. Um die in-vitro-Nierenfunktionalität zu testen, wurden die Konstrukte mit FITC-markiertem Albumin inkubiert. Während in den Segmenten des eingebetteten Nierengewebes Restalbumin gefunden wurde, gab es auch Hotspots in den tubulären Epithelzellen der Nieren.

Bei diesen Hotspots handelt es sich um Albumin, das intraluminal verläuft und von dem angenommen wird, dass es die Albumin-Wiederaufnahme im zellulären Konstrukt des Nierensegments darstellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Nierensegmente aus murinen Nieren für Tissue-Engineering-Anwendungen isoliert werden können. Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren in ein bis 1-1/2 Stunden durchgeführt werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, einschließlich der Aussaat zellularisierter Konstrukte, durchgeführt werden, um andere Fragen zur Herstellung und Charakterisierung von Nierenkonstrukten zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit chirurgischen Instrumenten und Sauerstoffdruckflaschen äußerst gefährlich sein kann. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie mit scharfen Gegenständen arbeiten, und denken Sie daran, Sauerstofftanks an einem Labortisch zu verankern.