Praktische Anwendung der RNA-Interferenz: mündliche Lieferung von Double-Stranded RNA in Liposomen Träger für Schaben

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Genexpression im Darm von Kakerlaken durch RNA-Interferenz durch orale Einnahme von doppelsträngiger RNA, die in Liposomenträgern eingekapselt ist, zu verringern. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Entwicklung neuer Schädlingsbekämpfungsmethoden zu beantworten, z. B. kann das Abschalten essentieller Gene auf freiem Feld Schädlinge töten? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Liposom die genspezifische doppelsträngige RNA schützt, um ihre Abgabe an die Zielzelle zu gewährleisten.

Jia-Hsin Huang, ein Postdoc, und Yun Liu, ein Techniker aus meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren. Zu Beginn betäuben Sie die Kakerlaken auf Eis, bis sie sich drei Minuten lang nicht bewegen. Heben Sie dann ein Insekt mit Daumen und Zeigefinger auf, um Zugang zu seiner Bauchseite zu erhalten.

Als nächstes schneidest du mit einer Präparierschere die Spitze einer Coxa eines Hinterbeins zwischen der Coxa und dem Trochanter ab. Das Schneiden an einer anderen Stelle der Coxa ist für die Hämolymph-Sammlungen weniger effizient. Positionieren Sie nun eine 10-Mikroliter-Mikropipette am Schnitt und drücken Sie den Bauch sanft zusammen, während Sie die blutende Hämolymphe hochziehen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Hämolymphe von fünf Kakerlaken in einem einzigen Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt wurde. Als nächstes drehen Sie die gepoolte Hämolymphe 10 Sekunden lang kurz herunter. Kombinieren Sie dann 10 Mikroliter Hämolymphe mit 50 Mikrolitern 1x Insektensalzpuffer

Zentrifugen Sie nun die verdünnte Hämolymphe 10 Minuten lang, um die Hämozyten aus der Lösung zu ziehen. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Röhrchen. Quantifizieren Sie schließlich die Gesamtproteinkonzentration mit einem Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer und stellen Sie die Konzentration jeder Probe auf sechs Milligramm Protein pro Mikroliter ein.

Um Mitteldarmsaft zu sammeln, betäuben Sie zuerst die Kakerlaken auf Eis. Übertragen Sie dann eine auf eine Sezierplatte, die mit kaltem 1x Insektensalzpuffer beladen ist, und befestigen Sie sie mit Insektenstiften mit der Bauchseite nach oben. Präparieren Sie nun den Bauch mit einer feinen Pinzette.

Entfernen Sie dann den gesamten Darm und geben Sie ihn in eine frische Schüssel mit 1x Insektensalzpuffer. Isolieren Sie als Nächstes den Mitteldarm, der die Region zwischen dem Kropf und den Malpighischen Tubuli darstellt. Entfernen Sie dazu den vorderen Teil des Tieres und entfernen Sie den Hinterdarm.

Übertragen Sie anschließend den Mitteldarm schnell in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern Insektensalzpuffer. Sammle die Eingeweide von sechs Kakerlaken in dieselbe Röhre. Wirbeln Sie dann das Rohr 10 Sekunden lang ein.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Mischung 10 Minuten lang, um die Hämozyten und das Darmgewebe zu trennen. Übertragen Sie dann den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie die Konzentration auf sechs Milligramm Protein pro Mikroliter ein. Doppelsträngige RNA-Lipoplexe müssen innerhalb einer Stunde nach der Zubereitung verwendet werden.

Achten Sie bei der Herstellung darauf, dass Sie das gesamte verdünnte Reagenz gleichzeitig mit der verdünnten doppelsträngigen RNA kombinieren. Dann die Mischung schnell vortexen und inkubieren. Wenn Sie fertig sind, mischen Sie vier Mikroliter der doppelsträngigen RNA-Lösung mit 10 Mikrolitern Insektensalzpuffer als Kontrolle oder mischen Sie sie mit 10 Mikrolitern extrahierter Enzyme aus Hämolymph- oder Mitteldarmsaft

Führen Sie als Nächstes eine enzymhemmte Kontrolle durch, indem Sie zwei Mikroliter EGTA hinzufügen. Andernfalls fügen Sie zwei Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu. Inkubieren Sie die Proben dann eine Stunde oder länger bei 25 Grad Celsius.

Nach der Inkubation 200 Mikroliter Extraktionsreagenz und 40 Mikroliter Chloroform hinzufügen und dann vortexen. Zentrifugieren Sie anschließend die Proben 10 Minuten lang. Übertragen Sie als Nächstes 150 Mikroliter jedes Überstands in ein neues Röhrchen und fällen Sie die doppelsträngige RNA aus jeder Probe aus, indem Sie 150 Mikroliter Isopropanol hinzufügen und die Proben 15 Minuten lang auf Eis inkubieren.

Nach der Inkubation werden die Proben erneut zentrifugiert und der Überstand verworfen. Waschen Sie dann die RNA-Pellets zweimal, indem Sie 200 Mikroliter des 70%igen Ethanols zu jedem Pellet hinzufügen und das Röhrchen zentrifugieren. Trocknen Sie die doppelsträngigen RNA-Pellets nach dem zweiten Waschen drei Minuten lang mit einem Zentrifugal-Vakuumkonzentrator.

Dann resuspendieren Sie die Pellets in 10 Mikrolitern RNase-freiem Wasser. Überprüfen Sie abschließend die Integrität der behandelten doppelsträngigen RNA mit einem 1,5%igen Agarosegel. Füttern Sie die Kakerlaken zweimal täglich, eine Stunde nach dem Einschalten des Lichts und eine Stunde vor dem Ausschalten des Lichts.

Tun Sie dies acht oder 16 Tage lang ohne Unterbrechungen. In dieser Zeit sollten die Kakerlaken ansonsten wasserarm sein. Für die Fütterung stehen frisch präparierte doppelsträngige RNA-Lipoplexe und nackte doppelsträngige RNA zur Verfügung.

Für den Bolus verwenden Sie vier Mikroliter doppelsträngige RNA-Lipoplexe oder 250 Nanogramm nackte doppelsträngige RNA. Um eine Kakerlake zu füttern, packen Sie sie zuerst mit einer flexiblen Pinzette an den Flügeln. Greifen Sie nicht nach den Körperteilen einer Kakerlake.

Pipettieren Sie dann langsam den Tropfen der Lösung in der Nähe der Mundwerkzeuge und beobachten Sie, wie die Kakerlake den Tropfen aufnimmt. Geben Sie den Kakerlaken nach der letzten Fütterung Wasserflaschen. Untersuchen Sie die Insekten während der gesamten Fütterungsperiode täglich, um die Sterblichkeit zu überprüfen und alle Kakerlaken zu entfernen, die sich nicht mehr aus dem Versuch bewegen.

Die kontinuierliche orale Verabreichung von doppelsträngigen Tub-Lipoplexen konnte die Tubulinexpression im Mitteldarm von 40 % am neunten Tag auf 60 % am 17. Tag verringern. Im Vergleich dazu zeigte nackte doppelsträngige RNA keine Wirkung. Dies ist höchstwahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die Exposition der nackten doppelsträngigen RNA gegenüber Mitteldarmsaft innerhalb einer Stunde zu einer Degradation führte, während die Liposomen-konjugierte doppelsträngige RNA stabil blieb.

Nicht nur die RNA-Spiegel sanken, sondern die kontinuierliche Fütterung der Tubulin-doppelsträngigen RNA-Lipoplexe führte auch zu einer signifikanten Letalität. Es ist unwahrscheinlich, dass dies auf den Vektor zurückzuführen ist, da Lipoplexe, die doppelsträngige RNA zu EGFP transportieren, zu keiner Letalität führten. Bei diesem oralen Verabreichungssystem der RNA-Interferenz ist es wichtig, eine kontinuierliche Fütterung von doppelsträngiger RNA über mehrere Tage durchzuführen.

Sobald Sie es beherrschen, kann der Fütterungsschritt in zwei Minuten pro Insekt durchgeführt werden, wenn er richtig ausgeführt wird. Bei Bedarf können verschiedene Formulierungen von Liposomen-Nanopartikeln angewendet werden, um das Fütterungsverfahren und die RNAi-Effizienz zu verbessern. Letztendlich hat diese Technik es Forschern auf dem Gebiet der Schädlingsbekämpfung ermöglicht, neue Bekämpfungsstrategien mit RNAi zu erforschen.