Name: Praktische Anwendung der RNA-Interferenz: mündliche Lieferung von Double-Stranded RNA in Liposomen Träger für Schaben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Lernen Sie die orale Lieferung von doppelsträngiger RNA in Liposomen zur Genabschaltung im Darm der Deutschen Schabe. Diese Methode ermöglicht innovative Ansätze zur Schädlingsbekämpfung.

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Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Taiwan (Ministerium für Wissenschaft und Technologie, 100-2923-B-002-002-MY3 und 106-2313-B-002-011-MY3, H.J.L.), der Tschechischen Republik (gewähren Agentur der Südböhmischen Universität, GAJU gewähren Y.H.L 065/2017/P), und Spanien ( Gewähren Sie spanischen Wirtschaftsministerium und Wettbewerbsfähigkeit, räumt CGL2012-36251 und CGL2015-64727-P X.B. und der katalanischen Regierung 2014 SGR 619 X.B.); Es erhielt auch finanzielle Unterstützung aus dem Europäischen Fonds für wirtschaftliche und Regionalentwicklung (FEDER Mittel zu X.B.).

(1) Synthese und Vorbereitung der dsRNA
<ol><li>DsRNA-Ziel-Sites in der 3' untranslatierten Region der Zielgene zu identifizieren. Die DsTub dient zur Ausrichtung auf das α-Tubulin (Wanne) Gen (GenBank Zbl-Nummer: KX228233), und DsEGFP wie ein negativer DsRNA-Steuerelement aus der Abfolge von konzipiert ist grüne Fluoreszenz-Protein (EGFP; GenBank Zbl-Nummer: LC311024).</li>
	<li>Führen Sie standard PCR Verstärkung um die DsRNA-Vorlagen mit Gen-spezifische Primer, enthält die T7 promotorsequenz synthetisieren (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 "). Die PCR-Amplifikation Zustände und Primer-Informationen verwendet sind die gemeldeten Lin Et Al. (2017) 12 (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Fahren Sie mit DsRNA Vorbereitung mit einer T7 Transkription Kit (siehe Tabelle der Materialien), nach den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Hohe Quantität DsRNA, mischen zwei Reaktionen in einem Rohr (in insgesamt 40 µL), und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 2 µL DNase (siehe Tabelle der Materialien) in DsRNA Proben für 15 min bei 37 ° C zu verdauen DNA-Vorlagen.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Extraktion Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) und 40 µL Chloroform, dann Wirbel.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C, dann sammeln Sie überstand (150 µL) in einem neuen Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Überstürzen Sie DsRNA durch Hinzufügen von 150 µL Isopropanol und Inkubation für 15 min auf Eis.</li>
	<li>Für 15 min bei 13.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert, dann entfernen Sie überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL 70 % Ethanol DsRNA Pellets zu waschen. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie das Ethanol und wiederholen Sie die Schritte Ethanol waschen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Ethanol und trockenen DsRNA Pellet durch zentrifugale Vakuum-Konzentratoren für 3 min, dann Aufschwemmen Sie DsRNA mit RNase-freies Wasser.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Menge der gereinigten DsRNA mit einem Mikro-Volume UV-Vis Spektralphotometer (siehe Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers und Anpassung an die gewünschte Konzentration (z.B., 0,25 µg/µL für Zubereitung von DsRNA Lipoplexes).</li>
	<li>Speichern Sie die DsRNA Proben bei-20 ° C für bis zu 3 Monaten.</li>
</ol>2. Vorbereitung des DsRNA Lipoplexes
<ol><li>Verdünnen Sie 4 µL des Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) durch Zugabe von 4 µL 5 % Glukoselösung verdünnt werden. Verdünnen Sie 4 µL DsRNA (1 µg) durch Zugabe von 4 µL 5 % Glukoselösung.</li>
	<li>Hinzufügen der verdünnten Liposomen Reagenzlösung unmittelbar in die verdünnte DsRNA-Lösung auf einmal. Vortex kurz zu vermischen, dann 15 Minuten bei 25 ° c inkubieren Hinweis: Verwechseln Sie nicht die Lösungen in umgekehrter Reihenfolge.</li>
	<li>DsRNA Lipoplexes sind einsatzbereit. Innerhalb von 1 Stunde Vorbereitung, und verwerfen nach 1 Stunde. Hinweis: Nach den Anweisungen des Herstellers sollte so bald wie möglich den Lipoplexes verwendet werden.</li>
</ol>3. Sammlung von extrazellulären Enzyme vom Hämolymphe und Mitteldarm Saft
<ol><li>
Insekt-saline-Puffer (10 X verfügbar)
	<ol>
<li>Mischen Sie 900 mL mit 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl und 6,3 g CaCl28,3 g MgCl2·6H2O. Doppeltes destilliertes Wasser</li>
		<li>Passen Sie pH-Wert auf 6,8 an, und füllen Sie bis zu 1.000 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hämolymphe Sammlung
	<ol>
<li>Betäuben Sie die Kakerlaken auf Eis, bis sie sich 3 Minuten lang nicht bewegen.</li>
		<li>Halten Sie die Schabe mit zwei Fingern (Daumen und Zeigefinger) und auftauchen Sie der Bauchseite die Schabe.</li>
		<li>Verwenden Sie die sezierenden Scheren aus der Spitze von einer Coxa ein Hinterbein abgeschnitten. Hinweis: Schneiden Sie die angeschlossenen Schnittpunkt zwischen Coxa und Trochanter. Die Exzision des anderen Teils Coxa war weniger effizient, Hämolymphe zu sammeln.</li>
		<li>Drücken Sie den Bauch sanft mit Mittelfinger und sammeln Sie die Hämolymphe Blutungen aus der Schnitt mit einer 10 µL Mikropipette.</li>
		<li>Die Hämolymphe aus mehreren Kakerlaken (5 Personen) in einem Microcentrifuge Schlauch zu bündeln. Hinweis: Halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, Melanization zu verhindern. Das durchschnittliche Volumen der Hämolymphe erhalten von einem männlichen Schabe ist ca. 2-3 µL.</li>
		<li>Spin-down der Hämolymphe kurz mit einem Benchtop-Zentrifuge für 10 s.</li>
		<li>Übertragen Sie gewünschte Lautstärke der Hämolymphe (d.h. 10 µL) zu, und mischen Sie es mit 50 µL 1 X Insekt saline Puffer.</li>
		<li>Zentrifuge für 10 min bei 1.000 x g bei 4 ° C, unten Hemocytes zu spinnen. Übertragen Sie den überstand auf eine saubere Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Die Gesamt-Protein-Konzentration mit einer Mikro-Lautstärke UV-Vis Spektralphotometer durch Messung A28015zu quantifizieren.</li>
		<li>Passen Sie jede Probe um die gleiche Protein Konzentration (6 mg/µL Gesamt-Protein).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mitteldarm Saft Sammlung
	<ol>
<li>Die Kakerlaken auf dem Eis zu betäuben. Repariere die Kakerlaken Bauchseite auf der Dissektion Platte mit kalten 1 X Insekt saline Puffer mit Insekt Pins.</li>
		<li>Zerlegen Sie den Bauch mit einer feinen Pinzette. Gesamte Darm (einschließlich des vorderen Mitte und Hinterbeinen Darms) auf einen frischen Teller mit 1 x Insekt saline Puffer zu entfernen.</li>
		<li>Entfernen Sie den vorderen und hinteren Darm und schnelle Übertragung der Mitteldarm zu einem Microcentrifuge Schlauch, der 100 µL Insekt saline Puffer enthält.</li>
		<li>Bündeln Sie die Midguts von sechs Kakerlaken im gleichen Rohr und Wirbel für 10 s.</li>
		<li>Zentrifuge für 10 min bei 1.000 x g bei 4 ° C, die Hemocytes und Darm Gewebe zu spinnen. Übertragen Sie den überstand auf eine saubere Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Die Gesamt-Protein-Konzentration mit einer Mikro-Lautstärke UV-Vis Spektralphotometer durch Messung A28015zu quantifizieren.</li>
		<li>Passen Sie jede Probe um die gleiche Protein Konzentration (6 mg/µL Gesamt-Protein).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. DsRNA Abbau Assay
<ol><li>Frisch bereiten Sie 4 µL des nackten DsRNA oder DsRNA Lipoplexes (1 µg zu).</li>
	<li>Mischen Sie DsRNA Lösungen mit 10 µL Insekt saline Puffer (Kontrolle), extrahiert Enzyme vom Hämolymphe oder Mitteldarm Saft.</li>
	<li>Fügen Sie 2 µL RNase-freies Wasser oder EGTA (20 mM), Proben als Steuerelemente für die Hemmung der Enzym-Aktivitäten zu trennen.</li>
	<li>1 Stunde oder länger (6, 12 oder 24-Stunden) bei 25 ° c inkubieren</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Extraktion Reagenz und 40 µL Chloroform, dann Wirbel.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C, dann sammeln Sie überstand (150 µL) in einem neuen Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Überstürzen Sie DsRNA durch Hinzufügen von 150 µL Isopropanol und Inkubation für 15 min auf Eis.</li>
	<li>Für 15 min bei 13.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert, dann entfernen Sie überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL 70 % Ethanol DsRNA Pellets zu waschen. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie das Ethanol und wiederholen Sie die Schritte Ethanol waschen.</li>
	<li>Ethanol und trockenen DsRNA Pellet durch zentrifugale Vakuum-Konzentratoren für 3 min. Aufschwemmen DsRNA mit 10 µL RNase-freies Wasser zu entfernen.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Integrität der behandelten DsRNA per Gelelektrophorese auf einem 1,5 % Agarose-Gel.</li>
</ol>(5) die orale Verabreichung von dsRNA
<ol><li>Kakerlaken auf eine Ad Libitum Ernährung Trockenfutter (Hund Chow) zu erhalten. Wasserversorgung von den Kakerlaken DsRNA Einnahme Experimente am Vortag zu berauben.</li>
	<li>Halten Sie eine Kakerlake, packte seine Flügel mit der flexiblen Zange (Abbildung 1, Schritt 5). Hinweis: Berühren Sie nicht die Körperteile von Kakerlaken.</li>
	<li>Vorbereiten der DsRNA Lipoplexes sowie nackt DsRNA, Fütterung, wie in Abschnitt 2 beschrieben. Hinweis: DsRNA Lipoplexes sollte vor der Fütterung frisch zubereitet werden.</li>
	<li>Futter 4 µL DsRNA Lipoplexes oder nackt DsRNA (250 ng) mit einer Mikropipette.</li>
	<li>Langsam pipettieren der Tropfen der DsRNA-Lösung die Mundwerkzeuge der Kakerlaken in der Nähe und lassen Sie die Kakerlaken aufnehmen des tröpfchens komplett.</li>
	<li>Durchführen Sie zweimal täglich (1 h nach Lichter auf und 1 h vor dem Licht aus) die Einnahme Experimente, für 8 oder 16 Tage kontinuierlich. Hinweis: Alle Kakerlaken erworben Wasser nur durch manuelles zuführen mit DsRNA Lösung oder Kontrolle Reagenzien (z. B.Nuklease freies Wasser, Glukoselösung und Liposomen Reagenz) während der Einnahme Experimente.</li>
	<li>Die Kakerlaken ermöglichen Sie Wasserflaschen nach 16 Tagen der Einnahme von DsRNA Experimente.</li>
</ol>6. beurteilen Knockdown
<ol><li>Gewählten Zeitpunkt Punkte (2, 9 und 17 Tage nach DsRNA Einnahme Assay), die DsEGFP und DsTub-behandelten Insekten sammeln und sezieren die gewählten Gewebe (z.B. Mitteldarm).</li>
	<li>Führen Sie quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR). Die qRT-PCR-Amplifikation Bedingungen und Primer-Informationen wie Lin Et al.berichtet. (2017) 12.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Kontrolle und DsRNA-behandelte Insekten täglich Sterblichkeit zu überprüfen und entfernen die Kakerlaken, die nicht mehr in Bewegung sind.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll stellt eine Methode für wirksame RNAi durch mündliche Lieferung von DsRNA Lipoplexes, denen Schutz gegen Ribonuklease Verdauung in den Mitteldarm Saft der deutschen Schabe. Wie in anderen Studien in verschiedenen Insektenarten gezeigt, der Armen RNAi-Effekt durch mündliche Lieferung von DsRNA vor allem durch den Abbau von DsRNA8,9,10entfallen. Dieses Protokoll produziert Liposomen, die als schützende Fahrzeuge i...

RNAi ist durch einen Mechanismus eines Posttranskriptionale stummschaltungs-Signalwegs, ausgelöst durch DsRNA Moleküle in viele Eukaryonten1als eine wirksame Methode, Knockdown Genexpression nachgewiesen. Im letzten Jahrzehnt Studie geworden RNAi ein nützliches Werkzeug, um die Funktionen von Genen aus Entwicklung, Verhalten zu studieren, durch Abbau der Expression bestimmter Gene mittels Injektion und/oder Fütterung von DsRNA in verschiedenen Taxa Insekten2,3. Aufgrund der Spezifität und Robustheit der abbauende Wirkung ist die Anwendung der RNAi derzeit als mögliche Strategie zur Pest Control Management4,5geprüft. Jedoch sehr unterschiedlich die Effizienz der RNAi Insektenarten, je nach den verschiedenen Genen angestrebt und die Versandmethoden. Eine wachsende Zahl von beweisen deutet darauf hin, dass die Instabilität der DsRNA, die durch Ribonuclease abgebaut wird, ein kritischer Faktor bei der begrenzten Wirksamkeit von RNAi5,6 ist. Zum Beispiel hat die geringe Sensitivität der RNAi in Manduca Sexta durch die Tatsache erklärt worden, dass die DsRNA gemischt mit Hämolymphe innerhalb von 1 Stunde7schnell abgebaut wurde. Ebenso ist die Anwesenheit von Alkali Nukleasen in den Mitteldarm die aufgenommenen DsRNA effizient zu degradieren, stark korreliert mit geringe RNAi-Effizienz in verschiedenen Insektenordnungen8,9,10.
Die mündlichen Lieferung von DsRNA ist besonders interessant für die Anwendung der RNAi in einer Pest Control-Strategie, sondern eine Methode, um den Abbau von DsRNA durch Nukleasen in den Mitteldarm verzögern nicht noch entwickelt wurde, die hätten des Potenzials, wirksam sichern RNAi durch Fütterung. Jedoch wurde die Teilnahmslosigkeit der RNAi mündlichen Lieferung von DsRNA berichtet, durch große Menge an DsRNA, z. B. 50 µg in Bombyx Mori, Fütterung oder kontinuierlich füttern für 8 Tage (8 µg DsRNA insgesamt) in der Locust-Spezies. Die Deutsche Schabe, Blattella Germinica, reagiert sehr empfindlich auf RNAi durch die Injektion von DsRNA11,12,13,14, aber ist nicht ansprechend auf DsRNA durch Fütterung. Vor kurzem, Lin Et al. (2017) haben gezeigt, dass die DsRNA mit Liposomen Träger führt zu erfolgreichen RNAi, Zuschlag die α-Tubulin -gen-Expression in den Mitteldarm und Trigger erhebliche Mortalität der deutschen Schabe15gekapselt. Wie der Abbau von DsRNA in den Mitteldarm der limitierende Faktor für mündliche RNAi ist, dienen die Liposomen-Träger als Vehikel DsRNA vor Erniedrigung, zu schützen, die bei anderen Insekten mit starken Nuklease Aktivitäten im Darm leicht anwendbar ist. Der Hinweis, der Grund für die Wahl des bestimmten Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) wir verwendet wie Liposomen Träger in das aktuelle Protokoll ist, dass es für Insekten Zelle Zeile Transfektion mit weniger Toxizität getestet wurde nach dem Anweisungen des Herstellers. Nach dem Vergleich der verschiedenen Liposom Transfection Systeme in Gharavi Et al. (2013) 16, ist die Effizienz der transfecting kleine interferierende RNA (SiRNA) ungefähr gleich zwischen diesem und anderen handelsüblichen Systemen, die für DsRNA-Delivery-Systeme in anderen Insekten17,18 verwendet wurden . Darüber hinaus ist unsere Fütterung Methode vorsichtig genug, um die richtige Menge an DsRNA von jeder Schabe eingenommen wird, und dass die Ergebnisse sind robust und bestätigten zu gewährleisten. Zusammenfassend lässt sich sagen zeigen die dieses Protokolls und die Ergebnisse, dass mit DsRNA Lipoplexes DsRNA Stabilität verbessert und die Tür für das Design der Strategie mündlichen Lieferung von RNAi öffnet, die ist ein vielversprechender Ansatz zur Schädlingsbekämpfung in der Zukunft.

<table><tbody><tr><td>GenJe Plus DNA in vitro Transfektionsreagenz</td><td>SignaGen</td><td>SL100499</td><td>zur Herstellung von Lipoplexen</td></tr><tr><td>Blend Taq plus</td><td>TOYOBO</td><td>BTQ-201</td><td>für PCR</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>ABI&nbsp;</td><td>4385612</td><td>für qPCR</td></tr><tr><td>FirstChoice RLM-RACE Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1700</td><td>für die 3' UTR-Identifizierung&nbsp;</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transkriptionskit</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>für die dsRNA-Synthese</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2239</td><td>DNA-Template aus dsRNA entfernen</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>für dsRNA- oder Gesamt-RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>RQ1 RNase-freie Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>DNA-Template aus Gesamt-RNA entfernen</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>für dsRNA- oder Gesamt-RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td>für dsRNA- oder Gesamt-RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td><td>für dsRNA- oder Gesamt-RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonat, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>für RNasefreie Wasseraufbereitung</td></tr><tr><td>Glukoselösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3285</td><td>zur Herstellung von Lipoplexen</td></tr><tr><td>Natriumchlorid, NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Insektensalzpufferformel</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid, KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Insektensalzpufferformel</td></tr><tr><td>Calciumchlorid, CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Insektensalzpufferformel</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat, MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Insektensalzpuffer Formel</td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>Enzym-Inhibitor</td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>Kakerlaken-Präparierung</td></tr><tr><td>feine Pinzette</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>Kakerlaken-Dissektion</td></tr><tr><td>flexible Pinzette</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>Kakerlaken-Holding&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipettierer</td><td>RAININ</td><td>P10</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td> für Probenvorbereitung <td>Axygen</td><td>MCT175C, PCR02C</td><td>für Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>Pipettenspitze&nbsp;</td><td>Axygen</td><td></td><td>Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>vortexter</td><td>Digisystem</td><td>vm1000</td><td>Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>Minispin Zentrifuge</td><td>The Gruffin Group</td><td>GMC 206</td><td>für Liquid Spin Down&nbsp;</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>ALC</td><td>PK121R</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät für Probenvorbereitung</td><td>JENCO</td><td>6071</td><td>für pH-einstellbares</td></tr><tr><td>Mikrovolumen-Spektrophotometer</td><td>Quawell</td><td>Q3000</td><td>Nukleinsäuren quantitative</td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>ABI&nbsp;</td><td>2720</td><td>für die Template-PCR oder&nbsp; dsRNA-Synthese Inkubation&nbsp;</td></tr><tr><td>quantitative real-time PCR</td><td>ABI&nbsp;</td><td>StepOne plus</td><td>Genexpression quantitative</td></tr><tr><td>Zentrifugal-Vakuumkonzentratoren</td><td>eppendorf</td><td>5301</td><td>für dsRNA- oder Gesamt-RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Multipette&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>xstream</td><td>für die Beladung von Real-Time-PCR-Proben&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>amresco</td><td>0710</td><td>für Nukleinsäureelektrophorese</td></tr><tr><td>Tub Gen specfifc Forward Preimer</td><td>Tri-I Biotech</td><td></td><td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td></tr><tr><td>Tub Gene Specfifc Reverse Preimer</td><td>Tri-I Biotech</td><td></td><td>TCC TGC TCC TCC TGT CTC GCT</td></tr><tr><td>GA dsTub Template Forward Primer</td><td>Tri-I Biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsTub Template Reverse Primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsEGFP Template Forward Preimer</td><td>Tri-I Biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG</td></tr><tr><td>dsEGFP Template Reverse Preimer</td><td>Tri-I Biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA</td></tr><tr><td>CC tub qPCR Forward Primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT</td></tr><tr><td>GGC tub qPCR reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC</td></tr><tr><td>ef1 qPCR Forward Primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A</td></tr><tr><td>ef1 qPCRreverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCT GCA GAG GAA GAC GAA G</td></tr></tbody></table>

praktische anwendung der rna-interferenz: mündliche lieferung von double-stranded rna in liposomen träger für schaben

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA-Interferenz (RNAi) hat für die Aufdeckung der biologischen Funktionen von zahlreichen Genen weit angewendet worden und hat als eine Pest Control Tool betriebliche durch Störung der wesentlichen Genexpression vorgesehen. Obwohl verschiedene Methoden, wie Injektion, füttern und Tränken, für die erfolgreiche Durchführung der doppelsträngige RNA (DsRNA) gemeldet worden sind, ist die Effizienz der RNAi durch mündliche Lieferung von DsRNA hochvariablen unter verschiedenen Insektengruppen. Die Deutsche Schabe, Blattella Germanica, ist sehr empfindlich auf die Injektion von DsRNA, wie von vielen bisher veröffentlichten Studien gezeigt. Die vorliegende Studie beschreibt eine Methode, um nachzuweisen, dass die DsRNA gekapselt mit Liposomen Träger ausreichen, um den Abbau von DsRNA Mitteldarm Fruchtsaft zu verzögern. Vor allem die kontinuierliche Beschickung der DsRNA deutlich von Liposomen verkapselt reduziert den Tubulin-Ausdruck in den Mitteldarm und führte zum Tod von Kakerlaken. Abschließend könnte die Formulierung und Verwendung von DsRNA Lipoplexes, die DsRNA gegen Nukleasen zu schützen, eine praktische Anwendung der RNAi für Schädlingsbekämpfung in der Zukunft.

Ein vereinfachtes Schema des Protokolls für die mündlichen Lieferung von DsRNA präsentiert sich in Abbildung 1, wo die wichtigsten Schritte für die Vorbereitung der DsRNA Lipoplexes gezeigt werden.
Um den Schutz von Liposomen Trägern auf DsRNA Abbau in den Mitteldarm Saft B. Germanica, ein ex-Vivo -Test wo DsTub Lipoplexes mit Mitteldarm Saft inkubiert wurden durchgeführt wurde und...

Diese Handschrift zeigt die Erschöpfung der Gen-Expression in den Mitteldarm der deutschen Schabe durch orale Einnahme von doppelsträngige RNA in Liposomen verkapselt.

Praktische Anwendung der RNA-Interferenz: mündliche Lieferung von Double-Stranded RNA in Liposomen Träger für Schaben

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Genexpression im Darm von Kakerlaken durch RNA-Interferenz durch orale Einnahme von doppelsträngiger RNA, die in Liposomenträgern eingekapselt ist, zu verringern. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Entwicklung neuer Schädlingsbekämpfungsmethoden zu beantworten, z. B. kann das Abschalten essentieller Gene auf freiem Feld Schädlinge töten? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Liposom die genspezifische doppelsträngige RNA schützt, um ihre Abgabe an die Zielzelle zu gewährleisten.Jia-Hsin Huang, ein Postdoc, und Yun Liu, ein Techniker aus meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren. Zu Beginn betäuben Sie die Kakerlaken auf Eis, bis sie sich drei Minuten lang nicht bewegen. Heben Sie dann ein Insekt mit Daumen und Zeigefinger auf, um Zugang zu seiner Bauchseite zu erhalten.Als nächstes schneidest du mit einer Präparierschere die Spitze einer Coxa eines Hinterbeins zwischen der Coxa und dem Trochanter ab. Das Schneiden an einer anderen Stelle der Coxa ist für die Hämolymph-Sammlungen weniger effizient. Positionieren Sie nun eine 10-Mikroliter-Mikropipette am Schnitt und drücken Sie den Bauch sanft zusammen, während Sie die blutende Hämolymphe hochziehen.Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Hämolymphe von fünf Kakerlaken in einem einzigen Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt wurde. Als nächstes drehen Sie die gepoolte Hämolymphe 10 Sekunden lang kurz herunter. Kombinieren Sie dann 10 Mikroliter Hämolymphe mit 50 Mikrolitern 1x Insektensalzpuffer.Zentrifugen Sie nun die verdünnte Hämolymphe 10 Minuten lang, um die Hämozyten aus der Lösung zu ziehen. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Röhrchen. Quantifizieren Sie schließlich die Gesamtproteinkonzentration mit einem Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer und stellen Sie die Konzentration jeder Probe auf sechs Milligramm Protein pro Mikroliter ein.Um Mitteldarmsaft zu sammeln, betäuben Sie zuerst die Kakerlaken auf Eis. Übertragen Sie dann eine auf eine Sezierplatte, die mit kaltem 1x Insektensalzpuffer beladen ist, und befestigen Sie sie mit Insektenstiften mit der Bauchseite nach oben. Präparieren Sie nun den Bauch mit einer feinen Pinzette.Entfernen Sie dann den gesamten Darm und geben Sie ihn in eine frische Schüssel mit 1x Insektensalzpuffer. Isolieren Sie als Nächstes den Mitteldarm, der die Region zwischen dem Kropf und den Malpighischen Tubuli darstellt. Entfernen Sie dazu den vorderen Teil des Tieres und entfernen Sie den Hinterdarm.Übertragen Sie anschließend den Mitteldarm schnell in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern Insektensalzpuffer. Sammle die Eingeweide von sechs Kakerlaken in dieselbe Röhre. Wirbeln Sie dann das Rohr 10 Sekunden lang ein.Als nächstes zentrifugieren Sie die Mischung 10 Minuten lang, um die Hämozyten und das Darmgewebe zu trennen. Übertragen Sie dann den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie die Konzentration auf sechs Milligramm Protein pro Mikroliter ein. Doppelsträngige RNA-Lipoplexe müssen innerhalb einer Stunde nach der Zubereitung verwendet werden.Achten Sie bei der Herstellung darauf, dass Sie das gesamte verdünnte Reagenz gleichzeitig mit der verdünnten doppelsträngigen RNA kombinieren. Dann die Mischung schnell vortexen und inkubieren. Wenn Sie fertig sind, mischen Sie vier Mikroliter der doppelsträngigen RNA-Lösung mit 10 Mikrolitern Insektensalzpuffer als Kontrolle oder mischen Sie sie mit 10 Mikrolitern extrahierter Enzyme aus Hämolymph- oder Mitteldarmsaft.Führen Sie als Nächstes eine enzymhemmte Kontrolle durch, indem Sie zwei Mikroliter EGTA hinzufügen. Andernfalls fügen Sie zwei Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu. Inkubieren Sie die Proben dann eine Stunde oder länger bei 25 Grad Celsius.Nach der Inkubation 200 Mikroliter Extraktionsreagenz und 40 Mikroliter Chloroform hinzufügen und dann vortexen. Zentrifugieren Sie anschließend die Proben 10 Minuten lang. Übertragen Sie als Nächstes 150 Mikroliter jedes Überstands in ein neues Röhrchen und fällen Sie die doppelsträngige RNA aus jeder Probe aus, indem Sie 150 Mikroliter Isopropanol hinzufügen und die Proben 15 Minuten lang auf Eis inkubieren.Nach der Inkubation werden die Proben erneut zentrifugiert und der Überstand verworfen. Waschen Sie dann die RNA-Pellets zweimal, indem Sie 200 Mikroliter des 70%igen Ethanols zu jedem Pellet hinzufügen und das Röhrchen zentrifugieren. Trocknen Sie die doppelsträngigen RNA-Pellets nach dem zweiten Waschen drei Minuten lang mit einem Zentrifugal-Vakuumkonzentrator.Dann resuspendieren Sie die Pellets in 10 Mikrolitern RNase-freiem Wasser. Überprüfen Sie abschließend die Integrität der behandelten doppelsträngigen RNA mit einem 1,5%igen Agarosegel. Füttern Sie die Kakerlaken zweimal täglich, eine Stunde nach dem Einschalten des Lichts und eine Stunde vor dem Ausschalten des Lichts.Tun Sie dies acht oder 16 Tage lang ohne Unterbrechungen. In dieser Zeit sollten die Kakerlaken ansonsten wasserarm sein. Für die Fütterung stehen frisch präparierte doppelsträngige RNA-Lipoplexe und nackte doppelsträngige RNA zur Verfügung.Für den Bolus verwenden Sie vier Mikroliter doppelsträngige RNA-Lipoplexe oder 250 Nanogramm nackte doppelsträngige RNA. Um eine Kakerlake zu füttern, packen Sie sie zuerst mit einer flexiblen Pinzette an den Flügeln. Greifen Sie nicht nach den Körperteilen einer Kakerlake.Pipettieren Sie dann langsam den Tropfen der Lösung in der Nähe der Mundwerkzeuge und beobachten Sie, wie die Kakerlake den Tropfen aufnimmt. Geben Sie den Kakerlaken nach der letzten Fütterung Wasserflaschen. Untersuchen Sie die Insekten während der gesamten Fütterungsperiode täglich, um die Sterblichkeit zu überprüfen und alle Kakerlaken zu entfernen, die sich nicht mehr aus dem Versuch bewegen.Die kontinuierliche orale Verabreichung von doppelsträngigen Tub-Lipoplexen konnte die Tubulinexpression im Mitteldarm von 40 % am neunten Tag auf 60 % am 17. Tag verringern. Im Vergleich dazu zeigte nackte doppelsträngige RNA keine Wirkung. Dies ist höchstwahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die Exposition der nackten doppelsträngigen RNA gegenüber Mitteldarmsaft innerhalb einer Stunde zu einer Degradation führte, während die Liposomen-konjugierte doppelsträngige RNA stabil blieb.Nicht nur die RNA-Spiegel sanken, sondern die kontinuierliche Fütterung der Tubulin-doppelsträngigen RNA-Lipoplexe führte auch zu einer signifikanten Letalität. Es ist unwahrscheinlich, dass dies auf den Vektor zurückzuführen ist, da Lipoplexe, die doppelsträngige RNA zu EGFP transportieren, zu keiner Letalität führten. Bei diesem oralen Verabreichungssystem der RNA-Interferenz ist es wichtig, eine kontinuierliche Fütterung von doppelsträngiger RNA über mehrere Tage durchzuführen.Sobald Sie es beherrschen, kann der Fütterungsschritt in zwei Minuten pro Insekt durchgeführt werden, wenn er richtig ausgeführt wird. Bei Bedarf können verschiedene Formulierungen von Liposomen-Nanopartikeln angewendet werden, um das Fütterungsverfahren und die RNAi-Effizienz zu verbessern. Letztendlich hat diese Technik es Forschern auf dem Gebiet der Schädlingsbekämpfung ermöglicht, neue Bekämpfungsstrategien mit RNAi zu erforschen.

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Forschung

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Biology

Biologie

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