Name: Schnelle In-Vivo Beurteilung des Adjuvans der zytotoxischen T-Lymphozyten Generation Fähigkeiten für die Impfstoffentwicklung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Lernen Sie eine schnelle Methode zur Bewertung der zytotoxischen T-Lymphozyten-Generierung durch Adjuvanzien mittels CFSE-markierter OT1 CD8+ T-Zellen in Lymphknoten und Milz. Diese Technik ermöglicht die Unterscheidung lokaler und systemischer Immunantworten innerhalb von vier Tagen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir sind verpflichtet, unseren technischen Assistenten: U. Bröder und H. Shkarlet, die uns während der experimentellen Verfahren geholfen. Diese Arbeit wurde teilweise von EU-Zuschüssen (UniVax, Vertrag Nr. 601738 und TRANSVAC2, Vertrag Nr. 730964) und ein Stipendium der Helmholtz-Gemeinschaft (HAI-IDR) finanziert. Die Finanzierungsquellen hat keinen Einfluss auf die Forschung design, Erzeugung von Manuskript oder Entscheidung, zur Veröffentlichung übermitteln.

Alle Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden aus dem C57BL/6-Hintergrund. Alle Tiere wurden unter Pathogen-freies Bedingungen gehalten. Alle Experimente wurden nach den normativen das deutsche Tierschutzgesetz (TierSchG BGBl. durchgeführt. ICH S 1105; 25.05.1998) und des unteren Sachsen-Ausschusses für die Ethik von Tierversuchen und das Landesamt (untere Sachsen Stand für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit), unter der Genehmigung Nr. 33,4-42502-04-13/1281 und 162280 angenommen wurden.
1. CFSE-Färbung des OT-I T-Zellen und Adoptiv-Transfer
Hinweis: OT-ich Mäuse sind Transgen generierten Tiere, die einen T-Zell-Rezeptor (TCR) Ausdrücken mit festen α und β-Ketten, die zusammen die Immuno-Dominant-Peptid der OVA, erkennen SIINFEKL10,11. Infolgedessen haben diese Mäuse eine deutlich hohe Anzahl von SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zellen (97 %)12 im Vergleich zu normalen oder OVA geimpften Mäuse (≤ 1 %)13.
<ol><li>Isolierung von nachvollziehbar CD8+ T-Zellen von OT-ich Mäuse mit dem Ausdruck T-Lymphozyten-spezifischen Thy1ein (Thy1.1) Allel:<ol>
<li>Einschläfern 6-9 Wochen alten OT-ich Mäuse durch CO2 Inhalation gefolgt von zervikale Dislokation14. Die Milz und große Lymphknoten (leisten-, axillären und zervikalen Paare nur) indem die Haut mit chirurgische Scheren, ablösen der Haut aus dem Körper mit Hilfe von chirurgischen Zangen und Pinzetten zu sezieren und legen Sie sie in Petrischalen (60 x 15 mm) jeweils ein 100 µm Pore Netz Tasse Gewebe Schleifen und Zelle Freilassung.</li>
		<li>Pflegen Sie Petrischalen (jeweils mit einem Mesh-Cup) in 3-5 mL des kompletten RPMI Medium (RPMI 1640, 10 % V/V FCS, 100 U/mL Penicillin, Streptomycin 50 µg/mL) auf Eis gehalten.</li>
		<li>Pürieren Sie die Organe mit Hilfe von einem Spritzenkolben oder ein ähnliches steriles Instrument (vorherige schneiden ist nicht erforderlich) und sammeln Sie die entstandene Suspension Einzelzelle in 15 mL Zentrifuge Röhren.</li>
		<li>Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand. Waschen Sie die Zellen in 10 mL kaltem PBS durch Zentrifugation und lyse der Erythrozyten aus der Milz wieder aussetzen das Pellet in 1 mL/Milz Ammoniumchlorid Puffers (ACK-Puffer, im Handel erhältlich). Brüten Sie die Zellen für 1,5 min auf Eis, und waschen Sie anschließend die Zellen mit 10 mL kaltem PBS durch Zentrifugieren (wie zuvor).</li>
		<li>Wieder aussetzen Sie das Pellet in das gleiche Rohr in 1 mL PBS (pH 7,2) mit 5 % fötalen Rinderserum für magnetische Isolierung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um magnetische Isolierung durchzuführen, gehen Sie zu der negativen Auslese der CD8+ T-Zellen durch die Verwendung eines magnetischen isolierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers oder Protokolle15veröffentlicht.</li>
	<li>Zur Durchführung CFSE-Färbung, zuerst die Anzahl der CD8+ T Zellen gewonnenen OT-ich Mäuse mit einem automatisierten Zelle Zähler (Partikelzähler). Fleck 1-5 x 107 Zellen/mL in ein Volumen von 1-5 mL mit 5 µM CFSE mit PBS-Puffer für 7 min bei 37 ° C, lichtgeschützt in einem 15 ml Falcon-Röhrchen.</li>
	<li>Stillen Sie die CFSE-Färbung der Zellen das gleiche Volumen (1:1) des fötalen Rinderserum hinzufügen zu, und inkubieren sie zusätzliche 7 min bei 37 ° C, vor Licht geschützt. Waschen Sie die Zellen mit 10 mL PBS zweimal.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler. Festlegen der Zellzahl auf 3-5 x 107 Zellen/mL PBS um 3-5 x 106 Zellen/Maus in 100 µL intravenös zu injizieren (i.v.) über die Rute Vene.</li>
	<li>Zum Heck Vene Injektionen durchführen zu immobilisieren die Mäuse in entsprechenden wachstumsbefürworter. Wärmen Sie den Rückenbereich und Tail der Mäuse injiziert werden, mithilfe einer Rotlicht-Lampe, zwischen 20 bis 25 cm entfernt von den Mäusen für 1-3 min zum Heck Vene Vasodilatation zu ermöglichen. Hinweis: Dadurch Leichtigkeit Vene Erkennung und Verwaltung der Zellsuspension.</li>
	<li>(Mit der Hand zwischen die Mäuse und die Lampe platziert) sicherzustellen, dass es nicht zu heiß für die Mäuse und wenn die Rute Venen deutlich sichtbar sind, fahren Sie mit der Injektion. Injizieren Sie die Zellen in der seitlichen oder dorsalen Schweif Ader mit einer 1mL Spritze mit einem 25-Gauge-Nadel16.</li>
</ol>2. Immunisierung (Endo-freie OVA +/-adjuvante)
<ol><li>Legen Sie die Mäuse transplantiert mit OT-ich Zellen (Schritt 1.7, Abbildung 1) in einer Narkose-Kammer und Isofluran in Sauerstoff durch eine Anästhesie Maschine14zu verwalten.</li>
	<li>Wenn die Maus völlig eingeschlafen unter Narkose ist, nehmen Sie es aus der Kammer und rasieren Sie das Fell der Maus auf den Bereich über den Gluteus Superficialis (seitlichen unteren Rücken) mithilfe einer elektrischen Haar Beschneidemaschine, um eine saubere Injektion durchführen mit einen guten Blick auf das Einsatzgebiet.</li>
	<li>50 µL des Impfstoffes, s.c. in den rasierten Bereich mit einer 25-Gauge-Nadel zu injizieren.</li>
</ol>3. Isolation von Lymphozyten und Färbung für Flow Cytometry Analysis
<ol><li>Isolierung von Lymphozyten und splenocyten<ol>
<li>Einschläfern Sie die geimpften Mäuse durch CO2 Einatmen, gefolgt von zervikale Dislokation.</li>
		<li>Extrahieren Sie der Entwässerung und entfernten Lymphknoten und der Milz und legen Sie sie in separaten Petrischalen mit 100 µm Pore Netz Tassen Gewebe Schleifen und Zelle Freilassung. Führen Sie die Schritte 1.1.2 durch 1.1.3.</li>
		<li>Abgießen Sie den überstand nach Zentrifugation und wieder auszusetzen Sie, die Zelle Pellets in das gleiche Volumen der Überrest PBS (ca. 100 µL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Färbung für Flow-zytometrie-Analyse<ol>
<li>In einem 15 mL Zentrifugenröhrchen bereiten Sie einen master-Mix enthält die Färbung Antikörper in den Konzentrationen, die in Tabelle 1dargestellt, ein 2 X so nachgiebig Färbung Mischung konzentriert. Bereiten Sie genügend Volumen des master-Mix, 100 µL pro Probe zu haben. Die Zellen und die master-Mix 1:1 mischen und bei 4° C für 30 min inkubieren. Hinweis: Der letzte Färbung Band pro Probe sollte 200 µL (100 µL der Zelle Pellet + 100 µL Antikörper-master-Mix).</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen zweimal durch Zentrifugation, wie unter 1.1.3, Hinzufügen von 10 mL PBS, zweimal.</li>
		<li>Wieder aussetzen der gefärbten Zellen in 0,5-1 mL PBS für Erwerb und die Übertragung der Aussetzung zu Flow Cytometer Röhren. Immer die Proben auf Eis und vor Licht geschützt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. die Durchflusszytometrie
<ol><li>Immer Vorfilter die Zellproben mit 70-100 µm filtern.</li>
	<li>Die Fluorophore detailliert in Tabelle 1 (Perlen oder Zellen) bereiten Sie einheitliche Färbung Entschädigung Kontrollen vor. Hinweis: Entschädigung sollte durchgeführt im Cytometer oder Analyse-Software17,18,19 und auf alle Proben angewendet werden.</li>
	<li>Folgen Sie der gating-Strategie in Abbildung 2dargestellt. Kurz, Tor Populationen im forward Scatter Höhe vs. forward Scatter Bereich (Abbildung 2A), und wieder Seite streuen breit vs. Scatter Seitenbereich (SSA, Abb. 2 b), um Dubletten auszuschließen.</li>
	<li>Tor der Bevölkerung aus Figur 2 b durch Plotten BV 650 (Auto-Fluoreszenz) vs. FITC (CFSE) um echte CFSE-zu diskriminieren gefärbten Zellen aus hohen Auto-fluoreszierende Zellen. Enthalten Sie Perlen oder Zellen befleckt mit Antikörper konjugiert BV 650 in Entschädigung Steuerelemente. Dieses Grundstück (Abbildung 2) BV 650 vs. FITC wird verwendet, um die OT Tor-ich CFSE gefärbten Zellen.</li>
	<li>Tor der Bevölkerung aus Figur 2 C für Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs. APC (CD8) um Zellen aus Spender vs. Empfänger Mäusen zu unterscheiden. Hinweis: Zellen abgeleitet von OT-ich Spender Mäuse sind Thy1.1+ (CD90.1), WT (C57BL/6, Empfänger) Mäuse-abgeleitete Zellen Thy1.2+ (CD90.2) (Abb. 2D). Einige Labore haben OT-ich Mäuse in einem Thy1.2 Hintergrund und WT (C57BL/6) in einem Thy1.1. In diesem Fall müssen Sie einen Antikörper gegen Thy1.2 für OT verwenden-ich Handy-gating.</li>
	<li>Re Tor CD8+ Zellen von Thy1.1+ Bevölkerung durch Plotten es auf ein Tor, bestehend aus BV 450 (CD4) vs. APC (CD8) (Abb. 2E).</li>
	<li>Anzeigen die Bevölkerung in Abbildung 2E mithilfe eine Histogrammanzeige von der CD8 gated+ Zellen zeigen CFSE (FITC, 530/15-Kanal - blaue Laser-), Tor die proliferierte Bevölkerung durch die Einbeziehung der Intensitäten von 102 bis auf die Ebene wo die ungeteilten Kontrolle Bevölkerungen sind (Intensitäten ~ 105, abhängig von der Wirksamkeit der CFSE-Färbung und die Spannungseinstellung auf das Durchflusszytometer) (Abb. 2F).</li>
	<li>Machen Sie einen zusätzliches Tor (nicht in Abbildung 2 dargestellt) Plotten FITC vs. L/D-Marker (450/20 Kanal, UV-Laser), um tote Zellen parallel zur Verbreitung Bewertung bewerten.</li>
	<li>Erwerben Sie mindestens 5000 Ereignisse für die Entschädigung Steuerelemente und 10,000 Ereignisse (Tor E, Abbildung 2) aus den Proben in einem Durchflusszytometer. Laufen die Cytometer mit geringer oder mittlerer Durchfluss (Flussraten von 20.000 Veranstaltungen/s nicht überschreiten).</li>
</ol>

<ol><li>Krishna, S., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+Epitope+Discovery+for+Therapeutic+Cancer+Vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).</li>
<li>Pinchuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD8%2B+T+cell+heptaepitope+minigene+vaccine+induces+protective+immunity+against+Chlamydia+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae.</a> Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).</li>
<li>Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonates+mount+robust+and+protective+adult-like+CD8%28%2B%29-T-cell+responses+to+DNA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines.</a> Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).</li>
<li>Marchant, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+CD8%28%2B%29+T+lymphocyte+response+to+viral+infection+during+fetal+life%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life.</a> J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).</li>
<li>Simmons, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+delivery+of+a+respiratory+syncytial+virus+CTL+peptide+with+enterotoxin-based+adjuvants+elicits+protective%2C+immunopathogenic%2C+and+immunoregulatory+antiviral+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses.</a> Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).</li>
<li>Fulginiti, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Virus+Immunizationa+Field+Trial+Of+Two+Inactivated+Respiratory+Virus+Vaccines%3B+An+Aqueous+Trivalent+Paratnfluenza+Virus+Vaccine+And+An+Alum-Precipitated+Respiratory+Syncytial+Virus+Vaccine1%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+epidemiology%22%5BJournal%5D)">Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1.</a> American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).</li>
<li>Olson, M. R., Varga, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+T+cells+inhibit+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29+vaccine-enhanced+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease.</a> Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).</li>
<li>Lirussi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFN+and+not+TNF%2C+is+Essential+for+Cyclic+Di-nucleotide-elicited+CTL+by+a+Cytosolic+Cross-presentation+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway.</a> EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).</li>
<li>Ebensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis-%283%27%2C5%27%29-cyclic+dimeric+adenosine+monophosphate%3A+strong+Th1%2FTh2%2FTh17+promoting+mucosal+adjuvant%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant.</a> Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).</li>
<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li>
<li>Clarke, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+ovalbumin-specific+TCR+transgenic+line+OT-I%3A+MHC+elements+for+positive+and+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection.</a> Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).</li>
<li>Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+antigen+in+the+localization+of+naive%2C+acutely+activated%2C+and+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+to+the+lung+during+influenza+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia.</a> Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-priming+of+CD8%2B+T+cells+stimulated+by+virus-induced+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon.</a> Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).</li>
<li>Otto, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOtto%2C+K+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Bullock, G. , Academic Press. 555-569 (2004).</li>
<li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).</li>
<li>Shimizu, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShimizu%2C+S+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Bullock, G. , Academic Press. 527-542 (2004).</li>
<li>Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+human+dendritic+cell+progenitors+by+multiparametric+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry.</a> Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).</li>
<li>Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -H., Sanz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+Flow+Cytometry+and+Bioanalytics+for+B+Cell+Profiling+in+Systemic+Lupus+Erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus.</a> Methods in molecular biology. 900, Clifton, N.J. 109-134 (2012).</li>
<li>Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+workshop+on+fluorescence+compensation+settings+in+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+B%2C+Clinical+cytometry%22%5BJournal%5D)">Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).</li>
<li>Newrzela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+diversity+prevents+T-cell+lymphoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development.</a> Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).</li>
<li>Iwasaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergen+endotoxins+induce+T-cell-dependent+and+non-IgE-mediated+nasal+hypersensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).</li>
<li>Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+LPS+in+OVA+inhalations+affects+airway+inflammation+and+AHR+but+not+remodeling+in+a+rodent+model+of+asthma.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology.</a> Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).</li>
<li>Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+mechanistic+separation+of+cross-presentation+and+endogenous+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation.</a> Nature. 9, 558-566 (2008).</li>
<li>Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lymphocyte+proliferation%3A+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+immunology%22%5BJournal%5D)">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cellular immunology. , 79-85 (2009).</li>
<li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+CD8%28%2B%29+antigen-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+after+enrichment+based+on+cytokine+secretion%3A+comparison+with+the+MHC-tetramer+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology.</a> Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).</li>
<li>Wang, W., Golding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytotoxic+T+lymphocyte+response+against+a+protein+antigen+does+not+decrease+the+antibody+response+to+that+antigen+although+antigen-pulsed+B+cells+can+be+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+letters%22%5BJournal%5D)">The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets.</a> Immunology letters. 100, 195-201 (2005).</li>
<li>O'Sullivan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+CD8%28%2B%29+T+cells+use+cell-intrinsic+lipolysis+to+support+the+metabolic+programming+necessary+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development.</a> Immunity. 41, 75-88 (2014).</li>
<li>Xu, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+protects+antiviral+CD8%2B+T+cells+from+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity.</a> Immunity. 40, 949-960 (2014).</li>
<li>Volk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+humanized+mouse+models+for+adoptive+T+cell+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer.</a> The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).</li>
<li>Safinia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+Mice+as+Preclinical+Models+in+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation.</a> Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).</li>
<li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+NOG+mice+as+a+model+for+tuberculosis+vaccine-induced+immunity%3A+a+comparative+analysis+with+the+mouse+and+guinea+pig+models+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis.</a> Immunology. 152, 150-162 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Moderne Impfstoffe sind im Idealfall Composedof gereinigte Antigen und Hilfsstoffe, mit den möglichen Zusatz eines Liefersysteme wie Liposomen, virusähnliche Partikel, Nanopartikel oder live Vektoren. Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung eines Impfstoffes ist, die richtigen adjuvanten nach den klinischen Bedürfnissen wählen. Bestandteil des Lieferumfangs könnte begünstigt eine humorale vs. zelluläre Immunantwort (oder beides), die Wahl eines lokalen vs. einer systemischen Immunantwort (oder beides) und die Art des Sp...

Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzieren Impfstoffe sind wichtige therapeutische Interventionen, die entwickelt wurden, um bestimmte Arten von Krebs1zu kämpfen. CTL sind auch wichtig für prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger2. Darüber hinaus CTL sind eine der wenigen immun Abwehrmechanismen in Gefahr Bevölkerungen wie Neugeborene3,4 wen auch abhängig von CTL gegen frühen Lebens Infektionen5funktionell aktiv. In diesem Zusammenhang führte Impfstoffe gegen Respiratory Syncytial Virus (RSV), die mit Adjuvans entwickelt wurden, die nicht CTL-Antworten (Alaun) entlocken wird ein Totalausfall des Impfstoffes führt zu schwerwiegenden Komplikationen bei Infektionen bei Säuglingen6. Diese negativen Auswirkungen der Impfung können rückgängig gemacht werden, indem eine CD8+ T-Zell Antwort7. Wir haben bereits gezeigt, dass die wichtigsten Zytokine (Typ-I-Interferone) hervorgerufen durch einige Stimulator der Interferon-Genen (STING)-Agonisten unerlässlich für die CTL-Antworten generiert durch diese Adjuvantien8, teilweise sind durch die Messung der Verbreitung von OT-I T-Zellen nach Impfung und anhand dieser Ergebnisse als ein Maß für die CTL induzierende Fähigkeiten beobachtet Impfung Zeitpläne9erweitert. Die Messung der Verbreitung von OT-ich CD8+ T-Zellen in einem Wild-Typ (WT) C57BL/6 Empfänger Maus durch Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) Farbstoff Verdünnung ist eine robuste Einschätzung der Fähigkeit des Adjuvans eines Impfstoffs zu generieren Kreuz-Grundierung von SIINFEKL, (die Immuno-dominante Peptid von Ovalbumin, Eizellen). Variationen dieser Technik sind weit verbreitet für die Beurteilung der Verbreitung von OT-ich CD8+ und OT-II CD4+ T Zellen. Zum Beispiel hat es in Abwesenheit des ausgewählten Zytokine (KO-Mäusen) oder impfstoffwirksamkeit nach Antigen-Rückruf bei WT Tieren Messen eingesetzt. Wir entwickelten ein kurzes Protokoll (4 Tage-Experiment) in dem nach Passive Übertragung der CFSE--gefärbten OT-ich CD8+ T-Zellen, eine subkutane (s.c.)-Immunisierung, bestehend aus einer Dosis von 50 µg von Endotoxin-freie OVA ergänzt mit Test Adjuvantien verabreicht (Abbildung 1). Die Follow-up der Ergebnisse 48 h nach der Impfung bietet zuverlässigen Beweis für die Fähigkeit des Adjuvans, CTL-Antworten zu generieren. Mit dieser Strategie ist es möglich, die Wirksamkeit der lokalen Immunantwort in die drainierenden Lymphknoten nach Immunisierung sowie das Ausmaß der Reaktion zu bewerten, durch Messung der CTL-Aktivität in der Milz (oder entfernte Lymphknoten).

<table><tbody><tr><td>BD LSR Fortessa Cell Analyzer</td><td>BD</td><td>Special Order</td><td>Durchflusszytometer</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molekulare Sonden</td><td>C34554</td><td>Proliferationsfarbstoff</td></tr><tr><td>MojoSort Maus CD8 T-Zell-Isolationskit</td><td>Biolegend</td><td>480007</td><td>Magnetic Isolation Perlen und Antikörper für die Negativselektion von unberührten CD8 T-Zellen.</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, für UV-Anregung</td><td>Molekulare Sonden</td><td>L23105</td><td>Dead Cell Marker</td></tr><tr><td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoklonaler Antikörper (HIS51), PE-Cyanin7</td><td>eBioscience</td><td>25-0900-82</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>APC Anti-Maus CD8a Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>100712</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>BV421 Ratte Anti-Maus CD4</td><td>BD</td><td>740007</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Z2 Schar Partikelzahl- und Größenanalysator</td><td>Beckman Schar</td><td>9914591DA</td><td>Zellzähler. Z2 Automatisierter Partikel-/Zellzähler</td></tr><tr><td>EndoGrade Ovalbumin (10 mg)</td><td>Hyglos (Deutschland)</td><td>321000</td><td>Ovalbumin endotoxinfrei getestet.</td></tr><tr><td>Zellsieb 100&micro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>Cell Sieb (100 & Mikro; M Pore Mesh Cups).</td></tr><tr><td>Probenfläschchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>899366014</td><td>Probenfläschchen für Z2 automatisierte Zähler</td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäuse (CD90.2)</td><td>Harlan (Rossdorf, Deutschland)</td><td></td><td>Das Unternehmen ist jetzt Envigo</td></tr><tr><td>OT-I (C57BL/6 Hintergrund, CD90.1)</td><td>Harlan (Rossdorf, Deutschland)</td><td></td><td>Inzucht in unserer Tieranlage. Firma, von der jetzt übernommen wurde, ist Envigo</td></tr><tr><td>FACS Röhrchen</td><td>Fischer (Corning)</td><td>14-959-5</td><td>Corning Falcon Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Röhrchen</td><td>Fischer (Corning)</td><td>05-527-90</td><td>Falcon 15mL konische Zentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>PBS (500 mL)</td><td>Fischer (Gibco)</td><td>20-012-027</td><td>Gibco PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung), pH 7,2</td></tr><tr><td>Rote Lampe (Heizlampe)</td><td>Dirk Rossmann GmbH (Deutschland)</td><td>405096</td><td>Heizung mit Infrarotlampe (100 Watt</td></tr>)<tr><td>IsoFlo (Isofluran)</td><td>Abbott Laboratories (USA)</td><td>5260.04-05.</td><td>Isofluran-Anästhesie (250 mL Flasche).</td></tr><tr><td>Tisch-Anästhesiegerät/Mobiles Anästhesiegerät mit CO2-Absorber</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PK</td><td>Isofluran-Anästhesiegerät.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco (vertrieben von ThermoFischer)</td><td>11-875-093</td><td>Basismedium mit Glutamin (500 mL)</td></tr><tr><td>Pen-Strept antibiotische Lösung (Gibco)</td><td>Gibco (vertrieben von ThermoFischer)</td><td>15-140-148</td><td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td></tr><tr><td>Fetales Bobine Serum (Gibco)</td><td>Gibco (vertrieben von ThermoFischer)</td><td>10082147</td><td>Fötales Rinderserum, zertifiziert, hitzeinaktiviert, Herkunft aus den USA</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer (100 ml)</td><td>Gibco (vertrieben von ThermoFischer)</td><td>A1049201</td><td>Amoniumchlorid Kalium (ACK) Vollblut-Lysepuffer, geeignet für die Erytrozytenlyse in Milzsuspensionen auch</td></tr><tr><td>Kunststoff-Petrischalen</td><td>Nunc (vertrieben von ThermoFischer)</td><td>150340</td><td>60 x 15mm Kunststoff-Petrischale, unbehandelter</td></tr><tr><td>Zellklumpenfilter</td><td>CellTrics (Sysmex)</td><td>04-004-2317</td><td>CellTrics&reg; 50 &mu; M, steril</td></tr></tbody></table>

schnelle in-vivo beurteilung des adjuvans der zytotoxischen t-lymphozyten generation fähigkeiten für die impfstoffentwicklung

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

Die Bewertung der modernen Untereinheit Impfstoffe zeigt, dass die Generation von neutralisierenden Antikörpern wichtig, aber nicht ausreichend für die adjuvante Auswahl. Daher sind Hilfsstoffe mit humorale und zelluläre Immuno-stimulierende Funktionen, die in der Lage, zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) Antworten zu fördern sind dringend notwendig. So steht treu Überwachung der adjuvanten Kandidaten, die Kreuz-Grundierung zu induzieren und anschließend verbessern CTL-Generation einen entscheidenden Schritt in der Entwicklung von Impfstoffen. Hier präsentieren wir einen Antrag auf eine Methode, die SIINFEKL-spezifische verwendet (OT-ich) T-Zellen, die Kreuz-Präsentation des Modells Antigen Ovalbumin (OVA) in Vivo in Anwesenheit von verschiedenen adjuvante Kandidaten zu überwachen. Diese Methode stellt ein Schnelltest Adjuvantien mit den besten Cross-Priming-Funktionen auswählen. Die Proliferation von CD8+ T Zellen ist die wertvollste Angabe des Kreuz-Grundierung und es gilt auch als Korrelat des Adjuvans-induzierte Kreuz-Präsentation. Diese Funktion kann in verschiedenen immun Organen wie Lymphknoten und Milz ausgewertet werden. Das Ausmaß der CTL-Generation auch überwacht werden kann, wodurch es Erkenntnisse über die Natur eines einheimischen (Lymphknoten vor allem entleeren) oder eine systemische Reaktion (entfernte Lymphknoten und/oder Milz). Diese Technik weiter erlaubt mehrere Modifikationen zum Testen Medikamente, die können hemmen bestimmte Wege Kreuz-Präsentation und bietet auch die Möglichkeit in verschiedene Stämme von konventionellen und gentechnisch veränderten Mäusen verwendet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen wird die Anwendung, die wir hier präsentieren nützlich für Impfstoff-Labors in Industrie oder Wissenschaft sein, entwickeln oder ändern chemischen Hilfsstoffe für Impfstoff-Forschung und Entwicklung.

Um die Behandlungen mit einer anderen Kombination von Adjuvantien (ADJ1 und ADJ2) zu testen, beurteilten wir die CTL-Erzeugungskapazitäten durch Messung der Verbreitung von adoptively übertragenen OT-ich CD8+ T-Zellen durch Durchflusszytometrie (Abbildung 2). Hierzu gebeizt wir zuvor isolierte Zellen aus der drainierenden Lymphknoten und der Milz (Tabelle 1). Durch die Messung der Proliferation von CD8+ T Zellen in Lymph...

Wir stellen Ihnen hier einen Antrag auf eine immunologische Standardtechnik (CFSE gebeizt OT-ich Verbreitung) schnell Adjuvans-vermittelten zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Generation überwachen sollen in-vivo. Diese schnelle Abschätzung der CTL-Kapazitäten ist nützlich für die Entwicklung der prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger sowie therapeutische krebsimpfstoffe.

Schnelle In-Vivo Beurteilung des Adjuvans der zytotoxischen T-Lymphozyten Generation Fähigkeiten für die Impfstoffentwicklung

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Fähigkeit von Adjuvantien von Interesse zur Erzeugung zytotoxischer T-Lymphozyten zu bestimmen, indem adoptiv übertragene CFSE-gefärbte OT1 CD8-positive T-Zellproliferation in den drainierenden Lymphknoten und Milz immunisierter Empfängertiere überwacht wird. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Vakzinologie zu beantworten, wie z.B. die Wirksamkeit eines Adjuvans, um eine zytotoxische Zellantwort zu erzeugen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie nicht nur die CTL-Kapazität eines Adjuvans bestimmen können, sondern auch, ob es sich um ein lokales oder systemisches Adjuvans handelt, und zwar in nur vier Tagen.Das Verfahren wird von einer Technikerin in unserem Labor, Elena Reinhard, demonstriert. Um 1.1-positive CD8-positive T-Zellen aus OT1-Mäusen zu isolieren, ernten Sie zunächst die Milz und die Leisten-, Achsel- und Gebärmutterhalslymphknoten gemäß Standardprotokollen, indem Sie alle Organe in ein 100-Mikrometer-Porennetzsieb in einer 60-Millimeter-Petrischale geben, die drei bis fünf Milliliter vollständiges Medium pro Maus auf Eis enthält, während sie entnommen werden. Entnehmen

rapid-vivo-assessment-adjuvant-s-cytotoxic-t-lymphocytes-generation

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Eine schnelle, einfache und kostengünstige Protokoll für die Erzeugung von Spender-derived multivirus-spezifische CTLs (RCTL) zur Infusion einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Empfänger die Gefahr der Entwicklung CMV, Adv. oder EBV-Infektionen. Dieses Herstellungsverfahren ist GMP-konform und sollte die breitere Umsetzung von T-Zell-Immuntherapie über spezialisierte Zentren zu gewährleisten.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Das Video zeigt eine immunologische Methode zur Überwachung der in vivo adjuvansinduzierten zytotoxischen T-Lymphozyten- oder CTL-Produktion. Einer Maus werden gentechnisch veränderte, proliferative Farbstoff-gefärbte CD8+ T-Spender-Lymphozyten vorinjiziert. Die subkutane Injektion von Ovalbumin mit Adjuvantien erzeugt zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten, die nach der Entnahme durch Immunfärbung und Durchflusszytometrie identifiziert werden.

Eine immunologische Technik zur Überwachung der adjuvansvermittelten zytotoxischen T-Lymphozytenbildung

Die Fähigkeit, T-Zell-Antworten im Detail in vivo Überwachung ist wichtig für die Entwicklung des Verständnisses der Immunantwort. Hier beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Zielarrays (FHA) in einem in vivo-T-Zell-Assay,&gt; 250 Parameter beurteilt gleichzeitig mittels Durchflusszytometrie.

Die Verwendung von fluoreszierenden Ziel Arrays zur Beurteilung der T-Zell-Antworten<em&gt; In-vivo-</em

Wir beschreiben Ganztier-Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Techniken zur Überwachung der Expansion von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen als Reaktion auf die Immunisierung mit Nanopartikeln in einem Mausmodell der Impfung.

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, für die Erkennung von in Vivo Antigen-spezifische Tötung einer Ziel-Zelle in einem Mausmodell ermöglichen.

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Hier bieten wir eine Demonstration des Modells Saug Blister kutanen erinnern. Das Modell ermöglicht einen einfachen Zugang zu menschlichen in-Vivo adaptive Immunantworten, zum Beispiel im Rahmen der Entwicklung von Impfstoffen zu studieren.

Ein Saug Blister-Protokoll, menschliche T-Zelle Recall Antworten In Vivo zu studieren

Experimentelle Verfahren für die spätere Gewinnung von lymphatischen Gewebe, lymphatischen Dendritische Zelle Aktivierung testen werden nach der Behandlung eine immunstimulierende Nanomaterials beschrieben.

Immunstimulierenden Agent Bewertung: Lymphatischen Gewebe Extraktion und Injektion Route-Dependent Dendritische Zelle Aktivierung

Wir beschreiben hier einen in vivo tötenden Assay basierenden Strömungszysam, der die Untersuchung der Immunodominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) auf ein Modell-Tumor-Antigen ermöglicht. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie dieser elegante Test für mechanistische Studien und für die Wirksamkeit von Medikamenten eingesetzt werden kann.

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Das Protokoll enthält detaillierte Methoden, um zu beurteilen, ob die Nanoemulsion Ophiopogonin D Adjuvans eine effektive zelluläre Immunantwort fördert.

In vitro Bewertung der zellulären Aktivität des Nanoemulsionsimpfstoff-Adjuvans Ophiopogonin D

Hier stellen wir detaillierte Methoden zur Herstellung und Evaluierung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo vor.

Herstellung, Eigenschaften, Toxizität und Wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo

Die Methodik beschreibt die Generierung von bovinen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs) und deren Anwendung für die In-vitro-Evaluierung von Antigenkandidaten während der Entwicklung potenzieller veterinärmedizinischer Impfstoffe bei Rindern.

Bestimmung der Immunogenität von Impfstoffen anhand von dendritischen Zellen aus Rindermonozyten

Lernen Sie eine schnelle Methode zur Bewertung der zytotoxischen T-Lymphozyten-Generierung durch Adjuvanzien mittels CFSE-markierter OT1 CD8+ T-Zellen in Lymphknoten und Milz. Diese Technik ermöglicht die Unterscheidung lokaler und systemischer Immunantworten innerhalb von vier Tagen.

Schnelle In-Vivo Beurteilung des Adjuvans der zytotoxischen T-Lymphozyten Generation Fähigkeiten für die Impfstoffentwicklung

Weitere Videos entdecken