Name: CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Erfahren Sie die CRISPR-basierte CLOuD9-Methode zur reversiblen Reorganisation von Chromatinstrukturen und Modulation der Genexpression. Diese Technologie ermöglicht präzise Kontrolle über chromosomale Architektur und transkriptionelle Dynamik in verschiedenen Zelltypen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, s. Batista, E. Calo und die gesamte Wang-Labor für technische Unterstützung und kritische Lektüre des Manuskripts. S.L.M. wurde in dieser Arbeit durch die NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) und das National Cancer Institute (1F99CA222541-01) unterstützt. K.C.W. wird durch den Career Award für Mediziner aus dem Burroughs Wellcome Fonds unterstützt und ist ein Donald E. und Delia B. Baxter Foundation Faculty Scholar.

1. gRNA Design
<ol><li>Wählen Sie ein standard gRNA-Design-Tool, den Guide RNAs10zu entwerfen. Komplementäre Paare der zuvor entwickelten CLOuD9 Konstrukte9 verwenden (d. h. mindestens 1 S. Aureus (CSA) und 1 S. Pyogenes (CSP) konstruieren) für jedes Experiment.<ol>
<li>Innerhalb der ausgewählten Online-Design-Tool, verwenden die Protospacer angrenzenden Motiv (PAM) Sequenz "NGG" mit einer Anleitung Länge von 20 bp für CSP und die PAM-Sequenz "NNGRRT" mit einer Anleitung Länge von 21 für CSA.</li>
		<li>Wählen Sie Führer anhand der Spezifität der Gäste und design Guides auf beiden Strängen, Chancen auf eine funktionierende Anleitung zu maximieren.</li>
		<li>Bestellen Sie 2 Oligonukleotide pro Guide von einem Oligo-Hersteller: für die vorwärts Oligo, fügen Sie "Caccg", 5'-Ende der Anleitung Folge, und für die umgekehrte Oligo, hinzufügen "Aaac", die 5'-Ende und "c" am 3'-Ende vor der Bestellung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entwerfen Sie zunächst 3-5 gRNAs für die einzelnen Regionen von Interesse, über eine 250-1000 bp Region verteilt. Die gRNA Ausrichtung auf Effizienz wie folgt zu bewerten:<ol>
<li>Klon identifiziert gRNAs in eine aktive Cas9 Plasmid (siehe Schritt 3) und vorübergehend transfizieren in 293T Zellen (siehe Schritt 4)11.</li>
		<li>Wachsen Sie Zellen für 2-3-d in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Stift Strep), dann ernten Sie und extrahieren Sie genomische DNA12zu.</li>
		<li>Verstärken Sie Zielregionen durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Führen Sie Produkte auf einem 1,5 % Agarosegel und reinigen Sie entsprechenden Bands zu.</li>
		<li>Einen T7 Endonuklease Assay durchführen, wie beschrieben in der Guschin Et Al. Protokoll Nr.13,14. Hinweis: Effiziente Führer sind die DNA an den Zielstandort schneiden will.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. die Zellkultur
<ol><li>Zellen in ein gesundes und aktiv Teilen Zustand zu erhalten.<ol>
<li>Für K562s, Kultur in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medien mit 10 % FBS und 1 % Stift strep.<ol>
<li>Wachsen Sie K562s in einem 25 cm2 abgeschrägten Hals Kolben für Wartung und passen Sie die Zelldichte auf 400.000 Zellen pro mL pro Tag.</li>
			<li>Nachdem K562s mit ausgestrahlt wurde haben CLOuD9 konstruiert, Wartung Medien 2 µg/mL Puromycin und 100 µg/mL Hygromycin hinzufügen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Für 293Ts, Kultur in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % FBS und 1 % Stift strep.<ol>
<li>293Ts in 10 cm2 Platten wachsen und beim konfluierende aufgeteilt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Plasmid Vorbereitung und gRNA Insertion15
Hinweis: Plasmid-Karten sind erhältlich im Anhang und Primer verwendet in der Beispiel-Experimente gibt es in ergänzenden Tabelle1.
<ol><li>Mix 5 µg des Lentivirale CRISPR-Plasmids mit 3 µL BsmBI, 3 µL alkalische Phosphatase, 6 µL 10-fach Puffer und 0,6 µL frisch zubereitete 100 mm DTT. Das Gesamtvolumen 60 µL mit DdH2O bringen und Inkubation bei 37 ° C für 30 min zu verdauen und dephosphorylate das Plasmid.</li>
	<li>Gel reinigen das verdaute Plasmid und eluieren in DdH2O.</li>
	<li>Mix 1 µL jedes der gekoppelten Handbücher bei 100 µM mit 1 µL 10 x T4 Ligation Puffer, 6,5 µL DdH2O und 0,5 µL T4 PNK, 10 µL Gesamtvolumen zu erreichen. Inkubation bei 37 ° C für 30 min, dann 95 ° C für 5 min, dann auf 25 ° C bei 5 ° C/min Rampe. Hinweis: Dies wird das Paar Guides Tempern.</li>
	<li>Verdünnen Sie die geglühten Führer (aus Schritt 3.3) 1: 200 in DdH2O.</li>
	<li>Mix 1 µL des verdauten Plasmids aus Schritt 3.2 mit 0,5 µL verdünnter aufgespaltenen Guides aus Schritt 3.4, 2,5 µL 2 x Puffer, 1 µl DdH2O und 0,5 µL Ligase, 5,5 µL Gesamt Reaktion zu machen. Inkubieren Sie dies bei Raumtemperatur für 10 min in die Führungen auf dem Plasmid BsmBI verdaut zu verbinden.</li>
	<li>Neu aufgespaltenen Plasmid aus Schritt 3.5 in Stbl3 Bakterien verwandeln und mit einer beliebigen Plasmid Vorbereitung Methode zu verstärken.</li>
</ol>4. Lentivirus Produktion
<ol><li>Graf 750.000 293T Zellen pro Bohrloch für ein sechs-Platte mit einem Hemocytometer und Säen sie in DMEM mit 10 % FBS und 1 % Stift strep. Verwenden Sie einen Brunnen für jedes Konstrukt.</li>
	<li>24 h nach der Aussaat, ändern Sie Medien in frischen antibiotikafreien DMEM mit 10 % FBS.</li>
	<li>Verdünnen Sie in einem Rohr 11 µL Lipid-basierte Transfection Reagens mit 150 µL des OptiMEM Mediums pro Reaktion11.</li>
	<li>In einem separaten Rohr 2 µg des Plasmids CLOuD9 Lentivirale Vektor aus Schritt 3.6, 0,35 µg pMDLg/pRRE, 1 µg pRSV-Rev und 0,65 µg des pMD2.G mit 150 µL des OptiMEM Mediums pro Reaktion11zu verdünnen.</li>
	<li>Für jede Reaktion verdünnter Lipid-basierte Transfection Reagens im Verhältnis 1:1 verdünnten Lentivirale Plasmid-Mischungen hinzu, und inkubieren Sie 5 min11.</li>
	<li>Fügen Sie das gesamte Volumen der jeder gemischten Komplex aus Schritt 4.5 in die jeweiligen Vertiefungen der antibiotikafreien 293T Zellen aus Schritt 4.2.</li>
	<li>48 h sammeln durch pipettieren in ein frisches Tubus und Spin down bei 300 X g für 5 min später, virale Produktion Medien. Nach Zentrifugation bewegen des Überstands zu einem frischen Schlauch, verbleibende Zelle Ablagerungen zu entfernen.</li>
	<li>Virale Produktion Media für die Transduktion von Zielzellen sofort verwenden oder Einfrieren bei-80 ° C für eine spätere Verwendung.</li>
</ol>5. Lentivirus Transduktion von Zellen
<ol><li>Eine 15 mL konische Röhrchen mit 80.000 Zellen für die Anwendung von CLOuD9 fügen Sie 250 µL jedes virale Konstrukt von Interesse (bestehend aus komplementären CLOuD9 Plasmide hinzu).</li>
	<li>Bringen Sie das Gesamtvolumen der Medien in jedem kegelförmig bis 1 mL mit Antibiotika-freie Medien, und fügen Sie Polybrene, eine Endkonzentration von zwischen 1 bis 8 µg/mL (die maximale Konzentration des Polybrene toleriert durch die Zelle Art genutzt werden müssen experimentell ermittelt werden).</li>
	<li>Spin-Zellen bei 800 X g für 30 min bei Raumtemperatur, dann durch pipettieren ohne Entfernen des viralen Überstands aufzuwirbeln. Verschieben Sie die gesamte Zellsuspension auf eine Zellplatte Kultur.</li>
	<li>24 h nach Transduktion, Spin-Zellen nach unten bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Aspirieren Sie virale überstand und aufzuwirbeln Sie Zellen in regelmäßigen Zellkulturmedien.</li>
	<li>Am nächsten Tag fügen Sie Puromycin (1 µg/mL für 293T Zellen) und Hygromycin (25 µg/mL für 293T Zellen hinzu) Zellkulturmedium für doppelt ausgestrahlt Zellen auswählen. Experimentell bestimmen Sie die entsprechenden Konzentrationen von Puromycin und Hygromycin für einen bestimmten Zelltyp vor Beginn der Experimente.</li>
	<li>Zellen im Auswahl-Media für mindestens 3 d vor alle nachgelagerten Experimente und halten im Auswahl-Media für die Dauer aller Experimente.</li>
</ol>6. Zelle Dimerisierung und Auswaschen
<ol><li>Fügen Sie 1 mM Abscisic Säure (ABA) oder gleichwertigem Umfang von Dimethyl Sulfoxid (DMSO) für Steuerelemente, Zellkultur, die CLOuD9 Dimere ausgewählt und Zellen ausgestrahlt. Verwenden Sie ABA innerhalb von 6 Monaten ab Datum des Eingangs, halten Sie kalt und schützen Sie es vor Licht während der Benutzung. 2 mM ABA kann genutzt werden, wenn nötig.<ol>
<li>Medien täglich frische ABA (oder DMSO für Steuerelemente) für die Dauer des Experiments zu ändern. Hinweis: Keine Begrenzung auf der Länge der Dimerisierung ist noch nicht beobachtet worden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Umgekehrter Dimerisierung durch die Beseitigung von Medien mit ABA und waschen Zellen mit ausreichend Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf die Oberfläche der Platte, zweimal decken. Danach Zellkulturen in ABA-freie Medien zu einen un-dimerized Zustand zu halten.</li>
</ol>(7) Immunopräzipitation und Co-Immunperoxidase
Hinweis: Stellen Sie alle Puffer frisch und unmittelbar vor der Verwendung.
<ol><li>Nach Abschluss der Dimerisierung Experimente, sammeln und spin-down Zellen, dann Aspirieren überstand.</li>
	<li>Crosslink und Einfrieren Zellen<ol>
<li>Machen Sie einen frischen Vorrat an 1 % Formaldehyd in PBS bei Raumtemperatur mit frischen Materialien. Aufschwemmen Sie für jede 2 Millionen Zellen sanft mit 1 mL 1 % Formaldehyd bei Raumtemperatur für genau 10 min beim Drehen. Hinweis: Verwenden Sie ein Mindestvolumen von 10 mL für Vernetzung weniger als 10 Millionen Zellen.</li>
		<li>Vernetzung mit dem Zusatz von Glycin, eine Endkonzentration von 0,125 M, gefolgt von Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur während der Drehung zu stillen.</li>
		<li>Spin-down Zellen und 1-2 X mit eiskaltem PBS waschen. Zelle Pellets können dann Snap in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° C gelagert oder sofort verwendet werden. Hinweis: Wärme wird Formaldehyd Querverbindungen umzukehren. Wenn gehetzt, können Zellen direkt bei-80 ° C gespeichert werden, ohne die Snap einfrieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Antikörper/Wulst-Konjugat vorbereiten Hinweis: Optimierung Bedingungen für ausgewählte Antikörper (z. B. Testen verschiedene Lyse Puffer für Zelle Lysis und Durchführung IP) können sich lohnen. Zwei gemeinsame Puffer, Farnham Lyse Puffer und modifiziert RIPA Puffer, können erhebliche Auswirkungen auf die IP und Beschallung Effizienz haben. Alle Puffer Kompositionen finden Sie in der Tabelle der Materialien. Darüber hinaus denken Sie daran, dass Chromatin Beschallung kann mehrere Stunden in Anspruch nehmen.<ol>
<li>Aufschwemmen Sie Perlen durch Vortexen kurz nach Bedarf für den gewählten Antikörper.</li>
		<li>Übertragen Sie einen angemessenen Betrag von Perlen für das Experiment auf eine 1,5 mL-Tube. Als Ausgangspunkt verwenden Sie 20 µL Perlen für jeden 1 µg des Antikörpers. Fügen Sie noch keine Antikörper. Hinweis: Verwenden Sie 10 µg Antikörper mit 200 µL Perlen für 1 mg insgesamt lysate als Ausgangspunkt, es sei denn, es bekannt ist, dass der Antikörper mehr oder weniger effizient ist, als würde dies bedeuten. Für niedrige Fülle Proteine kann dieses Verhältnis angepasst werden müssen.</li>
		<li>Wenn Farnham Lyse Puffer verwenden, waschen Sie 3 X in IP-Verdünnungspuffer. Wenn RIPA Lyse Puffer verwenden, waschen Sie 3 X im RIPA Lyse Puffer.</li>
		<li>Aufschwemmen Perlen in einem Endvolumen des gleichen Puffers ab Schritt 7.3.3 (IP-Verdünnung oder RIPA-Puffer), die > 1 X und < 5 x des Ausgangsvolumens. d. h. Für 100 µL erste Perle Volumen zwischen 100 und 500 µL endgültige Wiederfreisetzung Volume verwenden.</li>
		<li>Gewaschene Perlen jetzt an eine geeignete Konzentration Antikörper hinzufügen. Für eine gute HA oder Flag Antikörper für IP-CLOuD9 Konstrukte verwenden Antikörper bei 01:50 (µg Protein: µg Protein lysate) und inkubieren Sie zwischen 8 + h und über Nacht bei 4 ° C, während der Drehung. Alternativ 2-4 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Den überstand von Perlen entfernen und entsorgen.</li>
		<li>Wash Perlen 3 X mit der Waschpuffer.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie in einem minimalen Volumen des Puffers für die Übernachtung Inkubation mit dem Antikörper (IP-Verdünnung oder RIPA Puffer) genutzt. Halten Sie Kälte bis mit Protein lysate kombiniert.</li>
	</ol></li>
	<li>Beschallen Chromatin<ol>
<li>Lösen Sie zuerst Zellen mit dem Zusatz von Schwellungen Puffer zu Zelle Pellets für 10 min auf Eis, schnippen Zellen alle paar Minuten absetzen zu verhindern. Hinweis: In der Regel 500 µL Puffer Schwellung ist hinzugefügt, um 25 Millionen Zellen und skaliert von dort, aber tun nicht Nutzung von weniger als 500 µL Puffer für < 25 Millionen Zellen.</li>
		<li>Dounce manuell im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn, 13 x jeweils.</li>
		<li>Spin-Kerne, bei 4 ° C für 5 min bei 1.500 x g. überstand vollständig abzusaugen und wiederholen, um verbleibende Überstand entfernen dann wiegen die Zelle Pellet in mg.</li>
		<li>Kerne Lyse Puffer Protease-Inhibitor hinzufügen (Farnham Puffer oder RIPA Puffer oben, wählen Sie eine).</li>
		<li>Gebeizte Kerne zu Aufschwemmen 10 X Anzahl der Kerne Lyse Puffer hinzufügen (z. B. hinzufügen 1 mL der Kerne Lyse Puffer ein 0,100 g Granulat). Kurz Wirbel und lösen Sie für 10 min auf Eis. Hinweis: Denken Sie daran die Größe des Rohres Beschallung. Ideale Lautstärke ist oft < 1 mL, so Proben müssen aufgeteilt werden, wenn Pellets sehr groß sind.<ol>
<li>Beschallen Sie für Co-IP Kerne kurz zu solubilisieren Material und stillen SDS auf ein Niveau, das Immunopräzipitation mit 2-3 Bände der Verdünnungspuffer erlaubt, dann fahren Sie mit Schritt 7.4.6. Fügen Sie für sehr empfindliche Antikörper mehr Verdünnungspuffer zur weiteren Reduzierung die Konzentration von SDS hinzu. Hinweis: Stop Beschallung bei lysate löscht; Es ändert sich von einer opak/transluzent weiß, völlig transparent. Proben so kühl wie möglich halten und nicht über beschallen.</li>
			<li>Für ChIP gründlich Beschallen Sie DNA 150-1000 bp DNA-Fragmente zu, dann fahren Sie mit Schritt 7.4.6.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ausgliederung von unlöslichen Material mit maximaler Geschwindigkeit für 10 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Übertragen Sie lösliche Material auf einem frischen Rohr.</li>
		<li>Messen Sie für Co-IP die Konzentration des Proteins und fahren Sie mit dem Pulldown in Schritt 7,5.</li>
		<li>Für ChIP, Entfernen einer 10 µL Aliquot der lysate gelöscht, und fügen Sie 40 µL IP-Elution Buffer und 6 µL 5 M NaCl, für eine Gesamtmenge von 56ul. Kochen Sie für 15 min bei 95 ° C, 5-10 µL 3 M NaOAc pH 5 hinzufügen und Aufräumen auf einer PCR-Reinigung-Spalte. Messen die Konzentration von DNA durch die Messung der Absorption bei 260 nm und über Proben zu standardisieren. Fahren Sie dann mit Pulldown in Schritt 7,5. Hinweis: Extra lysate Snap bei-80 ° C eingefroren und verwendet werden kann zu einem späteren Zeitpunkt, aber die besten Ergebnisse aus den frischen lysate. Wenn das Einfrieren, nicht Einfrieren/Auftauen lysate mehr als einmal.</li>
	</ol></li>
	<li>Pulldown<ol>
<li>Übertragen Sie eine entsprechende Menge an Protein lysate auf ein frisches Rohr. Verdünnen Sie Farnham Lyse Puffer verwenden, 2,1 Mengen an IP-Verdünnungspuffer (siehe oben).</li>
		<li>100 µL des Überstandes für Eingabesteuerelement beiseite, und bis zum nächsten Tag bei 4 ° C lagern.</li>
		<li>Perle/Antikörper Konjugat aus Schritt 7.3.8 Proben jetzt hinzufügen.</li>
		<li>Drehen Sie Proben bei 4 ° C über Nacht und sicherzustellen Sie, dass genügend Volumen für flüssige Bewegung in 1,5 mL-Tuben.</li>
	</ol></li>
	<li>Waschen und eluieren<ol>
<li>Nach der Übernachtung Drehung speichern Sie überstand als unverbindliche Bruchteil. Dann Perlen Waschen 3-5 X in Verdünnungspuffer IP.</li>
		<li>IP-Elution Puffer bei Raumtemperatur ohne Inhibitoren vorzubereiten.</li>
		<li>Eluieren komplexe mit 50 µL Elution Buffer auf einen Wirbel bei 67 ° C für 15 min. Transfer Elution zu einem neuen Schlauch erschüttert und wiederholen Sie dies mit einem anderen 50 µL. kombinieren sie beide für eine insgesamt 100 µL Elution. Hinweis: Wenn es zu viel Hintergrund von diesem Elution Verfahren gibt, Hitze verringert oder beseitigt während schütteln/Inkubation. Dies verringert den Ertrag des Zielproteins in der Regel aber verringert deutlich den Hintergrund.</li>
	</ol></li>
	<li>Reverse Querverbindungen durch Erhitzen bei 67 ° C > 4 h. Hinweis: Dies ist nicht unbedingt notwendig für Co IPs aber kann hilfreich sein.<ol>
<li>Führen Sie für Co-IP volle Dimerisierung zwischen den Zielen des Interesses, um sicherzustellen Eluate auf einem SDS-Page Gel und Sonde mit Antikörpern gegen den HA-Tag oder Tag der Flagge, wie angegeben, auf 1: 1.000. Fahren Sie mit Schritt 8.</li>
		<li>Für ChIP-qPCR um korrekte Lokalisierung und Ausrichtung der einzelnen CRISPR-dCas9 Komponenten zu gewährleisten, reinigen Sie Elution Produkt auf einer Säule und eluieren in 10 µL. Perform in Echtzeit quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) gereinigte DNA. Primer verwendet in den dargestellten Daten stehen in ergänzenden Tabelle1. Fahren Sie mit Schritt 8.</li>
	</ol></li>
</ol>(8) RNA-Extraktion und Quantitative PCR
<ol><li>Um die CLOuD9-induzierten Veränderungen in der Genexpression zu untersuchen, zunächst zu isolieren und Gesamt-RNS von Kontrolle Zelle Pellets und dimerized Zelle Pellets zu reinigen.</li>
	<li>Komplementäre DNA (cDNA) aus der gereinigten RNA durch reverse Transkription17 machen und qPCR Analysen durchzuführen. Primer sind in ergänzenden Tabelle1zur Verfügung.</li>
</ol>9. Chromosom Konformation Capture-Assay
<ol><li>Änderungen in der Häufigkeit der genomic Loci Kontakte induziert durch CLOuD9 beobachten, Chromosom Konformation erfassen (3C) führen zu Proben8.</li>
	<li>3C Ligatur Produkte in zwei Sätzen von Duplikaten für jede der drei biologische Wiederholungen durch quantitative Real-Time PCR zu quantifizieren. Normalisieren Sie Proben auf die 3C-Signale von den Tubulin-Locus. Primer sind in ergänzenden Tabelle1zur Verfügung.</li>
</ol>

<ol><li>Krivega, I., Dean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+looping+as+a+target+for+altering+erythroid+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromatin looping as a target for altering erythroid gene expression.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1368, 31-39 (2016).</li>
<li>Matharu, N., Ahituv, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+loops+in+major+folds%3A+Enhancer-promoter+looping%2C+chromatin+restructuring%2C+and+their+association+with+transcriptional+regulation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Minor loops in major folds: Enhancer-promoter looping, chromatin restructuring, and their association with transcriptional regulation and disease.</a> PLoS Genet. 11, e1005640(2015).</li>
<li>Dekker, J., Martí-Renom, M. A., Mirny, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+three-dimensional+organization+of+genomes%3A+interpreting+chromatin+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data.</a> Nat. Rev Genet. 14, 390-403 (2013).</li>
<li>Kim, A., Dean, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22610406">Chromatin loop formation in the b-globin locus and its role in globin gene transcription.</a> Mol Cells. 34, 1-5 (2012).</li>
<li>Petrascheck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+looping+induced+by+a+transcriptional+enhancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3743-3750 (2005).</li>
<li>Ameres, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+DNA-loop+formation+blocks+transcriptional+activation+by+an+SV40+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer.</a> EMBO J. 24, 358-367 (2005).</li>
<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Long-Range+Genomic+Interactions+at+a+Native+Locus+by+Targeted+Tethering+of+a+Looping+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Controlling Long-Range Genomic Interactions at a Native Locus by Targeted Tethering of a Looping Factor.</a> Cell. 149, 1233-1244 (2012).</li>
<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+developmentally+silenced+globin+genes+by+forced+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping.</a> Cell. 158, 849-860 (2014).</li>
<li>Morgan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+Nuclear+Architecture+through+CRISPR-Mediated+Chromosomal+Looping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Manipulation of Nuclear Architecture through CRISPR-Mediated Chromosomal Looping.</a> Nature Communications. 8, 13 July (2017).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17 (1), 148(2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Lipofectamine+2000+Reagent%22">Lipofectamine 2000 Reagent</a>. , Invitrogen by Life Technologies. (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22DNeasy+Blood+%26+Tissue+Kit+Handbook%22">DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook</a>. , QIAGEN. (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Determining+Genome+Targeting+Efficiency+using+T7+Endonuclase+I+%28M0302%29%22">Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclase I (M0302)</a>. , New England BioLabs. (2016).</li>
<li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol Biol. 649, 247-256 (2010).</li>
<li>Shalem, O., Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. , 83-87 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNeasy+Mini+Handbook%22">RNeasy Mini Handbook</a>. , QIAGEN. (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+VILO+cDNA+Synthesis+Product+Information+Sheet%22">SuperScript VILO cDNA Synthesis Product Information Sheet</a>. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2015).</li>
<li>Theunissen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+culture+conditions+for+induction+and+maintenance+of+naive+human+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 15, 471-487 (2014).</li>
<li>Mokry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genome-wide+analysis+of+transcription+factor+occupancy%2C+RNA+polymerase+II+binding+and+steady+state+RNA+levels+identify+differentially+regulated+functional+gene+classes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Integrated genome-wide analysis of transcription factor occupancy, RNA polymerase II binding and steady state RNA levels identify differentially regulated functional gene classes.</a> Nucleic Acids Res. 40, 148-158 (2012).</li>
<li>Drier, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oncogenic+MYB+feedback+loop+drives+alternate+cell+fates+in+adenoid+cystic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">An oncogenic MYB feedback loop drives alternate cell fates in adenoid cystic carcinoma.</a> Nat Genet. 48, 265-272 (2016).</li>
<li>Ryan, R. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+enhancer-associated+rearrangements+reveals+mechanisms+of+oncogene+dysregulation+in+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma.</a> Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).</li>
<li>Montavon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+archipelago+controls+Hox+genes+transcription+in+digits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits.</a> Cell. 147, 1132-1145 (2011).</li>
<li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

The Most wichtige Schritte im CLOuD9 Chromatin Schleifen sind: (1) entwerfen oder mit Hilfe der richtigen gRNAs, 2) wechselnde Medien täglich auf CLOuD9 ausgestrahlt Zellen, einschließlich ABA oder DMSO, 3) Erhaltung der Frische der ABA, und (4) genaue und sorgfältige Beurteilung der Durchführung Chromatin-Konformation.
Die Grenzen der CLOuD9 befinden sich hauptsächlich in der Fähigkeit, Leitfäden für die Zielregion der Wahl zu gestalten. Guide-RNAs führen die wichtige Aufgabe der Lokalisierung der dCas9 Komponenten DNA Zielregionen zu dimerized werden und die Wirksamkeit der Guides basieren auf ihre spezifischen Ziel-Site. Ohne die richtige gRNA Komponenten induziert die CLOuD9 System nicht reversibel bilden können Schleifen. So wird durch mehrere Hilfslinien für die einzelnen Regionen von Interesse Gestaltung und Verbreitung der Führer über einen Bereich von 250-1000 bp, mindestens eine erfolgreiche Führer sichergestellt werden. Leitfaden-Lage ist auch integraler Bestandteil der genaue Ergebnisse. Es ist wichtig zu vermeiden, Führungen befindet sich in Transkription Faktor Bindungsstellen oder anderen kritischen Regionen um Hintergrundeffekte wie oben oder down-Regulation der Transkription zu verhindern. Darüber hinaus kann die genaue Lage des Konstrukts CLOuD9 leicht Transkription des Zielgens auswirken. Dies unterstreicht die Bedeutung des Tests mehrere Paare von Leitfäden für jedes Zielgebiet, das robusteste paar um zu Versuchszwecken zu identifizieren. Darüber hinaus in jedem Paar Zielregionen, das CSA-Konstrukt sollte mit gRNAs für S. Aureusgezielt und das CSP-Konstrukt sollte mit gRNAs für S. Pyogenes für targeting Spezifität ausgerichtet sein.
Um genaue Ergebnisse und korrekte Dimerisierung zu gewährleisten, ist es auch wichtig, die Frische der zellulären Umgebungen nach der Transduktion der CLOuD9 Konstrukte zu erhalten. Tägliche Medienwechsel und die Zugabe von frischen Dimerizer (oder Control) sorgt dafür, dass die komplementäre Konstrukte in der Nähe bleiben und die veränderten Chromatin-Konformation bewahren. Darüber hinaus ist es wichtig, authentische Resultate, garantieren die ABA ist frisch und entsprechend nach den Hersteller-Protokoll (eröffnet innerhalb von 6 Monaten, kalt, lichtgeschützt aufbewahrt) gespeichert wurden.
Insbesondere wurde ABA Dimerizer für CLOuD9 mit ABI und PYL Dimerisierung Proteine verwendet, anstatt mehr allgemein FRB und FKBP-System genutzt. Die Notwendigkeit einer Rapalog für die FRB/FKBP-System würde die Anwendbarkeit der CLOuD9, wegen der Giftigkeit zu Krebszellen beschränkt haben. Das Alternativsystem ABI/PYL umgangen diese Einschränkung, effektiv ermöglicht CLOuD9 breiter nutzbar sein.
Gemeinsam entwickelten wir CLOuD9, eine einzigartige und robuste Technologie, die gewaltsam können aber reversibel schaffen Kontakte zwischen langfristigen Ziel genomic Loci. Durch Induktion Chromatin Schleifen, zeigen wir auch, dass CLOuD9 genutzt werden können, um gen-Expression in den entsprechenden zellulären Kontext ändern. Die Anpassungsfähigkeit der Technologie ermöglicht die uneingeschränkte Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen jeden zwei genomic Loci, ohne Vorkenntnisse in der Schleife Regionen oder looping Mechanismen. CLOuD9 einzigartige nachgewiesene Reversibilität ermöglicht darüber hinaus weitere Untersuchung der Schleifen Mechanismen in Krankheit und Entwicklung. Während die zielgenaue Auswirkungen von Chromatin looping eindeutig nachgewiesen wurden, ist noch Daten bietet Einblick in die Auswirkungen der Ziel-looping und die weiteren Auswirkungen auf die Schlaufen am Ziel zu sein.
Unsere Daten nur wenige Anwendungen dieses Tool zeigt aber impliziert die große zugrunde liegende Idee, dass Chromatin Anordnung der Genexpression bezeichnend ist. Unsere Technologie kann verwendet werden, um zu studieren und die Nuancen der Chromatinstruktur in Genregulation und verbessert das allgemeine Verständnis der Rolle des Chromatins Falten in der Transkription von Genen zu offenbaren. Ein besseres Verständnis für die Feinheiten der transkriptionellen Dynamik kann eine Vorreiterrolle in der Forschung und Behandlung von Krebs, Erbkrankheiten und angeborene Erkrankungen, in denen verschiedene, die Chromatin Assembly zweifellos Gen Ausdruck20verändert, 21,22,23. Folgearbeiten CLOuD9 Technologie beleuchten weitere Details über die Anordnung und die Dynamik von Chromatin Domains und wie sie fahren Falten zu stabilen Genexpression in Entwicklung und Krankheit aufrecht zu erhalten.

Die Beziehung zwischen Chromatin Falten in den Zellkern und die spezifische Organisation des Genoms hat großes Interesse in den letzten Jahren sammelte, wie sich gezeigt hat, eng verbunden mit der Gen-Expression-1,-2sein. Während die genaue Beziehung zwischen Genaktivität und Modulation der Chromatinstruktur unklar bleibt, hat wurde vermutet, dass die Wechselwirkungen zwischen chromosomalen Kontakte durch dynamische dreidimensionale Chromatin Organisation dienen ein gen regulatorische Funktion3. In der Tat, solche Wirkung auch auf die menschliche Globin-gen-Locus, nachgewiesen wo der Locus Kontrollregion (LCR) die Aktivität der Globin-Gene Entwicklungsgeschichtlich gezielt reguliert durch die Schaffung einer Chromatin-Schleife zwischen den beiden Regionen4. Jedoch in dieser und anderen Regionen ist es unklar, ob eine Ursache oder Folge von Veränderungen in der Genexpression Chromatin looping ist.
Bis jetzt blieb die Herausforderungen bei der Untersuchung dieses Phänomens. Andere Versuche zur Induktion Chromatin Schleifen beteiligt z. B. Veränderung der linearen DNA-Sequenz oder komplizierte Verfahren erfordern eine Fülle von Hintergrundwissen über bestimmte Elemente, die Schleife5,6zu erleichtern, 7,8. Während bisherige Arbeit hat vorgeschlagen, dass das Chromatin Fahrt gen-Expression in eine spezifische und eingeschränkten Rahmen7,Schleifen ist8, das Niveau an welchem Chromatin looping Transkription Global wirkt sich darüber hinaus ungewiss. Obwohl Interesse an die Auswirkungen der Langstrecken Schleifen auf die Genexpression in den letzten Jahren kontinuierlich gewachsen ist, bestehen unbeantwortete Fragen über den Aufbau und die Beibehaltung von Chromatin Kontakte Genaktivität ändern.
Die Technologie, die wir entwickelt haben beschäftigt die Nuklease mangelhaft gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) - CRISPR - associated Protein 9 (dCas9), um alle genomic Loci9breit anwendbar gezielt zu ermöglichen. Diese Technologie eliminiert die komplexen Fragen im Zusammenhang mit Änderungen der linearen DNA-Sequenz und ist ohne wesentliche Vorkenntnisse bestimmter Schleife Komponenten zu erreichen. Vor allem ist das Tool universal und breit anwendbar auf Chromatin Loops in Entwicklung sowie in einer Vielzahl von Krankheiten, wie Krebs erkannt. Die Macht der CLOuD9 belegen reversibel verändern die Struktur der Schleifen Genexpression effektiv zu modulieren.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp; Medien</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>Für K562 Zellkultur-DMEM-Medien</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1X, für 293T Zellkultur</td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2</td><td>Addgene Plasmid</td><td>#52961</td><td>Für die Entwicklung von CLOuD9-Plasmiden</td></tr>: <tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene Plasmid</td><td>#12253</td><td>Für die Lentivirus-Produktion</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12259</td><td>Für die Lentivirus-Produktion</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12251</td><td>Für die Lentivirus-Produktion</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668-019</td><td>Für die Lentivirus-Produktion</td></tr><tr><td>anti-HA-Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>3724</td><td>Für Immunpräzipitation</td></tr><tr><td>anti-Flag-Antikörper</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>Für Immunpräzipitation</td></tr><tr><td>DNeasy Blut- und Gewebe-Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Für die DNA-Extraktion</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td><td>Für die RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>RNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Für die RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Hochgestellt VILO</td><td>Life Technologies</td><td>11754-050</td><td>Für cDNA&nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR Green I MasterMix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>Für die qPCR-Analyse</td></tr><tr><td>Light Cycler 480II</td><td>Roche</td><td></td><td>Für die qPCR-Analyse</td></tr><tr><td>Anti-H3K4me3-Antikörper</td><td>AbCam</td><td>ab8580</td><td>Für ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>anti-RNA Pol-II-Antikörper</td><td>Aktives Motiv</td><td>61083</td><td>Für ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>EDTA-freier Proteaseinhibitor</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Für Protein Extraktion</td></tr><tr><td>4-12% Tris Glycin Gel</td><td>Biorad</td><td></td><td>Jede Größe, Für Western Blot</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen HRP Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2030</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>Anti-Maus HRP Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>7076S</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>K562 und H3K293 ChIP-Seq Daten</td><td>Kodierung</td><td>ENCSR000AKU</td><td>Für ChIP-seq Analyse</td></tr><tr><td>K562 und H3K293 ChIP-Seq Daten</td><td>Kodierung</td><td>ENCSR000APE</td><td>Für die ChIP-seq-Analyse</td></tr><tr><td>K562 und H3K293 ChIP-Seq-Daten</td><td>Kodierung</td><td>ENCSR000FCJ</td><td>Für ChIP-seq-Analyse</td></tr><tr><td>K562 und H3K293 ChIP-Seq-Daten</td><td>GEO</td><td>GSM1479215</td><td>Für ChIP-seq-Analyse</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A für Immunpräzipitation</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td>Für Immunpräzipitation</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G für Immunpräzipitation</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10004D</td><td>Für Immunpräzipitation</td></tr><tr><td>RNA Clean & & Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>Für die RNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Durchstechen Sie 16 % Formaldehyd Methanolfrei</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Für die Vernetzung</td></tr><tr><td>PX458 Plasmid</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>Empfohlenes aktives Cas9-Plasmid für die gRNA-Klonierung, aber jedes aktive Cas9-Plasmid reicht aus</td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Für die PCR-Reinigung</td></tr><tr><td>FastDigest BsmBI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0454</td><td>Für die Klonierung von Guide-RNAs</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EF0651</td><td>Für die Klonierung von Guide-RNAs</td></tr><tr><td>10X FastDigest Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B64</td><td>Für die Klonierung von Guide-RNAs</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen</td><td></td><td>28704</td><td>Für die Klonierung von Guide-RNAs</td></tr><tr><td>10X T4 Ligation Buffer</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>Für die Klonierung von Guide-RNAs</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Für die Klonierung von Guide-RNAs</td></tr><tr><td>2X Quick Ligase Buffer</td><td>NEB</td><td>B2200S</td><td>Für die Klonierung von Guide-RNAs</td></tr><tr><td>Quick Ligase</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td>Für die Klonierung von Guide-RNAs</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Farnham Lysepuffer</td><td></td><td></td><td>1 % Tris-Cl pH 8,0, 1 % SDS, 1 % Proteasehemmer-Wasserlösung (ohne EDTA) und 1 mM EDTA in Wasser</td></tr><tr><td>Modifizierter RIPA-Puffer</td><td></td><td></td><td>1 % NP40/Igepal, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS, 1 mM EDTA und 1 % Proteasehemmer-Wasserlösung (ohne EDTA) in PBS pH 7,8 oder 7,4 IP-Verdünnungspuffer</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>0,01 % SDS, 1,1 % Triton-X 100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl pH 8,0, 167 mM NaCl, 0,1x Proteaseinhibitor</td></tr><tr><td>Waschpuffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1 % NP-40 und 1 % Natriumdesoxycholat</td></tr><tr><td>Quellpuffer</td><td></td><td></td><td>0,1 M Tris pH 7,5, 10 mM Kaliumacetat, 15 mM Magnesiumacetat, 1 % NP-40</td></tr><tr><td>Verdünnungspuffer</td><td></td><td></td><td>0,01 % SDS, 1,1 % Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris pH 8 und 167 mM NaCl</td></tr><tr><td>IP-Elutionspuffer</td><td></td><td></td><td>1% SDS, 10% NaHCO3 &nbsp;</td></tr></tbody></table>

crispr-vermittelten reorganisation der chromatinstruktur mit schleife

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Jüngste Studien haben deutlich gezeigt, dass Langstrecken, dreidimensionale Chromatin looping Interaktionen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression, aber ob die Schleife für verantwortlich ist oder ein Ergebnis von Veränderungen in der Genexpression nach wie vor ist unbekannt. Bis vor kurzem wie Chromatin Schleifen die Regulierung der Genaktivität und zelluläre Funktion beeinflusst wurde relativ unklar und Einschränkungen in vorhandenen Methoden, diese Strukturen zu manipulieren verhindert eingehende Erforschung dieser Interaktionen. Um diese Unsicherheit zu beseitigen, wir entwickelten eine Methode für die selektive und reversible Chromatin Schleife Re-Organisation mit CRISPR-dCas9 (CLOuD9). Die Dynamik des Systems CLOuD9 wurde durch erfolgreiche Lokalisierung von CLOuD9 Konstrukte genomic Loci um lokale Chromatin Konformation modulieren Ziel nachgewiesen. Wichtig ist, ist die Fähigkeit zum Umkehren des induzierten Kontakts und Wiederherstellen der endogenen Chromatin-Konformation auch bestätigt worden. Modulation der Genexpression mit dieser Methode stellt die Fähigkeit zur zellulären Genexpression regulieren und unterstreicht das große Potenzial für Anwendungen dieser Technologie bei der Schaffung stabiler de Novo Chromatin-Schleifen, die deutlich gen beeinflussen Ausdruck im Kontext von Krebs und Entwicklung.

Chromatin looping spielt eine bedeutende Rolle in der Genregulation; Allerdings gab es keine technologische Fortschritte, die eine selektive und reversible Änderung des Chromatins Schleifen ermöglichen. Hier beschreiben wir ein leistungsfähiges System für Chromatin Schleife Reorganisation Loci gezielt mit CRISPR-dCas9 (CLOuD9) gezeigt, um selektiv und reversibel Genexpression zu modulieren.

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Diese Methode könnte uns helfen, schlüsselrelevante Fragen im Zusammenhang mit der Genexpression zu beantworten, die uns genau zeigen, wie sich die Chromatinstruktur auf die Genexpression auswirkt und wie die Chromatinorganisation die Transkriptionsdynamik reguliert. Wir haben diese Technologie entwickelt, weil wir in der Lage sein wollten, die chromosomale Architektur steuern zu können, um die Erstellung von Langstrecken-Chromatin-Looping zu ermöglichen. Während zur gleichen Zeit haben die Fähigkeit, den Chromatin-Kontext umzukehren, um die endogene chromosomale Struktur wiederherzustellen.Diese Methode wurde für benutzerfreundlichkeit und breite Anwendbarkeit entwickelt. Wir nutzten einen ungiftigen Dimerizer sowie orthogonale Arten von dcas9, um eine breitere Nutzung des Systems zu ermöglichen. Wir haben diese Methode entwickelt, weil wir in der Lage sein wollten, die langjährige Hähnchen-und-die-Ei-Frage zu beantworten, ob Genexpression Chromosomenarchitektur bewirkt oder ob Chromosomenstruktur zu Veränderungen in der Genexpression führt.Die Gestaltung der CRISPR-Guide-RNA-Sequenzen und die Aufrechterhaltung der Zellkulturen sind im Textprotokoll beschrieben. Plasmidkarten und die verwendeten Primer sind dort aufgeführt. Beginnen Sie die Plasmidpräparation, indem Sie fünf Mikrogramm des lentiviralen CRISPR-Plasmids mit drei Mikrolitern BsmB1 drei Mikroliter alkalischer Phosphatase sechs Mikroliter 10-fachen Verdauungspuffer und 0,6 Mikroliter frisch zubereiteter 100 Millimolar DTT-Plasmation mischen.Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 60 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser und brüten Sie das Gemisch 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um das Plasmid zu verdauen und zu dephosphorylieren. Dann reinigt Gel das verdaute Plasmid im Schleifenplasmid und doppelt destilliertem Wasser. Als nächstes bereiten Sie Glühreaktionen für die Guide-RNA-Paare vor.Kombinieren Sie einen Mikroliter jeder Führungs-RNA bei 100 Mikromolaren mit einem Mikroliter 10x T4 Ligationspuffer 6,5 Mikroliter doppeldestilliertes Wasser und 0,5 Mikroliter T4 PNK für ein Gesamtreaktionsvolumen von 10 Mikrolitern. Um die Guide-RNA-Paare zu ihren Zielsequenzen zu begleiten, inkubieren die Mischungen bei 37 Grad Celsius bei 30 Minuten, gefolgt von einer Inkubation bei 95 Grad Celsius für 5 Minuten, dann die Temperatur schrittweise auf 25 Grad Celsius, indem sie sie um fünf Grad Celsius pro Minute verringert. Als nächstes verdünnen Sie die geglühten Führungs-RNAs bei ein bis zweihundert in doppelt destilliertem Wasser.Bereiten Sie nun die beiden Ligationsreaktionen vor. Mischen Sie einen Mikroliter des verdauten Plasmids mit 0,5 Mikrolitern eines verdünnten Perivaneal-Guides RNAse 2,5 Mikroliter 2x Ligationspuffer einen Mikroliter doppelt destilliertes Wasser und 0,5 Mikroliter Ligase. Inkubieren Sie die Reaktionen bei Raumtemperatur für 10 Minuten, um die Führungen BsmB1 verdauten Plasmid zu ligte.Verwandeln Sie dann das neu ligierte Plasmid in stabile drei Bakterien und verstärken Sie die Bakterien mit jeder Plasmid-Vorbereitungsmethode. Auf einer Sechs-Brunnen-Platte, pro Brunnen, Samen 750, 000 2n3 Tcells in DMEM mit 10%FBS und 1%pen Strep. Verwenden Sie einen Brunnen für jedes Konstrukt und inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden.Am nächsten Tag das Medium auf frisches Antibiotika-Freies-DMEM mit 10%FBS umstellen. Gleich nach dem Wechsel des Mediums für jeden Brunnen der plattierten Zellen bereiten eine Röhre der Lentivirus-Produktionsmischung. Pro Reaktion 11 Mikroliter Lipid-Basis-Transfektionsreagenz mit 150 Mikrolitern des Opti-MEM-Mediums für jede Reaktion verdünnen.Dann in separaten Röhren bereiten sie die DNA vor. Kombinieren Sie zwei Mikrogramm des LENTiviralen Vektorplasmids CLOud9 mit zwei Mikrogramm der anderen lentiviralen Verpackungskomponenten. Verdünnen Sie diese Mischung in 150 Mikroliter des Opti-MEM Mediums.Dann die gleichen Volumina des verdünnten lentiviralen Plasmidgemisches im verdünnten lipidbasierten Transfektionsreagenz kombinieren und die Mischungen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Dann zu jedem Brunnen der Zellen fügen Sie eine Röhre der vorbereiteten Mischungen und setzen Sie die Inkubation. 48 Stunden später die viralen Produktionsmedien aus den Plattenbrunnen in Konische übertragen und fünf Minuten lang bei 300 g nach unten drehen.Dann den Überstand auf frische Schläuche übertragen, um die pelletierten Trümmer zu entsorgen. Verwenden Sie nun sofort die viralen Produktionsmedien, um die Zielzellen zu transduzieren oder sie bei 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung einzufrieren. Beginnen Sie mit der Zugabe von 250 Mikrolitern jedes viralen Konstrukts von Interesse, das in diesem Fall aus komplementären CLOud9-Plasmiden zu einem 50 Milliliter konischen Rohr mit 80.000 Zellen besteht.Fügen Sie dann genügend Polybren hinzu, so dass es zwischen einem und acht Mikrogramm pro Milliliter in Lösung liegt. Dann stellen Sie das Gesamtvolumen in jeder Röhre auf einen Milliliter mit antibiotikafreien Medien ein. Um nun den Kontakt zwischen den Viruspartikeln und den Zellen zu erhöhen, drehen die Zellen bei Raumtemperatur 30 Minuten lang bei 800 g.Dann setzen Sie die Zellen am Überstand durch Pipettieren wieder auf. Als nächstes laden Sie die Zellsuspension auf Kulturplatten und inkubieren sie für 24 Stunden. Sammeln Sie am nächsten Tag die Zellen.Zentrifugieren Sie sie bei 300 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur und hängen Sie sie im normalen Medium wieder auf. Am nächsten Tag, fügen Sie Puromycin und Hygromycin auf das Medium, um für doppelt transduced Zellen zu wählen. Die entsprechende Konzentration von Antibiotika sollte im Voraus für jeden Zelltyp bestimmt werden.Inkubieren Sie dann die Zellen im Auswahlmedium mindestens drei Tage lang, bevor Sie mit nachgelagerten Anwendungen fortfahren, und halten Sie die Zellen und Auswahlmedien aufrecht. Um die ausgewählten und transduzierten CLOud9-Zellen zu verdqueren, fügen Sie dem Kulturgericht eine Millimolar-ABA hinzu. Fügen Sie für Steuerelemente DMSO hinzu, und verwalten Sie dann die Zellen mit ABA oder DMSO für die Dauer des Experiments.Um die Dimerisierung umzukehren, waschen Sie die Zellen mit genügend PBS, um die Oberfläche der Platte zweimal zu bedecken. Danach, Kulturzellen in ABA-freien Medien, um sie in einem undimerisierten Zustand zu halten. Die angemessene Verwendung des CLOud9-Systems induziert einen reversiblen Kontakt der komplementären CSA- und CSP CLOud9-Konstrukte durch das Hinzufügen oder Entfernen von ABA zu Zellkulturmedien.Die CSA- und CSP-Konstrukte werden mithilfe von STANDARD-CRISPR-Führungs-RNAse in geeignete genomische Regionen lokalisiert. Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von quantitativer PCR wurde verwendet, um die genaue Lokalisierung bei der Ausrichtung jeder CLOud9-Komponente zu gewährleisten. Zusätzlich Koimmunpräzipation mit und ohne ABA verifiziertE CSA- und CSP-Dimerisierung in Gegenwart des Liganden sowie die Reversibilität in Abwesenheit des Ligands.Nach der ABA-Dimerisierung wurde ein größerer Kontakt zwischen Beta-Globin und dem LCR durch Chromosomenbestätigungsaufnahme gemessen. Dies wurde jedoch in den Steuerelementen, die nur die CSA oder nur das CSP-Konstrukt enthalten, nicht beachtet. Durch die Erstellung der LCR-Beta-Globin-Wechselwirkung wurde der endogene LCR-Globinkontakt nicht vollständig eliminiert.Es wurde nur dem ursprünglichen Kontakt hinzugefügt. Der Anstieg der Beta-Globin-LCR-Kontakte wurde durch 72 Stunden Dimerisierung beobachtet, unabhängig von der genauen Region innerhalb der zielgerichteten LCR oder der Beta-Globin-Promotorregion. Schließlich wurde die Reversibilität des Systems mit Chromosomenbestätigungsaufnahme nach Entfernung von ABA bestätigt.Dies führte zur vollständigen Erneuerung der endogenen Bestätigung. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, medienzuwechseln und täglich frische, gedämpfte CLOud9-Transduced-Zellen hinzuzufügen. Vergessen Sie nicht, die Arbeit mit Lentivirus kann extrem gefährlich sein und alle Vorsichtsmaßnahmen bei BSL 2 verwendet werden, sollte immer bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.

crispr-mediated-reorganization-of-chromatin-loop-structure

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Chromatin Interaction Analysis von Paired-End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) ist eine Methode...

Chromatin Interaction Analysis gepaart mit End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) zur Abbildung von Chromatin-Wechselwirkungen zu verstehen und Transkriptionsregulation

Verordnung der Chromatin-Umgebung ist ein wesentlicher Prozess erforderlich für die ordnungsgemäße Genexpression. Hier beschreiben wir eine Methode zur Steuerung der Genexpression durch die Rekrutierung von Chromatin-modifizierende Maschinen Gen-spezifischen und reversibel.

Gentranskription durch Umleiten zellulären Maschinerie mit chemischen epigenetische Modifikatoren zu unterdrücken

Gezielte DNA Epigenom Bearbeitung stellt eine leistungsstarke Therapieansatz. Dieses Protokoll beschreibt die Produktion, Reinigung und Konzentration der all-in-One Lentivirale Vektoren beherbergen das CRISPR-dCas9-DNMT3A Transgen für Epigenom-editing-Anwendungen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC)-Neuronen abgeleitet.

Lentivirale Vektor-Plattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-editing-Tools in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Krankheitsmodelle

Diese Methode wurde entwickelt, um der Bildung von PRC2-vermittelten Chromatindomänen in Zelllinien zu folgen, und die Methode kann an viele andere Systeme angepasst werden.

Eine Methode zur Untersuchung der de novo Bildung von Chromatin-Domänen

Das Genom ist im Kernraum in verschiedene Strukturen organisiert, die durch Chromosomenkonformationserfassungstechnologien aufgedeckt werden können. Die In-Nucleus-Hi-C-Methode liefert eine genomweite Sammlung von Chromatin-Interaktionen in Drosophila-Zelllinien, die Kontaktkarten generiert, die mit Megabasenauflösung auf Restriktionsfragmentebene untersucht werden können.

In-Nucleus Hi-C in Drosophila-Zellen

DNA-Vorhang, ein Hochdurchsatz-Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren, bietet eine Plattform für die Echtzeit-Visualisierung verschiedener Protein-DNA-Interaktionen. Das vorliegende Protokoll verwendet die DNA-Vorhangtechnik, um die biologische Rolle und den molekularen Mechanismus von Abo1 zu untersuchen, einer Schizosaccharomyces pombe Bromodomänen-haltigen AAA+ ATPase.

Entschlüsselung des molekularen Mechanismus der Histonassemblierung mittels DNA-Vorhangtechnik

Das Protokoll beschreibt Methoden zur CRISPR-basierten Epigenom-Editierung (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) in humanen Zelllinien unter Verwendung von Plasmid-DNA-Transfektion und mRNA-Nukleofektion.

CRISPR-Epigenom-Editierung in menschlichen Zellen mittels Plasmid-DNA-Transfektion und mRNA-Nukleofektion

Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.

Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern

DNA-Protein-Wechselwirkungen sind für mehrere biologische Prozesse essentiell. Bei der Auswertung von zellulären Funktionen ist die Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen unentbehrlich für das Verständnis der Genregulation. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist ein mächtiges Werkzeug, um solche Wechselwirkungen in vivo zu analysieren .

Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) unter Verwendung einer reifen Maus-T-Zelllinie. Dieses Protokoll ist geeignet, um die Verteilung von spezifischen Histonmarken an bestimmten Promotorstellen oder genomweiten zu untersuchen.

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien

Erfahren Sie die CRISPR-basierte CLOuD9-Methode zur reversiblen Reorganisation von Chromatinstrukturen und Modulation der Genexpression. Diese Technologie ermöglicht präzise Kontrolle über chromosomale Architektur und transkriptionelle Dynamik in verschiedenen Zelltypen.

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Weitere Videos entdecken