Name: Tief dermalen Injektion als ein Modell von Candida Albicans Infektion der Haut für histologische Analysen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Erfahren Sie die tiefe dermale Injektion von Candida albicans zur histologischen Analyse von Hautinfektionen. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der Immunzelllokalisierung bei intakter Hautarchitektur.

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FG ist durch Associazione Italiana per la Ricerca Sul Ariete (IG 2016Id.18842), Cariplo Foundation (Grant 2014-0655) und Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB) unterstützt. IZ stützt sich auf NIH Grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 Grant, Harvard Medizinische Schule Milton gefunden, EKFF Senior Research Award (412708), die Eleanor und Meilen Küste 50. Jahrestag-Fellowship-Programm, und die Cariplo Foundation ( 2014-0859).

Die Verfahren wurden alle unter den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt und unter der Aufsicht des Department of Animal Resources bei Kindern betrieben's Hospital (Bogen) am Krankenhaus Boston der Kinder oder wurden von den italienischen genehmigt Ministerium für Gesundheit und unter institutionellen Animal Care Committee der Universität Mailand-Bicocca durchgeführt.
1. C. Albicans Vorbereitung
<ol><li>Kultur C. Albicans, Stamm CAF3-113, in Röhrchen mit reichen Medium (Hefe-Extrakt Pepton Traubenzucker (YEPD), 1 % (w/V) Hefeextrakt, 2 % (w/V) von Bacto Pepton, 2 % (w/V) Glukose) ergänzt mit Uridin (50 mg/L) bei 25 ° C. Unter diesen Bedingungen wächst C. Albicans als eine Hefe. Hinweis: Andere C. Albicans -Stämme können verwendet werden, wie z. B. die klinische C. Albicans Stamm SC531413isolieren. Da wir vor kurzem gezeigt haben, dass die Colitis Prozess durch die Aktivierung des angeborenen Immunsystems14, theoretisch jede C. Albicans Belastung induziert wird, die ihre Zellwand-Komponenten und Struktur beibehält sowie die Fähigkeit, stammen von bodenaggregaten Projektionen genutzt werden.</li>
	<li>Überwachen Sie die Kultur durch die zelluläre Konzentration mit einer Zelle Zähler Analyzer zählen.</li>
	<li>Ernten Sie die Kultur, wenn es eine Konzentration von etwa 8 x 106 Zellen/mL erreicht. Alternativ können Sie ein Spektralphotometer um OD600zu messen. Hinweis: In der Regel einen Wert von OD600 = 1 entspricht einer Hefe-Konzentration von 3 x 107 Zellen/mL, Titration wird jedoch empfohlen.</li>
	<li>Aufschwemmen der Kulturkreis in YEPD-Uridin Medium, mit HEPES (50 mM, pH 7,5) als ein Puffer-Agent und inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C, Hyphen Bildung zu induzieren. Überprüfen Sie bodenaggregaten Bildung unter dem Mikroskop bei 100 X Vergrößerung. Bodenaggregaten Formation ist sichtbar 5 h nach Kultivierung bei 37 ° C; jedoch verwenden Sie die Zellen 16 h nach der Inkubation bei 37 ° C erreicht der bodenaggregaten Anteil fast 95 % der gesamten Kultur.</li>
	<li>Um die Vorbereitung in bodenaggregaten Konzentration weiter zu bereichern, Zentrifuge Aliquote der Kultur bei 3.300 x g für 5 min. überstand verwerfen und das Pellet in sterilen PBS in einer Konzentration von 1 x 108 Hyphen/mL Aufschwemmen.</li>
</ol>2. tief dermalen Injektion
<ol><li>24 h vor der Infektion-Verfahren, die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) zu betäuben und dann die Flanke der Mäuse mit einer elektrischen Haarschneidemaschine rasieren. Hinweis: Nach jedem Eingriff mit Narkose, legen Sie die Mäuse unter einer Wärmelampe bis sie effizient erholt haben.</li>
	<li>Ruhen Sie die Mäuse für 24 h, eine Entzündung durch die Rasur-Prozess zu vermeiden.</li>
	<li>24 h nach dem Eingriff rasieren zu betäuben die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg).</li>
	<li>Überprüfen Sie die Pfote Reflex um sicherzustellen, dass die Mäuse tief betäubt sind. Beurteilen Sie die Pfote Reflex fest Kneifen die Pfote. Wenn die Narkose erreicht ist, wird das Tier keine Schmerzen empfinden und bewegt sich nicht.</li>
	<li>Spritzen Sie C. Albicans hyphen in die Tiefe Derma mit einer 0,3 mL Insulin Spritze mit einer Nadel 30 x 8 mm in einem Endvolumen von 50 µL/Injektion, entspricht 5 x 106 Hyphen/Injektion.<ol>
<li>Ziehen Sie die Haut der rasierte Flanke straff mit zwei Fingern um die Lautstärke direkt in die Tiefe Derma zu injizieren. Stechen Sie die Nadel mit einem Winkel von 10-15° mit der schräge der Nadel nach oben.</li>
		<li>Mit diesem Winkel wird der Erreger mit einer Tiefe von etwa 300-500 µm injiziert werden. Um sicherzustellen, dass die Injektion gut ausgeführt wird, überprüfen Sie, dass das injizierte Volumen bildet eine Beule, die ist wenige Minuten nach der Injektion absorbiert. Hinweis: Die Beule gebildet nach die Injektion von ca. 1 cm2sein wird. Dies ist der Bereich, der zum festgelegten Zeitpunkt für Molekulare oder histologische Analyse entfernt wird.</li>
		<li>Markieren Sie für Zeitpunkte von weniger als 24 Stunden (empfohlen) den Bereich der Infektion mit einem Marker, da die Beule gebildet mit der Injektion für ein paar Minuten bleibt nach dem es absorbiert wird. Für Zeitpunkte von 24 h oder mehr ist dieser Schritt nicht erforderlich, da ein Geschwür oder eine Zyste deutlich sichtbar ist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Probieren Sie Sammlung und Aufbereitung für histologische Färbung
<ol><li>Die Mäuse nach institutionellen Verfahren einschläfern.</li>
	<li>Chirurgische Pinzette verwenden, ziehen Sie die Haut an der Grenze des Standortes injiziert, zuvor mit dem Filzstift markiert. Mit Chirurgische Schere, Verbrauchsteuern der infizierten Webseite durch Schneiden der Haut nach der markierten Zeile. Hinweis: Achten Sie darauf, die Haut von das Bauchfell mit Rundspitze Schere zu trennen.</li>
	<li>Tauchen Sie die Haut in einer Einweg-base Form gefüllt mit optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung, mit der Innenseite der Haut nach oben. Einfrieren der Probenmaterials in flüssigem Stickstoff, bis die Masse weiß wird. Nicht lassen Sie den flüssigen Stickstoff die Probe zu decken, bevor es vollständig gefroren ist, da dies die Probe beschädigen würde. Hinweis: Vorsicht! Während Schritt 3.3 tragen Sie einen Gesichtsschutz für Schutz von flüssigem Stickstoff.</li>
	<li>Wenn die Proben nicht sofort für die Vorbereitung der Folie verwendet werden, speichern sie schnell bei-80 ° C. Hinweis: Proben können bei-80 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Folien
<ol><li>Halbieren Sie die Probe vorzubereiten die Scheiben für Histologie, ausgehend von der Mitte der Probe.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einem Kryostat 5 µm dicke Scheiben. Hinweis: Für Hautproben, sollte die Temperatur des Kryostaten nicht höher als-25 ° c werden Eine höhere Temperatur würde dazu führen, ein partielles Schmelzen des H-OAT und daher die Proben nicht aufrechterhalten würden in der richtigen Position während der Schneidvorgang.</li>
	<li>Verwenden Sie positiv geladene Objektträger, um die Scheiben zu sammeln.</li>
	<li>Wenn die gesammelten Scheiben nicht bald nach der Zubereitung verwendet werden, bewahren Sie sie bei-20 ° C. An dieser Stelle können die Scheiben bei-20 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.</li>
</ol>5. Hämatoxylin und Eosin Färbung
<ol><li>Färben Sie den Folien durch Eintauchen in Gills Hämatoxylin für 4 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 5 min.</li>
	<li>Färben Sie den Folien durch Eintauchen in Eosin Y-Lösung für 1 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 5 min. Spülen die Folien mit destilliertem Wasser, bevor Sie fortfahren des Protokolls.</li>
	<li>Trocknen Sie durch Eintauchen in seriell steigenden Konzentrationen von Ethanol-Lösungen (50 %, 70 %, 80 %, 95 %, 100 % aus). Tauchen Sie die Folien für 15 s in jeder Ethanol-Lösung.</li>
	<li>Deaktivieren Sie die Folien für mindestens 2 min durch Eintauchen in eine histologische Clearing Agent.</li>
	<li>Montieren Sie die Folien mit Eindeckmittel und Deckel rutscht.</li>
	<li>Abrufen von Bildern von Dias mit einem Diascanner Mikroskop bei 40 X Vergrößerung.</li>
</ol>6. Perjodsäure-Schiff (PAS) Färbung
<ol><li>Befestigen Sie den Folien mit ≥99.5 % Aceton bei Raumtemperatur für 1 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 1 min.</li>
	<li>Färben Sie den Folien durch Eintauchen in Perjodsäure Lösung (1 g/dL) für 5 min. Waschen Folien in 3 Änderungen von destilliertem Wasser.</li>
	<li>Färben Sie den Folien durch Untertauchen im Schiff's Reagenz für 15 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 5 min.</li>
	<li>Die Folien durch Eintauchen in Gills Hämatoxylin zu beflecken, für 5 min. Waschen Sie die Folien in fließendem Leitungswasser für 30 s.</li>
	<li>Entwässern Sie die Folien durch Eintauchen in 3 Änderungen von 100 % Ethanol. Tauchen Sie die Folien für 15 s jedes Mal.</li>
	<li>Deaktivieren Sie die Folien für mindestens 2 min durch Eintauchen in eine histologische Clearing Agent.</li>
	<li>Montieren Sie die Folien mit Eindeckmittel und Deckel rutscht.</li>
	<li>Abrufen von Bildern der Folien mit einem Mikroskop-Dia-Scanner.</li>
</ol>7. Probieren Sie Sammlung und Aufbereitung für die RNA-Extraktion
<ol><li>Die Mäuse nach institutionellen Verfahren einschläfern. Die Hautproben wie in Schritt 3.2 zu entfernen.</li>
	<li>Tauchen Sie die Proben in einem 2 mL Snap-Cap Röhrchen mit 1 mL Reagenz für saure Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten und die Proben bei-80 ° c gelagert werden</li>
	<li>Schneiden Sie die Probe in Stücke von ca. 0,2 cm2 mit chirurgischer Pinzette. Hinweis: Vorsicht! Die meisten der Reagenzien zur RNA-Isolierung sind toxisch und mutagen. 7.3 und 7.4 Schritte müssen werden unter einem Abzug durchgeführt.</li>
	<li>Die Probe mit einem Rührwerksmühle mit einer Geschwindigkeit von 20 Schwingungen/s für 20 min. Alternativ zu zerschlagen, mechanische Töpfer kann verwendet werden.</li>
	<li>Überprüfen Sie die effektive Homogenisierung der Proben durch einen Blick auf das Vorhandensein von intakten Teile der Haut. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn die Proben nicht vollständig homogenisiert werden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 x g für 1 min. halten die Überstände für RNA-Extraktion und entsorgen Sie die Tablette. Dieser Schritt wird durchgeführt, um zu beseitigen, Haare und Schmutz, die die extraktionskolonnen blockieren könnten.</li>
	<li>Gehen Sie mit RNA-Extraktion mittels RNA Reinigung Spalten14.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um RNA-Reinigung und Konzentration zu beurteilen. Wenn RNA Extrakte für die cDNA-Vorbereitung nicht sofort verwendet werden, speichern Sie die Proben bei-80 ° C.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier haben wir eine Methode von C. Albicans -Infektion des entzündlichen Prozesses zu studieren, die auf Pilz Eingang in die Tiefe Derma initiiert wird.
Obwohl Haut Abszessbildung ein relativ seltenes Ereignis bei C. Albicans Infektion15 ist, Injektion des Pilzes direkt in die Tiefe Derma ermöglicht es, nicht nur das Studium der Pilz-driven Abszessbildung, sondern auch die Analyse der spezifischen Immunantwort Zellen, die teilnehmen, um Pilz Ausbreitun...

Der menschliche Körper ist mit einer extrem hohen Anzahl von Mikroorganismen bedeckt. Die Hautoberfläche ist der Lebensraum von fast 1 Million Bakterien pro Quadratzentimeter1. Diese Zahl spiegelt jedoch nicht die ganze Vielfalt der Mikroorganismen, die die Haut kolonisiert. Neben Bakterien ist der menschliche Körper kolonisiert durch viele Pilzarten, darunter C. Albicans, die in der Lage, sowohl auf die Schleimhaut und die Haut Ebene2überleben.
Der Anteil der Menschen mit der Diagnose mit Pilzinfektionen sind in den letzten Jahren enorm gestiegen. Dies ist vor allem aufgrund der höheren Anzahl von immungeschwächten Personen, d. h., HIV-positiven Patienten und Patienten, die entweder durch Chemotherapie oder Immunsuppressiva nach Transplantation3gegangen. In einer Überwachung Studie in den Vereinigten Staaten zeigten Wisplinghoff Et Al. , dass 9,5 % der Blutbahn Nosokomialinfektionen durch Candida Spezies4verursacht wurden. Durch das vermehrte Auftreten von Pilzinfektionen und vor allem wegen der erhöhten Anteil der Candida -Spezies bei Infektionen der Blutbahn gefunden wird verstehen, wie diese Erreger die Steuerung des Immunsystems entkommt extrem wichtig.
C. Albicans ist ein dimorphen Pilz, der in verschiedenen morphologischen Formen wie Hefe, Blastospores, Pseudohyphae und Hyphen abhängig von den Umgebungsbedingungen5wächst. In seiner bodenaggregaten Form C. Albicans zeigt seine höchste Kapazität der Invasivität und hat die Fähigkeit, das Epithel6durchdringen.
C. Albicans Infektionen sind mit mehreren experimentellen Ansätzen untersucht worden. Das häufigste Modell der Infektion ist die intravenöse Injektion von C. Albicans Hefe7. Jedoch wird dieses Modell nicht alle Prozesse, die passieren berücksichtigt bevor der Pilz schafft es in die Blutbahn zu verbreiten. Ein weiteres Modell nutzt die Fähigkeit von C. Albicans , das Epithel einzudringen. Diese Methode, auch bekannt als das Schleifpapier Model8, wurde von Gaspari Et Al. 19989entwickelt und besteht aus die Haut, wodurch das Stratum Corneum vor dem Auftragen von C. AlbicansSchleifen mit Schleifpapier. Dieses Verfahren ermöglicht den Pilz, das Epithel, so dass die Analyse der invasiven Fähigkeiten des Erregers zu durchdringen. Zu guter Letzt wurden andere Modelle von Infektionen für die Magen-Darm-10 und Atemwege11 in verschiedenen Studien verwendet.
Die Bildung einer Wunde (wie im Sand Papiermodell) bewirkt die Aktivierung von mehreren wegen, einschließlich Immunzelle Rekrutierung und Aktivierung, um den heilenden Prozess-12zu fördern. Dies kann entweder ändern oder maskieren der Immunantwort, die speziell gegen den Erreger, wodurch verwirrende Ergebnisse ausgelöst.
Hier beschreiben wir eine Methode der Infektion der Haut, die ursprüngliche Wunde Bildung vermeidet und die Induktion einer basalen entzündlichen Umgebung. Um die intakte epitheliale Struktur beizubehalten, injizieren wir direkt C. Albicans in seiner bodenaggregaten Form in die Tiefe Derma. Obwohl eine einzelne Injektion leichte Entzündung hervorrufen kann, ist die Menge der Entzündung begrenzt und eingeschränkt im Vergleich zur Bildung einer offenen Wunde wie Schleifpapier-Modell. Der Ansatz, den wir hier beschreiben ermöglicht die Untersuchung der Immunantwort auf Pilzinfektion und Ausbreitung die übermäßige und bereits vorhandene entzündliche Umwelt durch mechanische Beschädigungen zu vermeiden.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB4053L</td><td>warm in 37 & Grad; C-Bad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>H-OCT</td><td>Compound Histo-Line Laboratories</td><td>R0030</td><td></td></tr><tr><td>Gill's Hematoxilyn</td><td>Histo-Line Laboratories</td><td>09-178-2</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y-Lösung, alkoholische</td><td>Histo-Line Laboratories</td><td>09-209-05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>Scharlau</td><td>ET00232500</td><td></td></tr><tr><td>Citro-HISTOCLEAR</td><td>Histo-Line Laboratories</td><td>R0050</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt, Eindeckmedium</td><td>bio-optica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>sigma-aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>PAS Färbesystem</td><td>sigma-aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Pepton</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Hefeextrakt</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose wasserfrei für die Molekularbiologie</td><td>Applichem PanReac</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Uridin</td><td>Merck Millipore</td><td>8451</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Applichem PanReac</td><td>A1070,0500</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Röhrchen 2 mL</td><td>eppendorf</td><td>30121597</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>Giftig, ätzend und erbgutverändernd. Verwenden Sie alle erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>flüssiger Stickstoff</td><td></td><td></td><td>Tragen Sie Augenschutz</td></tr><tr><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coulter Counter-Particle Count</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415 R</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC 3000 Mikrotom-Kryostat</td><td>histo-line laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TissueLiser</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Materials0,3</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ml Insulinspritze mit einer 30G x 8mm Nadel&nbsp;</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Zange</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basisform</td><td>Einweg-histo-line Laboratorien</td><td>2781</td><td></td></tr><tr><td>Positiv geladene Biomikroskop-Objektträger</td><td>bio-optica</td><td>09-2000</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 24 x 50 mm</td><td>thermo scientific</td><td>11911998</td><td></td></tr></tbody></table>

tief dermalen injektion als ein modell von candida albicans infektion der haut für histologische analysen

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Die Haut ist ein extrem erweiterten Organ des Körpers, und durch diese große Oberfläche ist es kontinuierlich Mikroorganismen ausgesetzt. Hautschäden kann leicht zu Infektionen in der Dermis führen, was wiederum bei der Verbreitung von Krankheitserregern in die Blutbahn führen kann. Verstehen, wie das Immunsystem bekämpft Infektionen im sehr frühen Stadium und wie der Host die Erreger beseitigen kann, ist ein wichtiger Schritt um die Basis für zukünftige therapeutische Interventionen gesetzt. Hier beschreiben wir ein Modell der Candida Albicans -Infektion, die die Prozesse zu, die früh während einer Infektion visualisieren, auch wenn der Erreger ist die epitheliale Barriere sowie die Immunantwort ausgelöst durch die C. Albicans vergangen auftreten Invasion. Diese Infektionsmodell verwendet, histologische Analysen durchzuführen, die die Immunzellen zu zeigen, die die Haut sowie die Präsenz und die Lokalisation des Erregers zu infiltrieren. Proben gesammelt, nachdem die Infektion für die RNA-Extraktion verarbeitet werden kann.

Durch die Injektion des Krankheitserregers direkt in die Tiefe Derma bleibt die strukturelle Morphologie des Gewebes intakt (Abbildung 1A).
Die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Haut ermöglicht die Erkennung von Immunzellen und ihre Lokalisation am Ort der Infektion. Die höhere Vergrößerung dargestellt in Abbildung 1 b zeigt, dass der Abszess ist vor al...

Hier beschreiben wir ein Protokoll, histologische und molekulare Analyse von Hautproben nach Candida Albicans intradermale Injektion ermöglicht. Dieses Protokoll hält die strukturelle Integrität der Haut und erlaubt die Lokalisierung von Gewebe-Resident oder neu rekrutierten Immunzellen sowie die Verteilung der Erreger.

Tief dermalen Injektion als ein Modell von Candida Albicans Infektion der Haut für histologische Analysen

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Aktivierung des Immunsystems bei Hautinfektionen durch Injektion von Candida albicans zu beobachten, um die Hautarchitektur und die Lokalisierung spezifischer Immun- und Nicht-Immunzellen zu erhalten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im immunologischen Bereich zu beantworten, wie z. B. die Art und Lokalisation der Immunzellen, die bei Hautinfektionen rekrutiert werden, und die wichtigsten beteiligten Mediatoren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Beibehaltung der strukturellen Architektur der Haut nach der Pilzinjektion, die es uns ermöglicht, die Lokalisation jedes Immunzelltyps zu verstehen.Einen Teil des Verfahrens wird Giulia Stamerra, Doktorandin aus dem Labor von Professorin Marina Vai, vorführen. Zu Beginn wird der C.Albicans Stamm CAF3-1 in Röhrchen mit reichhaltigem Medium geimpft, das mit 50 Milligramm Uridin pro Liter ergänzt wird, und bei 25 Grad Celsius kultiviert. Unter diesen Bedingungen wächst C.albicans als Hefe.Überwachen Sie die Kultur, indem Sie einen Zellzähleranalysator oder ein Spektralphotometer verwenden, um die zelluläre Konzentration zu messen. Wenn die Kultur acht mal 10 bis sechste Zellen pro Milliliter erreicht, ernten Sie die Probe. Verwenden Sie YEPD-Uridin-Medium mit Hepes als Puffermittel, um die Zellen wieder zu suspendieren und bei 37 Grad Celsius zu inkubieren, um die Hyphenbildung zu induzieren.Nach fünf Stunden in Kultur, wenn Hyphen sichtbar sein sollten, unter einem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung die Hyphenbildung überprüfen. Kultivieren Sie die Zellen insgesamt 16 Stunden lang, wobei zu diesem Zeitpunkt 95 % der Kultur Hyphen gebildet haben. Um die Konzentration der Hyphen weiter anzureichern, zentrifugieren Sie die Aliquoten der Kultur bei 3.300 g für fünf Minuten.Der Überstand wird verworfen und das Pellet mit sterilem PBS in einer Konzentration von eins mal 10 bis zur Achtel Hyphen pro Milliliter wieder suspendiert. Nachdem Sie eine rasierte Maus gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, überprüfen Sie den Pfotenreflex, um sicherzustellen, dass das Tier tief sediert ist. Um C.albicans-Hyphen in die tiefe Derma zu injizieren, ziehen Sie mit zwei Fingern die Haut der rasierten Flanke straff, führen Sie dann eine 30-Gauge-Acht-Millimeter-Nadel ein, die an einer 0,3-Milliliter-Insulinspritze in einem Winkel von 10 bis 15 Grad befestigt ist, wobei die Abschrägung der Nadel nach oben zeigt, und injizieren Sie ein Endvolumen von 50 Mikrolitern, was fünf mal 10 bis sechs Hyphen entspricht.Wenn der Injektionswinkel höher als 15 Grad ist, wird der Erreger zu tief in die Derma injiziert, wodurch eine Schädigung des Bauchfells und vor allem die Möglichkeit verloren geht, Infektionen speziell auf Hautebene zu untersuchen. In diesem Winkel wird der Erreger in einer Tiefe von etwa 300 bis 500 Mikrometern injiziert. Um sicherzustellen, dass die Injektion gut durchgeführt wird, überprüfen Sie, ob das injizierte Volumen eine Beule bildet, die nach einigen Minuten absorbiert wird.Bei Zeitpunkten von weniger als 24 Stunden verwenden Sie einen Markierungsstift, um den Infektionsbereich zu markieren, da die durch die Injektion gebildete Beule einige Minuten lang bestehen bleibt. Ab einem Zeitpunkt von 24 Stunden ist dieser Schritt nicht erforderlich, da entweder ein Geschwür oder eine Zyste deutlich sichtbar ist. Nach der Einschläferung der Mäuse nach institutionellen Richtlinien zieht man mit einer chirurgischen Zange die Haut am Rand der Injektionsstelle, die zuvor mit dem Markierungsstift markiert wurde, und schneidet dann mit einer chirurgischen Schere die infizierte Stelle heraus, indem man die Haut entlang der markierten Linie schneidet.Tauchen Sie die Haut mit der Innenseite nach oben in eine mit O.C.T.compound gefüllte Einweg-Basisform. Frieren Sie die Probe in flüssigem Stickstoff ein, bis die Verbindung weiß wird. Lassen Sie die Probe nicht mit flüssigem Stickstoff bedecken, bevor sie vollständig gefroren ist, da dies die Probe beschädigen kann.Um Objektträger vorzubereiten, schneiden Sie die Probe von der Mitte der Probe aus in zwei Hälften, um die Scheiben für die Histologie vorzubereiten, und schneiden Sie dann mit einem Kryostaten fünf Mikrometer dicke Scheiben ab. Verwenden Sie positiv geladene Objektträger, um die Scheiben zu sammeln. Um eine H&E-Färbung durchzuführen, tauchen Sie die Objektträger vier Minuten lang in Gills Hämatoxylin und waschen Sie die Objektträger dann fünf Minuten lang unter fließendem Leitungswasser.Tauchen Sie die Objektträger eine Minute lang in Eosin-Y-Lösung, waschen Sie die Objektträger fünf Minuten lang unter fließendem Leitungswasser und spülen Sie die Objektträger dann mit destilliertem Wasser ab. Als nächstes dehydrieren Sie die Proben, indem Sie sie jeweils 15 Sekunden lang in eine Ethanolserie eintauchen. Um die Objektträger zu reinigen, übertragen Sie sie für mindestens zwei Minuten in ein histologisches Clearingmittel und verwenden Sie dann Einbettmedium und Deckgläser, um die Proben zu montieren.Verwenden Sie einen Objektträgerscanner mit 40-facher Vergrößerung, um die Objektträger abzubilden. Führen Sie eine Färbung mit Period Acid Solution oder PAS durch, indem Sie die Objektträger eine Minute lang mit Aceton bei Raumtemperatur fixieren, und waschen Sie die Objektträger dann eine Minute lang mit fließendem Leitungswasser. Tauchen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in PAS und verwenden Sie dann drei Mal destilliertes Wasser, um die Proben zu waschen.Tauchen Sie dann die Objektträger 15 Minuten lang in Schiffs Reagenz und waschen Sie sie dann fünf Minuten lang mit fließendem Leitungswasser. Tauchen Sie die Probe fünf Minuten lang in Gills Hämatoxylin, um sie zu färben, und waschen Sie die Objektträger dann 30 Sekunden lang unter fließendem Leitungswasser. Dehydrieren Sie die Proben, indem Sie sie jeweils 15 Sekunden lang in drei Wechsel von 100 % Ethanol eintauchen, dann tauchen Sie die Objektträger in ein histologisches Clearingmittel.Montieren Sie die freigegebenen Proben mit Eindeckmedium und Deckgläsern und verwenden Sie dann einen Objektträgerscanner, um die Proben abzubilden. Nachdem Sie die Mäuse eingeschläfert und Hautproben entnommen haben, wie zuvor in diesem Video gezeigt, tauchen Sie die Proben in ein Zwei-Milliliter-Schnappverschlussröhrchen mit einem Milliliter Reagenz für die Extraktion von saurem Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform. Schneiden Sie das Gewebe mit einer chirurgischen Pinzette in 0,2 Quadratzentimeter große Stücke.Mit einer Kugelmühle werden die Proben mit 20 Schwingungen pro Sekunde 20 Minuten lang zerkleinert. Wenn noch intakte Hautstücke vorhanden sind, wiederholen Sie das Zerkleinern, bis die Probe vollständig homogenisiert ist. Die Proben werden eine Minute lang bei 16.000 g zentrifugiert.Bewahren Sie die Überstände für die RNA-Extraktion auf und entsorgen Sie das Pellet. Dieser Schritt wird durchgeführt, um Haare und Ablagerungen zu entfernen, die den Extraktionsprozess beeinträchtigen könnten. Verwenden Sie nach der Extraktion der RNA mit einer Aufreinigungssäule ein Spektralphotometer, um die RNA-Konzentration und -Reinheit zu messen.Die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Haut ermöglicht den Nachweis von Immunzellen und deren Lokalisierung am Ort der Infektion. Diese hohe Vergrößerung zeigt, dass der Abszess hauptsächlich aus PMCs besteht, die die Ausbreitung des Erregers durch seine Beschränkung auf den Infektionsort eindämmen. Auch die umliegenden Bereiche des Abszesses sind mit PMCs angereichert.In dieser Abbildung zeigt die PAS-Färbung, die dem Pilz eine violett-magentafarbene Farbe verleiht, deutlich, dass der Erreger in dem durch die Rekrutierung von Granulozyten gebildeten Abszess eingeschlossen ist. C.albicans ist bei höherer Vergrößerung deutlich sichtbar und scheint von nekrotischen und Immunzellen umgeben zu sein. Zu Beginn des Infektionsprozesses führt die Rekrutierung von Immunzellen zur Bildung des Abszesses.48 bis 72 Stunden nach der Infektion wurden die Störung der Hautstrukturen und die Bildung einer Narbe aufgrund der Heilungsphase nach Ausscheidung des Erregers sichtbar gemacht. Wie hier gezeigt, zeigen Wildtyp-Mäuse einen ulzerativen Prozess, der mit der Zeit zunimmt. Durch gezielte Behandlungen oder genetische Defekte kann die Bildung des Geschwürs reduziert und/oder aufgehoben werden.In einigen Fällen bildet sich anstelle eines Geschwürs eine Zyste, wie hier zu sehen. Im Anschluss an dieses Infektionsverfahren können weitere Methoden wie Proteinextraktionen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Aktivierung spezifischer intrazellulärer Signalwege zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Injektion von C.Albicans in die Haut durchführen, um die Beteiligung des Immunsystems während einer mikrobiellen Infektion zu untersuchen, ohne die Architektur des Epithels zu stören.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Reagenzien für RNA-Extraktionen äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung eines Abzugs getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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