Name: In Situ Mikroskopie zur Echtzeitbestimmung der einzelzelligen Morphologie in Bioprozessen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Erfahren Sie die In-situ-Mikroskopie zur Echtzeitbestimmung der Zellmorphologie in Bioprozessen. Diese Methode ermöglicht die kontaminationsfreie Überwachung einzelner Zellen direkt in der Suspension.

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Die Autoren sind dankbar für die Unterstützung des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie im Rahmen von ZIM-Koop, Projekt "Smart Process Inspection", Zuschuss Nr. ZF 4184201CR5.

HINWEIS: Die folgenden Schritte sind erforderlich, um die Parameter an die jeweiligen Mikroorganismen und Kulturbedingungen anzupassen. Die Einstellung der Sondeneinstellungen dauert für einen erfahrenen Benutzer ca. 20 min. Eine detaillierte Beschreibung der Werkzeuge und Schritte finden Sie im entsprechenden Prüfhandbuch der SOPAT GmbH. Im Allgemeinen werden die Werkzeuge benötigt, die im folgenden Protokoll dargestellt werden: (i) Probe Controller für Sondenanpassungen und Bildaufnahme; (ii) Fidschi (ImageJ) für Anmerkungen zu aufgenommenen Bildern; iii) SOPAT-Unterstützung für die Ausbildung und Erstellung von Workflows für künstliche neuronale Netzwerke (ANN); (iv) Batcher für die Datenverarbeitung mit bereits erfassten Bildern mit einem Workflow; (v) Ergebnisanalyse zur Ergebnisvisualisierung und Auswertung von Batch-verarbeiteten Bildern; und (vi) Monitor für automatisierte Echtzeitmessung und Ergebnisvisualisierung.
1. Einstellen von Hardwareparametern
<ol><li>Bereiten Sie eine Kultur mit der höchsten Zellkonzentration vor, die während des Experiments oder der Zentrifuge erreicht werden könnte, und setzen Sie das Pellet wieder auf, um diese Konzentration zu erreichen. In diesem Fall wurden 65 gL-1 der Trockenbiomassekonzentration für den Anbau von S. cerevisiae gewählt.</li>
	<li>Bereiten Sie verschiedene Verdünnungen vor, die von der höchsten bis zur niedrigsten Konzentration reichen, so dass der erwartete Bereich vollständig abgedeckt ist. Es werden mindestens 4 verschiedene Konzentrationen empfohlen.</li>
	<li>Identifizieren Sie den Zellgrößenbereich des Mikroorganismus mit konventioneller Mikroskopie. Definieren Sie den erwarteten maximalen Durchmesser (dmax) der jeweiligen Zellen. Bei S. cerevisiaewird dieser Wert auf 8 m festgelegt.</li>
	<li>Wählen Sie zwei Messlücken von 5x und 10x des erwarteten dmax der Zellen.</li>
	<li>Wählen Sie die maximale Stroboskopintensität aus. Wählen Sie Stroboskopintensitäten für beide Lücken mit der höchsten Zellkonzentration, so dass Zellen auf den Bildern mit der niedrigsten Lichtintensität (dunkelste Bilder) noch sichtbar sind.</li>
	<li>Wählen Sie die minimale Stroboskopintensität aus, und wählen Sie dann Stroboskopintensitäten für beide Lücken aus, sodass Zellen auf den Bildern mit der höchsten Lichtintensität (hellste Bilder) noch sichtbar sind. Verwenden Sie die niedrigste Zellkonzentration, die wahrscheinlich während des Messzeitraums auftritt.</li>
	<li>Wählen Sie eine Fokusposition, die die schärfsten Bilder für jede Messlücke liefert, sowohl für die Stroboskopintensitäten als auch für den zu prüfenden Konzentrationsbereich (Details zum Fokussieren siehe Schritt 2). Fokuszellen entsprechend fokussieren, damit die Bilddaten anschließend mit Anmerkungen benotet werden können (siehe Schritt 4).</li>
	<li>Messen Sie die zuvor vorbereitete Verdünnungsreihe der Zellkonzentration (siehe Schritt 2) mit spaltbreiten breiten und Stroboskopintensitäten.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57823/57823fig1.jpg"> Abbildung 1: Konzentrationskalibrierungswerkzeug. Linke GUI: Bildverzeichnisse (Mindestens 3) mit bekannten Konzentrationen festlegen; zentrale GUI: Wählen Sie Features aus, die im Bildverzeichnis berechnet werden sollen; rechte GUI: Wählen Sie den gewichteten Stammmittelquadratfehler (WRMSE) aus, um das Minimum zu identifizieren. WRMSE und die beste Korrelation zwischen jedem Bild-Feature und der Zellkonzentration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57823/57823fig1alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="9"><li>Bewerten Sie das Verdünnungsserienexperiment.<ol>
<li>Verwenden Sie das Werkzeug Konzentrationskalibrierung (CoCa) (siehe Abbildung 1), um die optimale Korrelation zwischen den extrahierten Bildmerkmalen (Helligkeit oder Schärfe) und den zuvor vom Anwender bereitgestellten Konzentrationen, z. B.Trockenbiomasse oder Zellzahl, zu identifizieren. Folgen Sie den Anweisungen im Software-Handbuch für weitere Details.</li>
		<li>Identifizieren Sie die optimale Korrelation zwischen den extrahierten Informationen aus den Bild-Features in verschiedenen Konzentrationen im Vergleich zu beliebigen Off-Line-Messungen. Siehe die Legende von Abbildung 1.</li>
		<li>Wählen Sie die am besten zumutbaren Messlücken- und Stroboskopintensitäten unter Berücksichtigung der Konzentrationskorrelationskurve mit den Merkmalen, die zu dem kleinsten gewichteten Mittelwert-Quadratfehler (WRMSE) führen. HINWEIS: Der Messspalt wird während des Experiments fixiert, während die Stroboskopintensität entsprechend der Zellkonzentration angepasst werden kann.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Off-Line-Messung
<ol><li>Stellen Sie den gewünschten Messspalt nach Schritt 1 mit Hilfe eines Dickenmessgeräts ein.</li>
	<li>Öffnen Sie die grafische Benutzeroberfläche Probe Control im SOPAT-Dashboard.</li>
	<li>Schließen Sie die gewünschte Sonde an den Verstärker im Software-Unterabschnitt Aktionen an und drücken Sie Connect.</li>
	
	<li>Drücken Sie die Play-Taste, um das Streaming zu starten ( LiveView).</li>
	<li>Reinigen Sie den Messspalt, indem Sie Ethanol in den Spalt sprühen und Staub oder Schmutz mit einem optischen Papier sorgfältig abwischen. Prüfen Sie, ob das Glas des Sensors mit der Live-Ansicht im CamControlpartikelfrei ist. HINWEIS: Partikel und Staub stören Messungen und die automatische Zellidentifikation.</li>
	<li>Legen Sie ein trockenes optisches Papier in den Messspalt. Öffnen Sie die Registerkarte Probe-Steuerung und passen Sie die Stroboskopintensität an, um das Papier zu visualisieren. Drehen Sie die Bindungsschraube, bis die einzelnen Fasern des Papiers deutlich sichtbar sind.</li>
	<li>Füllen Sie eine Röhre mit Kulturbrühe. Tauchen Sie das Mikroskop in die Kulturbrühe, so dass der Spalt vollständig mit Zellsuspension bedeckt ist. Öffnen Sie die Tabatonensteuerung und passen Sie die gewünschte Stroboskopintensität gemäß Abschnitt 1 an. Konzentrieren Sie sich auf die Zellen, indem Sie die Fokusbindungsschraube feinabstimmen. Der Fokus darf während des Experiments nicht mehr geändert werden HINWEIS: 5-6 ml Kulturbrühe werden einem 50 ml konischen Zentrifugalrohr zugesetzt, um den Messspalt ausreichend zu schweben.</li>
	<li>Definieren Sie die Anzahl der Frames pro Zeitpunkt [-] in der Benutzeroberfläche im Menü Auslösen in den GUI Frames pro Trigger. Legen Sie die Anzahl der Frames auf 200 Frames pro Trigger fest. HINWEIS: Die Anzahl der Frames kann auf den niedrigsten Wert reduziert werden, was für ein statistisch zuverlässiges Ergebnis erforderlich ist. Dies hängt von der Stichprobengröße ab, die erforderlich ist, um eine repräsentative morphologische Zellgrößenverteilung zu erhalten (siehe auch Schritt 5).</li>
	<li>Definieren Sie die Bildrate [Hz] im Menü Auslösen in der GUI-Framerate. Wählen Sie eine Bildrate aus, die sich einstellt, dass bewegte Partikel aus einem vorherigen Frame nicht im folgenden Frame angezeigt werden. HINWEIS: Dies kann mit einem Testauslöser mit 200 Frames nachgewiesen werden. Prüfen Sie die Bilder auf Partikel, die wiederholt erfasst werden. Wenn dies der Fall ist, verringern Sie die Bildrate. Für Off-Line-Messungen wird 1 Hz empfohlen.</li>
	<li>Legen Sie das Verzeichnis, in dem die erfassten Bilder gespeichert werden, im Menü Allgemeinfest.</li>
	<li>Führen Sie eine Bildaufnahme durch, indem Sie die Schaltfläche "Startbildtrigger"-Aufnahme aktivieren. Bewegen Sie das Rohr mit Kulturfederung sanft nach oben und unten, um einen Fluss durch den Messspalt zu induzieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.5 nach jeder Messung.</li>
	<li>Überprüfen Sie die aufgenommenen Bilder. Zellen müssen scharf genug für Anmerkungen sein. Prüfen Sie die Bilder auf Partikel, die wiederholt erfasst werden. Wenn dies der Fall ist, verringern Sie die Bildrate.</li>
	<li>Speichern Sie die Einstellungen, indem Sie den folgenden Pfad auswählen: C:-Programmdateien, SOPAT GmbH, MonitoringPrograms, camcontrol, und drücken Sie Speichern.</li>
</ol>3. Partikelidentifikation
<ol><li>Kommentieren Sie Partikel für das Training des künstlichen neuronalen Netzwerks (ANN) (Trainingsset).<ol>
<li>Laden Sie die erfassten Bilder in das Anmerkungswerkzeug "Fidschi, ImageJ", indem Sie die Datei in das Hauptfenster "ImageJ" ziehen und ablegen (siehe GUI "Fidschi" Werkzeug in Abbildung 2)</li>
		<li>Öffnen Sie den ROI-Manager, indem Sie Folgendes auswählen: Analysieren | Werkzeuge | ROI Manager.</li>
		<li>Wählen Sie ein Auswahlwerkzeug aus. Wand (Tracing) Werkzeug, Freihand-, Oval- oder elliptische Auswahl werden empfohlen.</li>
		<li>Zeichnen Sie einen Kreis um das Partikel, der mit den zuvor erwähnten Auswahlwerkzeugen mit Anmerkungen benotet werden soll, und verfeinern Sie es dann mit dem Pinselwerkzeug.</li>
		<li>Fügen Sie die Anmerkung zum ROI Manager hinzu, indem Sie auf Hinzufügen [t]drücken.</li>
		<li>Markieren Sie alle Objekte von Interesse (zellen, die identifiziert werden sollen) auf etwa 15 Bildern. HINWEIS: Um alle notwendigen Informationen, d. h. verschiedene Formen, Größen, Konzentration der Zellen, Helligkeit usw.,abzudecken, verwenden Sie fünf Bilder von Anfang an, fünf Bilder von dazwischen und fünf Bilder vom Ende des Experiments.</li>
		<li>Entscheiden Sie, ob Zellen aufgrund ihrer Form(z. B.verschiedene Phasen eines Zellzyklus) in verschiedene Unterklassen klassifiziert werden müssen oder ob alle Zellen derselben Klasse angehören.</li>
		<li>Ändern Sie den Namen der einzelnen ausgewählten Partikel entsprechend. Legen Sie einen Namen oder eine Abkürzung für jede Klasse und einen Zähler für jedes Partikel der Klasse fest(z. B.cell_1, cell_2 usw.). Kommentieren Sie mindestens 50 Partikel pro Klasse.</li>
		<li>Kommentieren Sie keine Objekte, die nicht erkannt werden sollten, da sie für den Prozess nicht relevant sind, wie Gasblasen oder andere Partikel wie ungelöste Medienkomponenten. HINWEIS: Diese Ereignisse werden nicht in das Schulungsverfahren für die ANN einbezogen und gelten als Hintergrund.</li>
		<li>Kommentieren Sie keine Zellen, die nicht im Fokus stehen.</li>
		<li>Kommentieren Sie die Bilder so konsistent wie möglich. Wenn Zweifel bestehen, kann die Bezeichnung Ignorieren angewendet werden. Es wird dringend empfohlen, seine Verwendung nicht zu missbrauchen, da die ANN nur Strukturen erkennt, die gekennzeichnet sind.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57823/57823fig2a.jpg"> Abbildung 2: Benutzeroberfläche des Fidschi-Werkzeugs. Mit den annotierten Bildern wird ein Trainingssatz erstellt. Eine manuelle Anmerkung, die aus zwei Klassen besteht, wird dargestellt, die Liste der annotierten Partikel wird im ROI Manager angezeigt. Für verschiedene Klassen können unterschiedliche Namen und Farben festgelegt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57823/57823fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="2"><li>Speichern Sie die annotierten Objekte und das Bild in einem ZIP-Format und senden Sie die Datei entweder per Upload auf die Plattform oder per E-Mail an das Trainingsnetzwerk. HINWEIS: In der Regel dauert es eine Reihe von iterativen Trainingsrunden, um angemessene Vorhersagen der klassifizierten Objekte auf den Bildern zu identifizieren. Jede Trainingsrunde führt zu einem Workflow, der vom Programm zurückgegeben wird.</li>
	<li>Verwenden Sie den Workflow (*.wf) mit dem trainierten Objekterkennungsalgorithmus, um Testbilder mit dem Datenbatch-Fortschrittsprogramm Batcher zu analysieren, das im Dashboard gestartet werden kann.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Objekterkennung auf den Testbildern durch die Quantifizierung falsch positiver und negativer Ereignisse.<ol>
<li>Quantifizieren Sie die Detektion falsch positiver Ereignisse: Partikel, die fälschlicherweise als Zellen erkannt wurden, Zellen, die nicht korrekt klassifiziert sind, und Zellen, deren Kontur nicht gut identifiziert wurde.</li>
		<li>Quantifizieren Sie die falschen negativen Ereignisse (Zellen, die nicht als solche erkannt werden).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualisieren Sie die Ergebnisse im Tool Ergebnisanalysator, indem Sie das Programm im Dashboard starten.<ol>
<li>Importieren der gewünschten Ergebnisdateien mit Datei | Datei oder Datei importieren | Importieren von Ordnern.</li>
		<li>Visualisieren Sie die Ergebnisse nach Diagramm | Erstellen Sie ein Diagramm auf der Charts-GUI.</li>
		<li>Wählen Sie eine der folgenden Optionen aus: Verteilungsdiagramm, Sensitivitätsdiagramm, Merkmal im Zeitverlauf, Merkmal über Vermessungspunkte und Feature vs. Feature. HINWEIS: Ein Handbuch zur Nutzung des Result Analyzer kommt mit dem System und ist auch im Support erhältlich.</li>
		<li>Wenn die Ergebnisse akzeptabel sind, führen Sie den Workflow im Batcher für alle erfassten Bilder des Experiments aus. Gleichzeitig kann dann das Überwachungsprogramm erstellt werden, indem die gespeicherten Einstellungen aus dem Probe Controller (*.pcfg) mit dem Workflow (*.wf) kombiniert werden, siehe auch das Handbuch. HINWEIS: Der Workflow kann auch zur Überwachung zukünftiger Experimente für diese Kulturmedien verwendet werden.</li>
		<li>Wenn die Ergebnisse nicht akzeptabel sind, überprüfen Sie die Anmerkung auf dem Trainingssatz und/oder fahren Sie mit einer anderen iterativen Trainingsrunde fort (siehe Schritt 4.2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Stichprobengrößenquantifizierung
<ol><li>Legen Sie die Standardabweichung fest, die unter den erfassten Partikeln akzeptabel ist. HINWEIS: Die Standardabweichung ändert sich parallel zur Homogenität der Zellengröße. Die maximale Standardabweichung gibt die Stichprobe mit der höchsten Größe der Heterogenität an.</li>
	<li>Legen Sie die Amplitude des Konfidenzintervalls oder die gewünschte Genauigkeit in Bezug auf die erwartete Varianz der Messungen (e)fest.</li>
	<li>Stellen Sie den zugegebenen Fehler zwischen 5 % (z1-a/2 = 1,96) und 10 % (z1-a/2 = 1,64) ein.</li>
	<li>Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die aus jeder Klasse aus Gleichung 1 identifiziert werden sollen. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57823/57823eq1.jpg">[Gleichung 1] HINWEIS: Basierend auf der Anzahl der Zellen kann die Anzahl der Bilder, die erfasst werden müssen, für jeden Datenpunkt definiert werden.</li>
	<li>Führen Sie eine Sensitivitätsanalyse zu zufälligen Zeitpunkten des Experiments durch, um zu überprüfen, ob die Analyse von n Partikeln zu einer Variabilität des mittleren Feret-Durchmessers und des Dv90 von weniger als 5 % führt. Sie kann automatisch im Ergebnisanalysatorberechnet werden.</li>
</ol>5. On-Line (By-Pass) oder In Line Measurement
<ol><li>Führen Sie zunächst das Offline-Messverfahren durch (siehe Schritt 2), um die Hardware- und Softwareeinstellungen als Funktion des Organismus und des Prozesses (Konzentration oder Medien) einzustellen.</li>
	<li>Laden Sie die gespeicherten Einstellungen aus dem vorherigen Abschnitt hoch, indem Sie die Schaltfläche Laden auswählen, und wählen Sie den folgenden Pfad aus: C:-Programmdateien, SOPAT GmbH, MonitoringPrograms, camcontrol.</li>
	<li>Verbinden Sie die Sonde mit der Durchflusszelle oder dem Bioreaktor. HINWEIS: In-situ-Messungen können mit einem Pinch-Flansch durchgeführt werden.</li>
	<li>Sterilisation durchführen. HINWEIS: Nur das sondenbenetzte Material des Instruments ist durch Dampfsterilisation sterilisierbar. Die benetzte Sondenlänge kann von 6 bis 222 mm gehen (Abbildung 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57823/57823fig3a.jpg"> Abbildung 3: Skizze der ISM-Geräte. Die Sonde MM-Ho (A) ist direkt im Bioreaktor einbaubar, während die Sonde MM 2.1 (B) als Umgehungskarte verwendet werden kann. Die Kulturbrühe Zirkulation ist mit Pfeilen in jedem Bild markiert. Die Umrechnungsfaktoren sind 0,166 'm pix-1 für MM-Ho und 0.087 'm pix-1 für MM 2.1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57823/57823fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="5"><li>Definieren Sie die Bildaufnahmerate in der GUI Triggering im Feld Triggerintervall [s]. HINWEIS: Je nach Prozessdynamik kann die Bildaufnahmerate angepasst werden. Wenn z. B. eine Verzögerungsphase von 3 Stunden zu erwarten ist, kann die Erfassungsrate niedriger sein, als wenn eine Stoffwechselverschiebung oder die Akkumulation eines Produkts überwacht werden soll. In der Regel erfordert dies eine viel kürzere Erfassungszeit im Minutenbereich. Beispielsweise liefert eine Bildaufnahmesequenz zwischen 5 und 10 min während einer Chargenhefekultivierung ausreichende Informationen, um die Prozessdynamik zu erfassen.</li>
	<li>Definieren Sie die Bildrate, wie in Schritt 2.10 erläutert. HINWEIS: Bei Online- und Linienmessungen kann die Bildrate erhöht werden, da das mechanische Rühren die Durchflussrate durch den Spalt erhöhen kann.</li>
	<li>Starten Sie die Bildaufnahme, indem Sie die Schaltfläche Streaming des ausgewählten Prüfpunktsstarten aktivieren.</li>
	<li>Beenden Sie die Erfassung, wenn das Experiment mit der Schaltfläche Streaming der ausgewählten Sondebeenden abgeschlossen ist. ANMERKUNG: Starten Sie für den1. Lauf die Erfassung kurz vor der Inokulation der Kultur und fahren Sie mit Schritt 4 fort. Öffnen Sie für die folgenden Ausführungen das Programm Überwachung im Dashboard, und wählen Sie den erstellten Workflow aus (siehe Schritt 4). Starten Sie die Überwachung kurz vor der Inokulation der Kultur, indem Sie die Play-Taste drücken.</li>
</ol>

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<li>Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+systems+analysis+and+control+for+implementing+process+analytical+technology+in+bioprocess+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Technology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu erklären.

ISM, wie hier mit den gleichen oder sehr ähnlichen Geräten vorgestellt, wurde verwendet, um die morphologische Dynamik von Pilzen, Mikroalgen und Hefezellen zu messen, die die Bestimmung der Wachstumsaktivität und im Falle von Algen, intrazelluläre Produktakkumulation ermöglicht. Der Sensor hat keine beweglichen Teile und ist direkt in jedem Standard-Rührbehälter-Bioreaktor einsetzbar, entweder über einen Standardport oder in einem sterilisierbaren Bypass. Da Hefe viel kleiner als Algen ist, erforderte die Reduzierung de...

Morphologische Merkmale von Zellen hängen oft mit dem physiologischen Zustand zusammen, eine Verbindung zwischen Form und Funktion besteht für viele Anwendungen. Die Morphologie einer einzelnen Zelle wird durch den Wachstumszustand, das Alter der Zelle, osmotische und andere potenzielle Zellspannungen oder Produktakkumulation beeinflusst. Morphologische Veränderungen von Zellen sind oft ein Maß für die Wachstumsvitalität einer Kultur. Intrazelluläre Produktsynthese, Lipidansammlung in Algen und Inklusionkörperbildung in Bakterien, unter anderem, sind auch mit der Zellgröße verbunden. Zellagglomeration kann ein weiterer Faktor sein, der es wert ist, untersucht zu werden, wie kürzlich zusammengefasst2.
Populationsheterogenitäten können anhand morphologischer Merkmale einzelner Zellen quantifiziert werden. Studien zeigten, dass Heterogenität innerhalb einer Kultur signifikant sein kann, z. B.könnte unter großflächigen Produktionsbedingungen3 der Gesamtertrag durch eine geringe Leistung der Subpopulationen beeinflusst werden4.
In der Regel erfolgt die Beurteilung morphologischer Merkmale von Zellen durch manuelle Probenahme oder mit einer Anpass-Durchflusskammer, die an ein fotooptisches Gerät gekoppelt ist. Dies führt zu mehreren Einschränkungen: Die begrenzte Menge der erfassten Daten kann kaum statistisch zuverlässige Messungen liefern; die Zeitverzögerung zwischen der Probenahme und der Zugänglichkeit der Ergebnisse kann im Vergleich zur Dynamik des Prozesses zu lang sein; und am wichtigsten ist, dass das Probenahmeverfahren (Standort des Probenahmeports, Vorbehandlung der Probeprobe vor der Messung, ungünstige Bedingungen in der Probenahme oder im Bypass-Rohr) einen verzerrten Fehler auslösen kann, da das Probenverfahren selbst bereits die Zelle beeinflussen kann. Morphologie. Schließlich besteht immer ein hohes Kontaminationsrisiko bei der Probenahme oder bei Umgehungslösungen, wenn sie nicht sterilisierbar sind.
Die Anwendung der In-situ-Mikroskopie (ISM) kann mehrere dieser Probleme umgehen. Wenn Zellen automatisch erkannt werden, kann eine korrekte Identifizierung ihrer morphologischen Merkmale vermessen werden5. Bisher waren die Haupteinschränkungen dieser Methode (i) die Auswertungszeit von Bildern, die für In-situ-Anwendungen zu lang war, und (ii) die schlechte Auflösung von Bildern, insbesondere bei hoher Zelldichte. Obwohl erste Lösungen von ISM mechanische Probenahme, Verdünnung der Sonde oder waren auf ein Umgehungssystem6,7beschränkt, weitere Ansätze ermöglichen die Erfassung der Zellsuspension direkt8.
Jüngste Fortschritte im ISM ermöglichen die inline- oder online-Überwachung von Zellen auf Einzelzellbasis, die die Verteilung morphologischer Parameter in Echtzeit direkt in Zellsuspensionen bei erheblich hohen Zellkonzentrationen ermöglicht. Durch Off-Line-Analysen der Schlüsselparameter der Zellen können Korrelationen mit Informationen identifiziert werden, die durch die gekoppelte automatisierte Zellerkennung und ISM bereitgestellt werden. Dann werden neue Softsensor-Designs erreicht, bei denen mit der einzelligen Morphologie ein nicht messbarer Parameter geschätzt wird.
In diesem Bericht wird das ISM durch Koppelung einer photooptischen Sonde an eine automatisierte Bildanalyse durchgeführt. Die ISM besteht aus einer einstabigen Sensorsonde, die die Aufnahme von Bildern innerhalb eines bekannten Fokusbereichs in einem einstellbaren Messspalt mit einer hochauflösenden CCD-Kamera [MM-Ho = CCD GT2750 (2750x2200) und MM 2.1 = CMOS G507c (2464x2056)] ermöglicht. Die Blitzlichtbeleuchtung erfolgt über die Übertragung. Daher stammt das Licht von der gegenüberliegenden Seite der Kamera9 und seine Intensität kann eingestellt werden. Zellen passieren diese Lücke kontinuierlich mit dem Flüssigkeitsfluss. Daher wird eine repräsentative Stichprobenpopulation ermittelt. Die Sonde kann direkt am Bioreaktor montiert werden, so dass sie in die Zellsuspension gelangt, oder sie kann in einem sterilisierbaren Bypass verwendet werden. Die Sensorhülle wird vor der Sterilisation mit dem System verbunden, die optischen Teile werden anschließend in die Schale montiert.
Bisher wurden relevante industrielle Mikroorganismen, z.B.fadenförmige Pilze (Durchmesser von bis zu über 200 m), die heterotrophen Mikroalgen Crypthecodinium cohnii (durchschnittlicher Zelldurchmesser von 20 m) und die Hefe Saccharomyces cerevisiae (durchschnittlicher Zelldurchmesser von 5 m) mit diesen oder ähnlichen Vorrichtungen untersucht, was kurz beschrieben wird.
Fadenförmige Pilze neigen dazu, Pellets unter bestimmten Anbaubedingungen zu bilden. Diese haben eine Größe von bis zu mehreren hundert m. Die Hyphen der Pilzzellen entwickeln unterschiedliche Längen in Abhängigkeit von der hydrodynamischen Belastung in der Fluidphase. Dies hat einen Einfluss auf die Stoffwechsel- und Wachstumsaktivität, substrataufnahme und Produktfreisetzung. ISM wurde angewendet, um die Pelletgrößenverteilung und die Breite von Zonen mit geringerer Biomassedichte an den Rändern der Pellets zu identifizieren (eigene unveröffentlichte Daten).
Die Größe von C. cohnii ändert sich zwischen 15 und 26 m, wenn Zellen die mehrfach ungesättigte Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) unter Stickstoffbegrenzung ansammeln. Dieser biotechnologische DHA-Produktionsprozess besteht aus zwei Teilen, der Wachstumsphase, in der sich Zellen teilen und kleiner werden, und der Produktionsphase, in der Zellen das Produkt ansammeln und dadurch größer werden. Daher wurde die Zellgröße verwendet, um den Prozesszustand zu bestimmen, in dem entweder Wachstum oder DHA-Produktion günstig war. Schließlich wurde eine Korrelation zwischen der Zellengröße und dem DHA-Inhalt gefunden. In diesem Fall ermöglicht ISM die Überwachung der intrazellulären DHA-Akkumulation in Echtzeit ohne die Notwendigkeit von Probenahme, Zellstörung und der gemeinsamen Gaschromatographie-Analyse10.
Budding Hefe ist in der Regel von einer Größe zwischen 3 und 8 m. Der Anteil der Zellen, die sich gleichzeitig im Reifezustand befinden, wie mit dem angehenden Index (BI) beschrieben, liefert Informationen über die Wachstumsvitalität11,12, und sogar eine Beziehung zur rekombinanten Proteinsekretion wurde13nachgewiesen. Mit Hilfe von ISM wurden angehende und nicht aufkeimende Hefezellen (Zellen mit und ohne Knospe)14unterschieden. Stressbedingungen können auch zu einer breiteren Variation der Zellgröße innerhalb einer Hefepopulation führen, wie kürzlich in scale-down-Kulturen gezeigt wurde, bei denen die Bedingungen für großflächige nährstoffbegrenzte Futter-Batch-Kulturen nachgeahmt wurden3.
Daher hat ISM das Potenzial, die Wachstumsvitalität und Produktbildung auf einzelzelliger Ebene in allen Phasen eines Bioprozesses zur Ermittlung optimaler Anbaubedingungen oder zum Zwecke der Prozesskontrolle zu überwachen. Die hier beschriebenen Methoden konzentrieren sich auf mikrobielle Anwendungen mit Einzelzellen, sind aber auch auf größere Partikel wie menschliche und tierische Zellen, Zellagglomerate und Pellets von fadenförmigen Organismen anwendbar.

<table><tbody><tr><td>Sensor MM 2.1 - MFC</td><td>SOPAT GmbH, Deutschland</td><td>n.a.Inline</td> <td>Monokulare mikroskopische Sonde Version 2.1 mit einer Mirco Durchflusszelle</td></tr><tr><td>Sofware Version v1R.003.0092</td><td>SOPAT GmbH, Deutschland</td><td>n.a.Dickenmessgerät</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>n.n.Es</td><td></td> <td>kann jeder Lieferant sein, DIN 2275:2014-03</td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>n.n.Es</td><td></td> <td>kann jeder Lieferant</td></tr><tr><td>sein SOPAT manuelle Version 2.0.5</td><td>SOPAT GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optisches Linsenpapier</td><td>VWR</td><td>470150-460</td><td></td></tr><tr><td>Fidschi, ImageJ</td><td>Open Source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td></td><td></td><td>Es kann jeder Lieferant sein</td></tr></tbody></table>

in situ mikroskopie zur echtzeitbestimmung der einzelzelligen morphologie in bioprozessen

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Die In-situ-Überwachung in mikrobiellen Bioprozessen beschränkt sich meist auf chemische und physikalische Eigenschaften des Mediums(z.B.pH-Wert und Die Konzentration auf gelöster Sauerstoff). Dennoch kann die Morphologie der Zellen ein geeigneter Indikator für optimale Bedingungen sein, da sie sich mit Abhängigkeit vom Wachstumszustand, der Produktakkumulation und der Zellspannung ändert. Darüber hinaus liefert die Einzelzellgrößenverteilung nicht nur Informationen über die Anbaubedingungen, sondern auch über die Heterogenität der Population. Um solche Informationen zu erhalten, wurde ein fotooptisches In-situ-Mikroskopiongerät 1 entwickelt, um die Überwachung der einzelzelligen Größenverteilung direkt in der Zellsuspension in Bioreaktoren zu ermöglichen. Eine automatisierte Bildanalyse wird an die Mikroskopie gekoppelt, die auf einem neuronalen Netzwerkmodell basiert, das mit benutzerkommentierten Bildern trainiert wird. Mehrere Parameter, die aus den Aufnahmen des Mikroskops gewonnen werden, werden mit prozessrelevanten Merkmalen der Zellen korreliert, wie ihre metabolische Aktivität. Bisher wurde die vorgestellte In-situ-Mikroskopie-Sondenserie zur Messung der Pelletgröße in fadenförmigen Pilzsuspensionen eingesetzt. Es wurde verwendet, um die einzellige Größe in der Mikroalgenkultivatierzukultivierung zu unterscheiden und sie mit der Lipidakkumulation in Beziehung zu setzen. Die Form der zellulären Teilchen war mit dem Aufblühen in Hefekulturen verbunden. Die Mikroskopieanalyse kann im Allgemeinen in drei Schritte unterteilt werden: (i) Bildaufnahme, (ii) Partikelidentifikation bzw. (iii) Datenanalyse. Alle Schritte müssen an den Organismus angepasst werden, und daher sind spezifische, mit Anmerkungen bestellte Informationen erforderlich, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Die Möglichkeit, Veränderungen in der Zellmorphologie direkt in der Linie oder im Internet (in einer Umgehungskarte) zu überwachen, ermöglicht Echtzeitwerte für Überwachung und Steuerung, in der Prozessentwicklung sowie im Produktionsmaßstab. Wenn die Off-Line-Daten mit den Echtzeitdaten korrelieren, werden die aktuellen mühsamen Off-Line-Messungen mit unbekannten Einflüssen auf die Zellgröße überflüssig.

Die Zellgrößenerkennung in Hefekulturen mit dem ISM und die automatische Bilderkennung zur Unterscheidung zwischen angehenden und nicht aufkeimenden Zellen wurde erfolgreich durchgeführt. Sowohl die Stroboskopintensität als auch die Wahl des Messspalts weisen einen Toleranzbereich auf, bei dem die Partikelidentifikation nicht beeinträchtigt wird. So wurden z.B. S. cerevisiae Zellen mit verschiedenen Stroboskopintensitäten in einem Variationsbereich von 11% bei einer Trockenbiomas...

Ein fotooptisches In-situ-Mikroskopiergerät wurde entwickelt, um die Größe einzelner Zellen direkt in der Zellsuspension zu überwachen. Die Echtzeitmessung erfolgt durch Kopplung der photooptischen sterilisierbaren Sonde an eine automatisierte Bildanalyse. Morphologische Veränderungen treten mit Abhängigkeit vom Wachstumszustand und den Anbaubedingungen auf.

In Situ Mikroskopie zur Echtzeitbestimmung der einzelzelligen Morphologie in Bioprozessen

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen der Populationsheterogenität durch die morphologische Bewertung der Zellen zu beantworten. Die In-situ-Mikroskopie ermöglicht Studienbedingungen, Prozesserträge und Produktqualität. Der Hauptvorteil dieser Technik ist eine In-situ-Messung, die Echtzeitdaten liefert, ohne Probenahme oder Kontaminationsgefahr.Die an die automatisierte Bilderkennung gekoppelte In-situ-Mikroskopie kann zusätzliche Informationen über Zellstrukturen, Form und Zellagglomeration über die Größe hinaus liefern. Es ist auch möglich, Zellkonzentrationen zu messen. Die Methode hat sich als zuverlässiges Werkzeug erwiesen.Keine alternative Methode liefert die gleichen Informationen in so kurzer Zeit und geringen Aufwand für die Probenvorbereitung. Die Methode wurde an verschiedene Bioprozesse und Mikroorganismen, SEG-Filamentpilze, Mikroallergien und Hefe angepasst. Die Sonde wird in Verbindung mit einem Computer verwendet.Die Hardware besteht aus einer einzigen Stabsonde mit einer hochauflösenden CCD-Kamera. Zellen, die einen einstellbaren Messspalt durchlaufen, werden von der Kamera ababgebildet. Licht dringt in die Lücke gegenüber der Kamera ein, was bedeutet, dass die Beleuchtung durch Übertragung erfolgt.Legen Sie die Hardwareparameter mithilfe von Zellenkonzentrationen fest, die den erwarteten Bereich umfassen. Beginnen Sie mit den Vorbereitungen für Offline-Messungen. Verwenden Sie ein Dickenmessgerät, um den Messspalt anzupassen.Drehen Sie dann die Sondenschneckenmutter, um den Messspalt auf das Fünf- oder Zehnfache des maximal erwarteten Zelldurchmessers einzustellen. Öffnen Sie am Computer die Prüfpunktsteuerungssoftware. Wählen Sie in der Software die gewünschte Sonde aus und gehen Sie zu Abschnittsaktionen.Drücken Sie dann Connect. Gehen Sie als Nächstes zur Registerkarte Probesteuerung und öffnen Sie sie. Starten Sie das Videostreaming, indem Sie die Wiedergabetaste drücken.Befestigen Sie die Sonde an einem Stativ, und führen Sie die folgenden Schritte für jede Messung aus. Arbeiten Sie mit der Sonde und sprühen Sie Ethanol in den Messspalt. Wischen Sie Staub oder Schmutz vorsichtig mit optischem Papier ab.Verwenden Sie am Computer die Live-Ansicht, um zu überprüfen, ob das Glas des Sensors frei von Partikeln ist. Legen Sie als Nächstes ein trockenes optisches Papier in den Messspalt, um es zu fokussieren. Drehen Sie die Bindungsschraube, um den Fokus manuell zu bewegen.Hören Sie auf zu fokussieren, wenn einzelne Fasern des Papiers im Messabstand deutlich zu sehen sind. Jetzt, bekommen Sie eine Röhre mit Kulturbrühe gefüllt. Tauchen Sie das Mikroskop in die Brühe, so dass der Spalt vollständig mit Zellsuspension bedeckt ist.Verwenden Sie die Bindungsschrauben, um den Fokus auf die Zellen zu optimieren. Sobald diese Fokussierung abgeschlossen ist, ändern Sie sie während des Experiments nicht mehr. Kehren Sie zur Software für das Experiment zurück.Wechseln Sie zum Menü Auslösen. Legen Sie im Menü Auslösen die Bildrate fest. Für Offline-Messungen wird ein Hertz empfohlen.Gehen Sie von dort aus zum Feld Frames pro Trigger und legen Sie es als notwendig für gute Statistiken fest. Hier etwa 200. Gehen Sie auch zum Menü Allgemein.Wählen Sie dort das Verzeichnis aus, in dem die Bilder gespeichert werden sollen. Beginnen Sie mit der Schaltfläche Bildtriggererfassung starten. Bewegen Sie das Rohr vorsichtig, um den Durchfluss im Messspalt zu induzieren.Verwenden Sie die Bilder aus dem ersten Versuch des Experiments als Trainingssatz. Haben Sie die Open-Source-Software Fidschi bereit und lassen Sie die Bilder aus dem Experiment in sein Fenster. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie Analysieren, gefolgt von Tools und dann ROI Manager aus.Wählen Sie als Nächstes ein Auswahlwerkzeug aus. Entscheiden Sie im Bild für ein Zunotenelement, das im Fokus steht. Zeichnen Sie mit dem Auswahlwerkzeug einen Kreis um ihn herum.Drücken Sie Hinzufügen, um die Anmerkung zum ROI Manager hinzuzufügen. Wählen Sie als Nächstes ein Pinselwerkzeug aus, und wählen Sie eine entsprechende Pixelgröße aus. Verwenden Sie das Pinselwerkzeug, um die Auswahl zu verfeinern.Markieren Sie weiterhin alle Objekte von Interesse auf die gleiche Weise auf etwa 15 Bilder. Speichern Sie die annotierten Dateien, und verwenden Sie sie als Trainingssatz. Wenn der Erkennungsalgorithmus trainiert und bereit ist, verwenden Sie ihn, um Ergebnisse zu visualisieren.Wechseln Sie im Ergebnisanalyser zu Datei, gefolgt von Datei importieren. Wählen Sie dort die gewünschte Ergebnisdatei aus. Fahren Sie fort, indem Sie die Schaltfläche Diagramm erstellen drücken.Wählen Sie Verteilungsdiagramm aus. Dies zeigt die morphologische Verteilung der Kultur. Kehren Sie zum Diagramm erstellen zurück, um Sensitivitätsdiagramm auszuwählen.Anhand der angezeigten Informationen kann bestimmt werden, wie viele Zellen analysiert werden müssen, um die gewünschte Genauigkeit zu erhalten. Führen Sie Online-Messungen durch, nachdem Sie Offline-Messungen abgeschlossen haben. Für Online-Messungen können Sie die Sonde direkt an einen Bioreaktor anschließen.Nach dem Anschluss die Baugruppe richtig sterilisieren. Wählen Sie Überwachung im Dashboard aus. Es gibt eine Wiedergabe-Taste, um die Bildaufnahme zu starten, und eine Stopp-Taste, um sie zu beenden.Drücken Sie die Wiedergabetaste. Am Bioreaktor beginnen die Impfung der Kultur. Die Kamera erfasst Videos der Zellen und identifiziert sie automatisch zur Analyse.Die Überwachung liefert Online-Daten über Zellgrößen und -formen verschiedener Zellmorphologien während der gesamten Fermentation. Die Echtzeit-Ergebnisse können auf verschiedene Weise formatiert und auch zur weiteren Analyse exportiert werden. Dieses Diagramm der kumulativen Verteilungen des S.Cerevisiae Zelldurchmessers wird aus Daten erstellt, die mit dieser Technik analysiert werden.Es zeigt, dass die automatische Zellerkennung in der Lage ist, angehende und nicht aufkeimende Zellen zu unterscheiden. Die feste Kurve ist die Verteilung während eines Anbaus bei drei Stunden. Die gepunktete Kurve ist die Verteilung des gleichen Anbaus nach sieben Stunden.Die gestrichelte Kurve stellt Daten dar, die nach 13 Stunden gesammelt wurden. Die Anmerkungsprozedur ist zeitaufwändig, aber sie ist der Schlüssel, um die gewünschte Genauigkeit für die Zellenidentifikation zu erreichen. Bei diesem Verfahren kann die Echtzeitmessung für die Prozesssteuerung verwendet werden, wenn die Messzeiten kürzer sind als die Prozessdynamik.Diese Technik ebnet den Weg für die Messung der Populationsheterogenität als Prozessparameter für mikrobielle Kultivierungen von den frühen Prozessentwicklungsschritten bis zur Produktionsskala.

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Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

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