Korrekturlesen und DNA-Reparatur-Assay mit Einzel-Nukleotid-Erweiterung und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der DNA-Polymere, der Treue und der DNA-Reparatur zu beantworten, wie z. B. Korrekturlesen, Methoden und Analysen sowie bei der Definition des DNA-Reparaturpflasters. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sehr spezifisch, einfach, schnell und leicht durchzuführen ist. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie sich noch in der DNA-Replikation befinden und das Reparaturfeld möglicherweise nicht mit den massenspektrometrischen Instrumenten und der Dateninterpretation vertraut ist.

Ich denke, das Wichtigste ist, dass die visuelle Demonstration sehr wichtig ist, da wir zeigen können, wie unsere kommerziell entwickelte Massenspektrometrie für klinische Anwendungen wie Mutation und Deputation bequem für das DNA-Korrekturlesen und die Reparaturstudie angepasst werden kann. Das Verfahren wird von Rong-Syuan und Kuei-Ching Doktoranden aus meinem Labor demonstriert. Beginnen Sie diesen Vorgang mit der Vorbereitung der Grundierung und der Vorlage, wie im Textprotokoll beschrieben.

Verwenden Sie als Beispiel eine TG-Fehlanpassung des Substrats P21 mit T28 für das Korrekturlesen. Verdünnen Sie die P21-Grundierung und die T28-Schablone auf 12,5 Pikomolen pro Mikroliter mit Wasser. Übertragen Sie dann 12 Mikroliter des verdünnten Primers und 12 Mikroliter des verdünnten Templates in ein sterilisiertes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Nachdem Sie das Röhrchen fest verschlossen haben, inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang in einem abgedeckten Wasserbad mit 65 Grad Celsius. Dann 30 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad inkubieren. Legen Sie das Rohr schließlich auf Eis, um ein ordnungsgemäßes Glühen zu gewährleisten.

In ein sterilisiertes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben Sie acht Mikroliter Primer- und Template-Mischung, zwei Mikroliter 10x Korrektur-Reaktionspuffer, vier Mikroliter 4ddNTPs-Mischung und Wasser bis zu 18 Mikroliter. Schnippen Sie die Röhre, um zu mischen. Verdünnen Sie die DNA-Polymerase in eiskaltem 1x Korrektur-Reaktionspuffer auf die gewünschte Konzentration.

Lagern Sie das verdünnte Enzym immer auf Eis. Das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Substratmix auf die gewünschte Reaktionstemperatur vorwärmen. Übertragen Sie dann zwei Mikroliter der verdünnten DNA-Polymerase in die vorgewärmte Substratmischung und schnippen Sie mit dem Röhrchen, um den Inhalt zu mischen.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit Enzym und Substrat für einige Sekunden bei 3200-facher Schwerkraft bei Umgebungstemperatur, um die Komponenten der Reaktionen herunterzuschleudern. Übertragen Sie die Reaktion sofort auf einen Heizblock oder ein Wasserbad bei der gewünschten Inkubationstemperatur. Um die Reaktion zu beenden, fügen Sie ein gleiches Volumen gepuffertes Phenol hinzu und mischen Sie die Reaktion, indem Sie die Reaktion einige Sekunden lang vortexen.

Zentrifugieren Sie dann die Reaktion in einer Mikrozentrifuge bei 3200-facher Schwerkraft bei Umgebungstemperatur für fünf Minuten. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen Chloroform hinzu. Nach dem Mischen durch Vortexen für einige Sekunden zentrifugieren Sie die Probe in einer Mikrozentrifuge bei 3200-facher Schwerkraft bei Umgebungstemperatur für drei Minuten.

Die wässrige Phase in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Nachdem Sie die Reaktion fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius inkubiert haben, legen Sie das Röhrchen auf Eis. Führen Sie als Nächstes Harz zusätzlich durch, um Salzverunreinigungen in einer 384-Well-Platte zu beseitigen, wie im Textprotokoll beschrieben.

Setzen Sie die Probenplatten in den Nanoliter-Dispenser ein. Legen Sie den Matrixchip und die vorbereitete 384-Well-Platte in das entsprechende Fach. Betätigen Sie den Nano-Dispenser, um die Reaktionsprodukte auf dem Chip zu erkennen.

Drücken Sie die Run-Taste auf dem Touchscreen des Nano-Dispensers, um zu starten. Überprüfen Sie das automatisch aufgenommene Bild der Probenflecken mit Sättigungsinformationen auf dem Bildschirm, um sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen auf dem Chip etwa fünf bis 10 Nanoliter beträgt. Wiederholen Sie die Probenauffrischung, wenn das Volumen nicht ausreicht.

Bereiten Sie eine Datei im Excel-Format vor, die die erwarteten Signalinformationen für den Import enthält. Erstellen und definieren Sie einen neuen Assay im Anwendungsprogramm, indem Sie mit der rechten Maustaste auf Assay-Gruppe im Designerformat importieren klicken und die Excel-Datei auswählen. Legen Sie die Ziel-Assay-Platte über die Optionsstruktur für die Kundenprojektplatte auf der linken Seite des Bildschirms fest, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den oberen Rand der Struktur klicken und ihr einen Dateinamen geben.

Wählen Sie den 384-Well-Plattentyp aus und drücken Sie OK. Eine leere Platte wird angezeigt. Wählen Sie den entsprechenden Assay auf der linken Seite des Bildschirms aus. Weisen Sie den ausgewählten Assay für jede Position der gefleckten Probe auf dem Chip zu, indem Sie das Well markieren und mit der rechten Maustaste klicken, um Plex hinzufügen auszuwählen.

Bereiten Sie als Nächstes eine Arbeitsliste aller Tests auf dem Chip im Excel-Format ohne Kopfzeile vor. Importieren Sie die Arbeitsliste über die Option Neues Beispielprojekt hinzufügen. Ordnen Sie den Test und die Arbeitsliste jeder Position des P21T28-Assays zu und wählen Sie mit der rechten Maustaste aus.

Verknüpfen Sie das Massenspektrometer mit dem Chip über das Applikationsprogramm. Wählen Sie die Standardeinstellung auf der rechten Seite des Bildschirms aus. Geben Sie den Assay-Namen und die Chip-ID in die Ecke des Chips ein.

Speichern Sie die Einstellungen und starten Sie das MS-Steuerungsprogramm. Drücken Sie die Ein-/Aus-Taste und nehmen Sie die Scout-Platte heraus. Platzieren Sie den gefleckten Chip auf der Scout-Platte und drücken Sie die Ein-/Aus-Taste, damit der gefleckte Chip in das Massenspektrometer gelangt.

Klicken Sie auf die Schaltfläche "Erfassen" des Anwendungsprogramms, um die Massenspektrometrie zu starten und die Daten zu erfassen. Öffnen Sie das Programm für die Datenanalyse. Durchsuchen Sie den Baum der Datenbank in der oberen linken Ecke und wählen Sie die Chip-ID aus.Öffnen Sie die Datendatei auf der rechten Seite des Bildschirms.

Klicken Sie auf das Spektrumsymbol, um das Massenspektrum anzuzeigen. Um einen bestimmten Bereich von Masse über Ladung zuzuschneiden, klicken Sie mit der rechten Maustaste, um den Anpassungsdialog auszuwählen. Klicken Sie im neuen Fenster auf die x-Achse, stellen Sie die gewünschte obere und untere Grenze ein und drücken Sie OK, um den angegebenen Bereich des Spektrums anzuzeigen.

Exportieren Sie das Spektrum für die Aufzeichnung, indem Sie mit der rechten Maustaste auf "Exportieren" klicken. Wählen Sie den Dateityp JPEG aus, klicken Sie auf Ziel, wählen Sie Disc durchsuchen, geben Sie den Dateinamen ein und klicken Sie dann auf Exportieren. Verwenden Sie zur Datenquantifizierung den Cursor und klicken Sie auf den Peak, um die Peakhöhe in der oberen linken Ecke anzuzeigen.

Bei der MALDI-TOF MS besteht eine umgekehrte Beziehung zwischen der Spitzenintensität in der Oligonukleotidmasse. Oligonukleotide von 17 bis 24 Nukleotiden wurden einer MS-Analyse unterzogen. Die relativen Signalintensitäten wurden berechnet und konnten zur Quantifizierung des Korrektur- oder Reparaturassays verwendet werden.

Sowohl Template- als auch Primer-Signale konnten im Massenspektrum gefunden werden. Aufgrund von Größenunterschieden waren die Signale von Templates und deren unspezifischen partiellen Degradationsprodukten gut von den nicht übereinstimmenden Primern und Korrekturprodukten getrennt. Hier sehen Sie ein Korrekturlesen eines Terminals mit drei Primzahlen TG.At fünf Minuten, das korrigierte Produkt betrug 23 % gegenüber 17 % für das Exzisionsprodukt.

Dieser Unterschied stieg weiter auf 69 % gegenüber 14 % nach 20 Minuten. Beachten Sie die hohe Auflösung von MS, die das Sub-Straight- und das Produktsignal mit einer Massenüberladungsdifferenz von nur 32 klar trennt. Ebenfalls leicht lösbar waren zwei Formen von Exzisionsprodukten für ein ultimatives TG-Korrekturlesen mit dem Stift

Das ein Nukleotid-Exzisions-Zwischenprodukt und zwei Nukleotid-Exzisionsprodukte. Das Korrekturlesen interner Inkongruenzen zeigte einen klaren Trend zur Effizienz des Korrekturlesens. Wie ein großes Korrekturlesen von Produkten zeigt, wurde eine erhöhte Effizienz beobachtet, wenn Substraights im Vergleich zu Fehlpaarungen an den letzten, vorletzten, dritten und vierten Nukleotiden von den drei Primzahlen Fehlanpassungen aufwiesen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach diesem Verfahren können andere Anwendungen wie das Screening von Polymerkorrekturen durchgeführt werden, um neue Medikamente für die pharmazeutische Forschung zu entdecken und zu erfinden. Diese Technik ebnet auch den Weg für Forscher auf dem Gebiet der DNA-Replikation und -Reparatur, um mehr Einblick in die Medizin des Gnoms und seine originalgetreue Replikation für alle lebenden Organismen zu gewinnen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das DNA-Korrekturlesen und den Reparaturassay mit der MADI-TOF-Massenspektrometrie-Analyse durchführen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Spheno-Chloroform gefährlich sein kann und die Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. das Tragen persönlicher Schutzausrüstung, während der Durchführung des Eingriffs immer getroffen werden sollten. Das alternative Protokoll im Text könnte als sichererer Ersatz angesehen werden.