Name: Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Erfahren Sie die stereotaktische Adoptivübertragung zytotoxischer Immunzellen in murinen Modellen orthotoper humaner Glioblastoma multiforme-Xenotransplantate. Diese Methode demonstriert die Wirksamkeit zellulärer Immuntherapien bei der Behandlung von Gehirntumoren.

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Die Autoren danken die Mitarbeitern der der Universitätsklinik Tierhaus (UTE) von Nantes für Tierhaltung und Pflege, die zelluläre und tissular imaging-zentrale Einrichtung der Universität Nantes (MicroPICell) für die Bildgebung und Zytometrie Anlage (Cytocell) von Nantes für ihre kompetente technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von INSERM, CNRS Université de Nantes, Institut National du Cancer (Inka #PLBio2014-155), Ligue Nationale Contre le Cancer (AO interregionale 2017) und das Europäische Konsortium ERA-Net Transcan2 finanziert (Immunoglio). Das Team wird von der Fondation Pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118) finanziert. Diese Arbeit wurde im Rahmen des LabEX IGO realisiert und die IHU-Cesti-Programme, unterstützt von der nationalen Forschung Agentur Investissements Avenir über die Programme ANR-11-LABX-0016-01 und ANR-10-IBHU-005, bzw.. IHU-Cesti-Projekt wird auch von Nantes Metropole und der Region Pays De La Loire unterstützt. Die Autoren danken für seine Hilfe bei der Korrektur des Manuskripts Chirine Rafia.

Die folgenden Verfahren mit tierischen Themen erfolgte nach institutionellen Richtlinien (Vereinbarung #00186.02; regionalen Ethik-Kommission der Pays De La Loire [Frankreich]). Menschlichen PBMCs wurden isoliert aus dem Blut von informierten gesunden Spendern (Etablissement Français du Sang Nantes, Frankreich) gesammelt. Alle Schritte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
1. nicht-spezifische Erweiterung der zytotoxischen Effektor T-Lymphozyten
<ol><li>Bereiten und Feeder-Zellen bei 35 Gy zu bestrahlen. Die Stimulation von 2 x 105 - 4 x 105 Effektorzellen, Vorbereitung 10 x 106 PBMCs und 1 x 106 BLCLs von drei unterschiedliche, gesunden Spendern.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Feeder-Zellen und Effektorzellen in 15 mL RPMI ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten FCS, 2 mM L-Glutamin, (100 IE/mL), Penicillin und Streptomycin (0,1 µg/mL) und 300 IU/mL rekombinantes Il-2.</li>
	<li>PHA-L auf eine Endkonzentration von 1 µg/mL hinzufügen, vorsichtig mischen und 150 µL Zellsuspension pro Bohrloch in 96-Well U-Boden Platten zu verteilen.</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C und mit 5 % CO2 in eine feuchte Atmosphäre.</li>
	<li>Täglich prüfen die Platte bis großzellige Form in den Kultur-Brunnen Klumpen (~ 7 Tage).</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in einer Kultur Kolben 1 x 106 Zellen/ml in frischem Nährmedium.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Anzahl der gesamten Zelle durch zählen (2 x pro Woche) und pflegen sie auf 1 x 106 Zellen/mL in frischem Nährmedium. Hinweis: Effektor Immunzellen soll für die therapeutische Verwaltung in einen Ruhezustand (in der Regel 3 Wochen nach anfänglichen Verstärkung Reiz) vorliegen. Die Reinheit und die Reaktivität dieser Effektor-Zellen sollten vor dem in-Vivo -Injektionen (z. B. in-vitro- Tests) überprüft werden.</li>
</ol>2. präoperative Effektor Zellen Vorbereitung
<ol><li>Nach der Überprüfung der Effektor-Zellzahl, sammeln Sie die Effektorzellen in ein 50-mL-Tube durch Zentrifugieren (300 X g für 5 min). Hinweis: Um den Verlust auszugleichen, bereiten Sie ein Übermaß an Zellen (z.B. 50 x 10-6).</li>
	<li>Sorgfältig entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen in 15 mL sterile PBS und Zentrifuge für 5 min bei 300 X g Wash durchzuführen.</li>
	<li>Sorgfältig und vollständig entfernen des Überstands und dann die Zelle Pellet in 1 mL sterile PBS aufzuwirbeln.</li>
	<li>Die resuspendierte Zellen in einem 1,5 mL reaktionscup für Zentrifugation bei 300 X g für 5 min zu übertragen.</li>
	<li>Sorgfältig und vollständig entfernen des Überstands durch pipettieren langsam.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 8 µL steriler PBS per Mausklick. Hinweis: Dies ist ein entscheidender Schritt.</li>
	<li>Messen Sie das Volumen der Zellsuspension mithilfe einer Mikropipette. Ggf. sterile PBS (20 x 106 Zellen in 15 µL PBS pro Dosis) hinzufügen und vorsichtig umrühren.</li>
	<li>Überprüfen Sie, mit einer Mikropipette, das ist das Endvolumen per Mausklick zwischen 15 und 20 μl (Imperativ < 20 µL).</li>
	<li>Bewahren Sie die Zellen auf Eis bis Stereotaktische Injektion. Hinweis: mehr als 3 h Zeitpunkte wurden nicht getestet.</li>
</ol>(3) Stereotaktische Injektion
<ol><li>
Geräte-Setup
	<ol>
<li>Montieren und einen kleinen Tieren stereotaktischen Rahmen entsprechend den Anweisungen des Herstellers für die Richtigkeit der intrakraniellen Injektionen (z.B., Spritze Größe, gewünschte Lautstärke und Geschwindigkeit der Injektion) zu kalibrieren. Hinweis: Eine langsame Infusionsrate wird (d.h.2-3 µL/min) empfohlen.</li>
		<li>Installieren Sie das Material unter einer mikrobiellen Sicherheitsschrank (MSC), um die Sterilität der Instrumente zu erhalten und die Mäusen zu schützen vor Infektionen. Hinweis: statt "Isothermen Blöcke" in einem Wasserbad bei 37 ° C. Dieses System schränkt die Unterkühlung von Mäusen während der Operation. Heizkissen, die für die Post-prozessualen Pflege notwendig sind, muss während die kontinuierliche Temperaturüberwachung verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Präoperative Vorbereitung der Tiere
	<ol>
<li>Eine Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (10 mg/mL) und Xylazin (0,1 mg/mL) 10 µL/g Körpergewicht von der Maus zu betäuben.</li>
		<li>Führen Sie eine Zehe kneiftest um die komplette Anästhesie und Analgesie des Tieres sicherzustellen. Hinweis: Jede Bewegung ist ein Hinweis auf nicht-tief Analgesie und in diesem Fall ein paar Minuten sind erforderlich, bevor der Vorgang zu wiederholen.</li>
		<li>Sobald die Maus richtig betäubt ist, mit einer Schere um das Fell aus der Operationsstelle (zwischen den beiden Ohren, bis die Nase) zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Präoperative Handy Vorbereitung
	<ol>
<li>Aufschwemmen Sie die Zellen mit einer Pipette sorgfältig (mehrmals) vor jeder Injektion einer beliebigen Zelle Verklumpen zu verhindern.</li>
		<li>Zeichnen Sie sorgfältig die erforderlichen Zellvolumen der Aufhängung (15-20 µL) in der 22-G-Microsyringe, die Aspiration von Luftblasen zu vermeiden. Hinweis: Dieser Zelle be-Schritt in der Microsyringe ist wichtig, Abweichungen in der injizierten Volumina zu minimieren. Laden Sie Zellen für jede einzelne Injektion zwischen Verfahren, jede Zelle Verklumpen zu verhindern und eine gerade Anzahl von Effektor Zellen Verwaltung in der Kohorte zu gewährleisten.</li>
		<li>Legen Sie die Spritze in die angepasste Spritzenpumpe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verfahrenstechnische Betreuung
	<ol>
<li>Desinfizieren der Operationsstelle mit Tupfer getränkt in 5 % Povidon-Jod-Lösung mindestens 3 X.</li>
		<li>Legen Sie eine Schmier ophthalmologische Salbe in der Maus Augen zu verhindern jede Austrocknen der Hornhaut.</li>
		<li>Position der narkotisierten Maus auf der Stereotaktische Rahmen auf einem warmen Isothermen Block bedeckt mit einer sterilen Plastikfolie zu halten die Maus Temperatur während der Operation und die Sterblichkeit zu begrenzen. Hinweis: Der Maus Nase und Zähne sollten angemessen über die Zahn-Bar, um angemessene Atemfluss während des Verfahrens zu gewährleisten positioniert werden.</li>
		<li>Sobald die Maus über den Zahn Bar befindet, ziehen Sie das Ohr Bars fest unter der Maus Ohren um den Kopf zu immobilisieren. Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht das Trommelfell beschädigen oder die Atmung beeinträchtigen.</li>
		<li>Machen Sie einen 1-2 cm Mittellinie sagittaler Hautschnitt mit einer sterilen Schere entlang der obere Teil des Schädels von Anterior Posterior des Schädels aussetzen.</li>
		<li>Identifizieren Sie den Schnittpunkt der sagittale und koronale Nähte (Bregma) als Wahrzeichen für die Stereotaktische Lokalisierung vor der Injektion (siehe Abbildung 1) zu dienen.</li>
		<li>Legen Sie die Microsyringe über diesen Punkt.</li>
		<li>Verschieben Sie die Microsyringe 2 mm rechts seitlichen und vorderen von der Bregma 0,5 mm.</li>
		<li>Mit einem Microdrill, machen Sie ein kleines Loch in den Schädel mit einem sterilen Bohrer an den vorgegebenen Koordinaten. Achten Sie darauf, um traumatische Verletzungen des Gehirns zu vermeiden oberflächlich bleiben. Hinweis: In diesem Protokoll wurden Immunzellen innerhalb einer etablierten Tumor (eine Woche nach Tumor Zelle Injektion) injiziert. Die Haut soll wiedereröffnet (Narbe) und die Injektion erfolgt an den gleichen Koordinaten verwendet für die Tumor-Zellen-Implantation (das Loch ist in der Regel bis zu 2 Wochen nach der Injektion noch vorhanden). Koordinaten wurden ausgewählt, für die Injektion Tumor und Effektor Zellen in das Gehirn Parenchym13,14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Injektion von immun Effektorzellen
	<ol>
<li>Sorgfältig legen Sie die Microsyringe in das gebohrte Loch und bewegte sich langsam, die Nadel 3 mm nach unten in die Dura und dann rückwärts 0,5 mm bis zu einer endgültigen Tiefe von 2,5 mm vor der Injektion der Effektorzellen zu übermitteln.</li>
		<li>Führen Sie die Effektor-Zelle-Injektion bei 2-3 µL/min und überwachen Sie die Mäuse entlang der Einspritzzeit.</li>
		<li>Nach die Injektion abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nadel heraus für nur 1 mm und bewahren Sie die Microsyringe für eine weitere Minute, bevor langsam zurückziehen vollständig Microsyringe, um eine Leckage aus der Infusionsstelle zu verhindern. Hinweis: Nach dem Entfernen des Tieres aus dem stereotaktischen Gerät, sofort reinigen Sie die einspritzausrüstung für zukünftige Experimente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nachbetreuung und Follow-up von Maus
	<ol>
<li>Entfernen Sie das Tier aus der Stereotaktische Rahmen und sofort übernehmen Sie Povidon-Jod 5 % Lösung auf die Schnitt-Website und schließen Sie die Haut mit einer geeigneten chirurgischen Naht.</li>
		<li>2 % Lidocain Gel direkt auf die Wunde auftragen und 0,15 µg/g von Buprenorphin durch eine subkutane Injektion für Post-prozedurale Analgesie zu verwalten.</li>
		<li>Platz zurück gesetzt die narkotisierten Maus zu seinem Käfig oben ein Heizkissen auf 37 ° C, eine geeignete Maus Körpertemperatur aufrechtzuerhalten und eine Unterkühlung zu vermeiden. Hinweis: Separates Gehäuse ist nicht erforderlich.</li>
		<li>Überwachen Sie die Maus, bis es vollständig aus der Narkose erholt ist und in einem Gehäuse Raum übertragen. Hinweis: Bisher ist dieses Protokoll gut unterstützt, wie einige unvorhersehbare Komplikationen (< 5 % der injizierten Mäusen) aufgetreten sind.</li>
		<li>Täglich überwachen Sie die Mäuse zu und einschläfern sie, wenn Anzeichen für abnehmende Gesundheit eingehalten werden (z.B., Buckliger Haltung, eingeschränkter Mobilität, Erschöpfung oder bedeutenden Gewichtsabnahme [≥ 15 %]).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Eine adoptive Übertragung von ausgewählten einheimischen oder veränderter immun Effektorzellen stellt einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung von Tumoren, wie z. B. infiltrative Gehirntumoren, kümmert sich der Begrenzung der Reaktivität gegen nicht-transformierten Zellen15effizient, 16,17,18. Das zentrale Nervensystem, das Gehirn umfasst, hat jedoch eine besondere Immunstatus, insbesond...

Glioblastom (WHO Grad IV Astrozytom), ist die häufigste und aggressive primäre Hirntumoren bei Erwachsenen. Trotz der aggressiven Behandlungen, die Operation und Radio-Chemotherapie zu kombinieren, bleibt GBM eine extrem schlechte Prognose (mediane Überlebenszeit von 14,6 Monate und eine 2-Jahres-Mortalität > 73 %)1zugeordnet. Dies beweist, dass einige effiziente therapeutische Fortschritte in den letzten zehn Jahren2validiert worden sind. Unter den Kandidaten für die Gestaltung effektiver Therapiestrategien3,4,5werden Immuntherapien6 derzeit untersucht, um zu verfolgen und zu beseitigen sehr invasiv und Radio/Chemotherapie-resistenten tumor Zellen, für ihren wichtigen Beitrag zur schnellen und tödlichen Tumor Rezidiv7vermutet. Verschiedene mögliche immunologische Ziele wurden identifiziert und vorgeschlagenen für Immuntherapien, mit natürlichen oder modifizierten αβ oder ϒδ T-Lymphozyten wie GBM-spezifischen Tumorantigenen oder Stress-induzierte Moleküle8,9, 10. Die Möglichkeit, ausgewählte GBM-reaktive Immunzelle Effektoren verwalten stellt eine einzigartige Gelegenheit, erhöhte Mengen von Effektor Lymphozyten direkt in die Website der verbleibenden Bösartigkeit zu liefern. Um diese Strategie zu unterstützen, haben wir vor kurzem gezeigt, dass Modelle basierend auf immungeschwächte Mäuse orthotopen primären menschlichen GBM Xenotransplantate treu tragen die Entwicklung von Hirntumoren in GBM Patienten9,11rekapitulieren. Darüber hinaus wurden diese Modelle verwendet, um die starke Antitumor-Effizienz der adoptively übertragenen allogene menschlichen Vϒ9Vδ2T Lymphozyten zeigen.
Dieses Protokoll beschreibt die kritische experimentellen Schritte zur Erreichung Stereotaktische Immuntherapien von Hirntumoren, wie GBM, basierend auf die Adoptiveltern Übertragung der allogenen T-Lymphozyten. Der Artikel zeigt: (i) die Verstärkung der therapeutischen allogene immun Effektor T-Lymphozyten, wie menschliche Vϒ9Vδ2T Lymphozyten; (Ii) die Vorbereitung dieser Effektor T-Lymphozyten zur Injektion; (Iii) das Verfahren für die Stereotaktische Verwaltung innerhalb des Gehirns, in der Nähe des Tumors. Dieser Artikel enthält auch einen Einblick in das Verhalten von diese zellulären Effektoren nach Stereotaktische Injektion.
Der hier vorgestellte Therapieansatz basiert auf die Injektion von 20 x 106 Effektor Zellen pro Dosis für jedes Gehirn Tumor-tragenden immungeschwächte Maus. Ein erste in-vitro- Erweiterung Schritt ist erforderlich, große Mengen von Immunzellen produzieren. Daher unspezifische Zelle Erweiterungen werden mit Phytohemagglutinin (PHA-L) durchgeführt und allogene Feeder-Zellen bestrahlt: Blut-peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) von gesunden Spendern und Epstein-Barr-Virus EBV-transformierten B-Lymphoblastoid Zelle Linien (BLCLs), abgeleitet von PBMCs durch in-vitro- Infektion mit EBV-haltigen Kultur überstand von der Marmoset B95-8-Zell-Linie, im Beisein von 1 µg/mL Cyclosporin-A.
GBM-reaktive Effektor Immunzellen verglichen und von in-vitro- Assays9ausgewählt. Diese Effektorzellen werden aktiviert und verstärkt mit standard-Protokolle, nach ihrer Natur (z.B., menschliche Vγ9Vδ2 T-Lymphozyten-9 oder menschliche Anti-Herpes-Virus αβ T-Lymphozyten12) mit einer Mindestreinheit von > 80 %, wie routinemäßig von durchflusszytometrischen Analyse überprüft. Die Zelle Erweiterung Verfahren unten gilt für verschiedene menschliche Lymphozyten-Teilmengen.

<table><tbody><tr><td>PBMCs</td><td></td><td></td><td>von 3 verschiedenen gesunden Spendern</td></tr><tr><td>BLCLs</td><td></td><td></td><td>von 3 verschiedenen Spendern</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis</td><td>Proleukin</td><td></td></tr><tr><td>PHA-L</td><td>Sigma</td><td>L4144</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Rahmen</td><td>Stoelting Co.</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Mausadapter für stereotaktischen Rahmen&nbsp; &nbsp;</td><td>Stoelting Co.</td><td>51624</td><td></td></tr><tr><td>Pump-Injektor für Mikrospritzen&nbsp;</td><td>WPI</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil Spritze</td><td>WPI</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>NSG Mäuse</td><td>Charles River</td><td>NSGSSFE07S</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Merial</td><td>Imalg&egrave; ne 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer</td><td>Rompur 2%</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>WPI</td><td>201758</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>WPI</td><td>501215</td><td></td></tr><tr><td>OmniDrill 115/230V</td><td>WPI</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP397H</td><td></td></tr><tr><td>Xylocain</td><td>Astrazeneca</td><td>3634461</td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaktische adoptiv Übertragung von zytotoxischen immunzellen in murinen modellen der orthotopen human glioblastoma multiforme xenotransplantate

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma Multiforme (GBM), der häufigsten und aggressive primäre Hirntumoren bei Erwachsenen, ist in der Regel verbunden mit einer schlechten Prognose und knappen effiziente Therapien wurden in den letzten zehn Jahren vorgeschlagen. Unter den vielversprechenden Kandidaten für neue therapeutische Strategien zu entwerfen zelluläre Immuntherapien haben sehr invasive Beseitigung gezielt und Chemo-radioresistenten Tumorzellen, wahrscheinlich in eine schnelle und tödliche Rückfall dieses Krebses beteiligt. So Zwecke der allogenen GBM-reaktive Immunzelle Effektoren, wie menschliche Vϒ9Vδ2 T-Lymphozyten, in der Nähe des Tumors würde stellt eine einzigartige Gelegenheit, effizient zu liefern und hochkonzentrierten therapeutischer Wirkstoffe direkt in die Website des Gehirns Malignome. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine präklinischen Proof-of-Concept für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von diesen zellulären Immuntherapien, die Stereotaktische Injektion von allogenen menschlichen Lymphozyten innerhalb Intrabrain Tumor Betten abhängen.

Diese Studie beschreibt die Strategie der Adoptiveltern Übertragungen von zellulären immun Effektorzellen in das Gehirn von Tumor-tragenden Mäusen, basierend auf Stereotaktische Injektionen direkt in das tumorbett durchgeführt.
Um jedes Risiko von Hirn-Trauma, verbunden mit einem großen Injektionsvolumen zu minimieren, muss die Zellsuspension Effektor (20 x 106 Zellen in 15-20 µL PBS) konzentriert werden. Um zu überpr...

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine Machbarkeitsstudie für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von zellulären Immuntherapien Intrabrain geliefert.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

Das Glioblastoma multiforme ist nach wie vor der häufigste und aggressivste primäre Hirntumor bei Erwachsenen. Trotz aggressiver Behandlungen, die auf einer Operation mit anschließender Radio- und Chemotherapie basieren, ist GBM mit einer extrem schlechten Prognose und einem medianen Überleben von weniger als 15 Monaten verbunden. Da in den letzten zehn Jahren nur wenige therapeutische Fortschritte erzielt wurden, werden derzeit zelluläre Immuntherapien erforscht, um hochinvasive und resistente GBM-Zellen zu eliminieren, die wahrscheinlich an einem schnellen Tumorrückfall beteiligt sind.Die Verabreichung ausgewählter GBM-reaktiver zytotoxischer Immunfaktoren in der Nähe des Tumors könnte eine einzigartige Möglichkeit darstellen, eine konzentrierte zelluläre Immuntherapie direkt an die Stelle der Restmalignität zu verabreichen. Unsere Gruppe konnte kürzlich zeigen, dass immundefiziente NSG-Mäuse, die orthotope primäre humane GBM-Xenotransplantate tragen, GBM rekapitulieren, um sich bei Patienten weiter zu entwickeln. Diese GBM-Modelle wurden verwendet, um die Wirksamkeit zytotoxischer Immuneffektoren bei intratumoralen Injektionen zu bewerten.Dieses Protokoll beschreibt unseren therapeutischen Prozess, der zunächst auf der Isolierung und Amplifikation von GBM-reaktiven Immuneffektorzellen basiert. Zweitens die Vermehrung dieser Effektorzellen für die interkranielle Injektion. Und drittens ihre stereotaktische Injektion an die Tumorstelle im Gehirn der Maus.Auch das Verhalten des Immuneffektors nach orthotopischer Injektion wurde untersucht. Drei Wochen nach der Stimulation des PHA-Fötus sollten die Effektorzellen, die am Boden des Kolbens Zellklumpen bilden, in den Ruhezustand zurückgekehrt sein und bereit sein, verwendet zu werden. Nachdem Sie die Anzahl der Effektorzellen überprüft haben, resuspendieren und sammeln Sie die Zellen in einem 115-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie.Entfernen Sie vorsichtig und vollständig einen Überstand. Und resuspendieren Sie die Zellen in sterilem PBS und zentrifugieren Sie, um sie zu waschen. Nehmen Sie den Überstand vorsichtig und vollständig ab.Und dann resuspendieren Sie Zellen in einem Milliliter sterilem PBS. Übertragen Sie die Zellen zur Zentrifugation in ein Mikroröhrchen. Nehmen Sie den Überstand wieder vorsichtig und vollständig ab, indem Sie langsam pipettieren.Der nächste Schritt ist entscheidend: Die Zellen werden in der Hälfte des endgültigen Volumens von sterilem PBS resuspendiert und sanft und vorsichtig homogenisiert. Überprüfen Sie das endgültige Volumen mit einer Mikropipette, das endgültige Volumen pro Maus muss zwischen 15 und 20 Mikroliter für 20 Millionen Zellen liegen. Stellen Sie sicher, dass es 20 Mikroliter pro Maus nicht überschreitet.Halten Sie die Zellen bis zur Injektion auf Eis. Stellen Sie sicher, dass das Tier durch eine Zehenklemme ausreichend betäubt wird, und entfernen Sie dann das Fell von der Operationsstelle, zwischen den beiden Ohren und bis zur Nase. Resuspendieren Sie die Zellen langsam, um ein Verklumpen der Zellen zu verhindern, und legen Sie die Zellensuspension mit großer Sorgfalt in die Spritze, um das Vorhandensein von Blasen zu vermeiden.Legen Sie dann die Spritze in die angepasste Spritzenpumpe. Desinfizieren Sie die Operationsstelle mit Salz und Povidon-Jod-5%-Lösung und geben Sie eine befeuchtende Augensalbe in die Augen der Maus, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Positionieren Sie dann die betäubte Maus auf dem stereotaktischen Rahmen auf einem warmen Block.Positionieren Sie die Nase und die Zähne der Maus entsprechend über dem Zahnsteg. Ziehen Sie die Ohrstangen fest in den Mausohren an, um den Kopf ruhig zu stellen. Achten Sie darauf, das Trommelfell nicht zu beschädigen, die Atmung nicht zu beeinträchtigen und sicherzustellen, dass der Kopf gut immobilisiert ist.Machen Sie mit einer sterilen Schere einen sagittalen Hautschnitt in der Mittellinie, um den Schädel freizulegen. Identifizieren Sie den Schnittpunkt der sagittalen und koronalen Strukturen, die als Orientierungspunkte für die stereotaktische Lokalisation dienen, und platzieren Sie die Spritze über diesem Punkt. Bewegen Sie die Spritze an vorgegebenen Koordinaten.Zwei Millimeter rechts seitlich und 0,5 Millimeter vor dem Schädel Mit einem Mikrobohrer mit einem sterilen Bohrer ein kleines Loch in den Schädel bohren. Achten Sie darauf, oberflächlich zu bleiben, um Hirnverletzungen zu vermeiden. Führen Sie die Spritze vorsichtig in das Bohrloch ein.Bewegen Sie die Nadel langsam drei Millimeter nach unten in der Dura und dann 0,5 Millimeter zurück bis zu einer endgültigen Injektionstiefe von 2,5 Millimetern. Führen Sie die Zellinjektion mit zwei oder drei Mikrolitern pro Minute durch und überwachen Sie die Mäuse während der gesamten Injektionszeit. Sobald die Injektion abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nadel nur einen Millimeter zurück und lassen Sie die Spritze eine weitere Minute lang an Ort und Stelle, bevor Sie die Spritze langsam vollständig zurückziehen, um ein Auslaufen an der Infusionsstelle zu verhindern.Nehmen Sie das Tier vorsichtig aus dem stereotaktischen Rahmen. Verschließen Sie die Haut mit einer geeigneten chirurgischen Naht und tragen Sie 2%iges Lidocain-Gel direkt auf die Wunde auf. Übertragen Sie die anästhesierte Maus in den entsprechenden Käfig über dem Heizkissen, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, um die Körpertemperatur der Maus bis zur vollständigen Genesung aus der Narkose aufrechtzuerhalten.Da die Suspension sehr konzentriert ist, wurden die Lebensfähigkeit und Reaktivität der Zellen überprüft. Effektorzellen wurden in eine Spritze geladen, um eine In-vivo-Injektion nachzuahmen. Die Zellen wurden sofort oder 10 Minuten später entnommen und mittels Durchflusszytometrie für die Propidiumiodid-Färbung analysiert.Wie Sie sehen können, hatten die Vorbereitung und die Beladung keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Effektorzellen nach 24 Stunden. Die Reaktivität gegen Glioblastom-Tumorzellen wurde ebenfalls entweder mit unpräparatierten Zellen oder präparierten Effektoren überprüft und blieb drei Stunden auf den Augen. Die Reaktivität wird durch positive Färbung des Aktivierungsmarkers CD107A überwacht.Diese Ergebnisse zeigen, dass die Reaktivität der Effektorzellen durch das Präparat nicht beeinflusst wurde. Sieben Tage nach der Injektion der Effektorzellen wurden die Gehirne der Mäuse gesammelt, geschnitten und auf hämatische Färbung hin gefärbt, um die Tumorstruktur identifizieren zu können. Dann ermöglichte die Anti-Human-CD3-Färbung die Lokalisierung von Effektorzellen.Interessanterweise wurden Effektorzellen um den Tumor herum und im Tumorkern, aber auch in der kontralateralen Hemisphäre gefunden. Humane Effektor-T-Zellen, die 48 Stunden nach der Injektion aus dem Gehirn von Mäusen isoliert wurden, machen 2 % der Gehirnzellen aus. Sie waren immer noch in der Lage, sich in Gegenwart von PHA, Feedern und IL2-Stimulation zu vermehren, mit einer Reinheit von 99% nach der Amplifikation.Dank dieses Protokolls können ruhende menschliche Effektorzellen überleben und nach der stereotaktischen Injektion mehrere Tage lang mit einem Maus-Hirnparenchym patrouillieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der adoptive Transfer von humanen Effektorzellen durch stereotaktische Injektionen vielversprechende Ansätze zur effizienten Behandlung von infiltrativen malignen Hirntumoren mit begrenzten schädlichen Auswirkungen auf gesunde Zellen darstellt. Dieser Verabreichungsweg nutzt den Vorteil, dass menschliche Zellen nahe an der Tumorstelle abgegeben werden, wodurch ihre Verdünnung im Gewebe und im Organismus begrenzt wird.Hier haben wir das Verfahren beschrieben, nachdem eine große Anzahl von Immunzellen in den Hirntumor eingebracht wurde, ohne schädliche Auswirkungen auf die Effektorzellen und vor allem ohne sichtbare schädliche Auswirkungen auf Mäuse. Darüber hinaus sind lokal injizierte Immunzellen im Gehirn von Mäusen nicht nur in der Lage, zu überleben und ihre Fähigkeit zu behalten, ex vivo aktiviert und amplifiziert zu werden, sondern auch disseminierte Tumorzellen im umgebenden Hirngewebe zu eliminieren und zu eliminieren. Zusammengenommen sind diese Merkmale unerlässlich, um die Eliminierung stark infiltrativer Tumorzellen zu ermöglichen, die GBM-Tumoren charakterisieren.Dieses Protokoll eröffnet neue Möglichkeiten für die Etablierung eines adoptiven Transferverfahrens im Mausmodell für Hirntumore. Wesentlicher Schritt, bevor Sie klinische Zöliakie in Betracht ziehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben eine integrierte Methode für die präzise, ​​stereotaktische Implantation von humanen Glioblastom multiforme Zellen in den Gehirnen von Nacktmäusen und anschließende...

Stereotaktische Intrakranielle Implantation und<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging der Tumorxenotransplantaten in einem Maus-Modell-System des Glioblastoma multiforme

Dieses Video demonstriert eine stereotaktische Injektionstechnik zur Verabreichung von menschlichen Effektor-T-Lymphozyten in ein Mausmodell, das einen menschlichen Hirntumor trägt. Nach der Positionierung einer tumortragenden anästhesierten Maus auf einem stereotaktischen Rahmen und der Schaffung eines Bohrlochs an der Injektionsstelle am Schädel werden Effektor-T-Lymphozyten an der Tumorstelle injiziert.

Verabreichung von Effektor-T-Lymphozyten an Mäuse, die menschliche Hirntumoren tragen

Maligne Gliome bilden eine heterogene Gruppe hochinfiltratischer gliaaler Neoplasmen mit ausgeprägten klinischen und molekularen Merkmalen. Primäre orthotopische Xenografts rekapitulieren die histopathologischen und molekularen Merkmale bösartiger Gliom-Subtypen in präklinischen Tiermodellen.

Primäre orthotopische Glioma Xenografts rekapitulieren infiltratives Wachstum und Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Phänotypische Wildtyp-Astrozyten und neurale Stammzellen, die von Mäusen entnommen wurden, die mit floxierten, bedingten onkogenen Allelen gezüchtet und über virale Cre-vermittelte Rekombination transformiert wurden, können zur Modellierung der Astrozytom-Pathogenese in vitro und in vivo durch orthotope Injektion von transformierten Zellen in Gehirne von syngenen, immunkompetenten Wurfgeschwistern verwendet werden.

Modellierung Astrozytom Pathogenese In-vitro- Und In Vivo Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse

Das Gehirn ist ein einzigartiger Ort mit Eigenschaften, die nicht gut durch in vitro-oder Eileiter Analysen dargestellt. Orthotopen Mausmodellen mit reproduzierbaren Lage und Wachstumseigenschaften zuverlässig mit intrakraniellen Injektionen mit einem stereotaktischen Fixierung Instrument und eine Niederdruckspritzenpumpe erzeugt werden.

Erstellen Anatomisch genaue und reproduzierbare intrakranielle Xenografts der Menschen Hirntumoren

Die lymphodepletiven und immunmodulatorischen Effekte von Chemotherapie und Bestrahlungsstandard können genutzt werden, um die Antitumorwirksamkeit der T-Zell-Immuntherapie zu verbessern. Wir skizzieren eine Methode zur Erzeugung von EGFRvIII-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen und deren Verabreichung im Rahmen der Glioblastom-Standardtherapie.

Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Tumor-Suche nach therapeutischen mesenchymaler Stammzellen (MSCs) vielversprechend zur Behandlung von invasiven Glioblastom. Optimale Transplantation umfasst Lieferung von MSCs in den Tumor Resektion Hohlraum auf Gerüsten. Hierbei sind präklinische Techniken, MSC Behandlung des Glioblastoms zu studieren vorgesehen, einschließlich: bildgebende Tumor Resektion; Implantation von MSC ausgesät Gerüste; und postoperative Therapie verfolgen.

Bildgestützte Resektion der Glioblastom und intrakraniellen Implantation von therapeutischen Stammzellen entkernt Gerüste

In dieser Arbeit beschreiben wir ein präklinisches orthotopes Mausmodell für GBM, das durch intrakranielle Injektion von Zellen aus gentechnisch veränderten Mausmodelltumoren etabliert wurde. Dieses Modell zeigt die Krankheitsmerkmale des humanen GBM. Für translationale Studien wird der Hirntumor der Maus mittels In-vivo-MRT und Histopathologie verfolgt.

Translationale orthotope Modelle des Glioblastoma multiforme

Die Entwicklung von orthotopen pädiatrischen Hirntumormodellen erfordert akribische Präzision, bei der Krebszellen mit einem stereotaktischen Gerät präzise implantiert werden. Die hier vorgestellte Methodik beschreibt die Schritte bei der Vorbereitung von Hirntumorzellen, der Durchführung intrakranieller Injektionen und der Implementierung eines postoperativen Überwachungssystems zur Beurteilung der Hirntumortransplantation.

Etablierung von orthotopen patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen für Hirntumoren mit Hilfe eines stereotaktischen Geräts

Das Glioblastom ist eine verheerende Form des primären Hirntumors, und die interstitielle Laser-Wärmetherapie entwickelt sich zu einer vielversprechenden Alternative zur konventionellen chirurgischen Resektion bei inoperablen Glioblastomen. Dieses Protokoll beschreibt ein optimiertes präklinisches Mausmodell, das zur Untersuchung von Behandlungseffekten oder adjuvanten und kombinatorischen Behandlungen verwendet werden kann.

Ein immunkompetentes Mausmodell für die interstitielle Laser-Wärmetherapie des Glioblastoms

Ziel dieses Protokolls ist es, Forschern eine hochgradig reproduzierbare Technik für intrakranielle Implantationen bereitzustellen.

Stereotaktische intrakranielle Implantation von Glioblastom-Patienten-abgeleiteten Xenograftzelllinien bei Mäusen

Erfahren Sie die stereotaktische Adoptivübertragung zytotoxischer Immunzellen in murinen Modellen orthotoper humaner Glioblastoma multiforme-Xenotransplantate. Diese Methode demonstriert die Wirksamkeit zellulärer Immuntherapien bei der Behandlung von Gehirntumoren.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate (Video) | JoVE Journal

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

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