Name: In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Lernen Sie die Isolation kaniner Neutrophilen aus Blut und die Visualisierung von NET-Bildung mittels Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse von citrulliniertem Histon H3.

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Der korrespondierende Autor wurde von Morris Animal Foundation (D15CA-907) finanziert. Die Studie wurde unterstützt durch Mittel aus der University of California, Davis, Zentrum für Pferdegesundheit und Center for Companion Animal Health (2016-24-F). Die Autoren möchten Geena Ng für ihre Unterstützung bei der Figuren und Nghi Nguyen für ihre Hilfe mit dem Video zu erkennen.

Alle hier beschriebene Methoden wurden durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der University of California, Davis genehmigt (Protokoll Nummer: 18338).
1. Blutentnahme
<ol><li>Ziehen Sie 10 mL Blut aus entweder der cephalic oder Vena Ader mit einer Nadel 21 G durch Spritze absaugen.</li>
	<li>Um übermäßige Schubspannung zu vermeiden, entfernen Sie die Nadel von der Spritze vor der Übertragung von Blut in Tube(n) mit Natrium Heparin (75 USP). Die Rohre invertieren sanft ein paar Mal um ausreichende Vermischung von Antigerinnungsmittel und Blut zu gewährleisten. Fragen Sie nach belegen Klumpen oder Erythrozyten Aggregate, bevor Sie die Proben auf Eis legen.</li>
</ol>(2) Neutrophilen Isolation
<ol><li>Verdünnen Sie Anticoagulated Blut mit ein gleiches Volumen an eiskaltem Dubecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (pH 7.4, ohne zweiwertigen kationen). Übertragen Sie 8 mL verdünnte Blut in ein 50 mL Polypropylen konischem Rohr mit 25 mL 3 % Dextran (von Leuconostoc spp. in 0,9 % Natriumchlorid-Lösung aufgelöst). Legen Sie das Rohr aufrecht bei Raumtemperatur für 30 min, Aggregation und Sedimentation der Erythrozyten zu ermöglichen.</li>
	<li>Sorgfältig Schicht 5 mL Leukozyten-Rich Plasma (Abbildung 1) auf der Oberseite 5 mL Dichte Gradienten Medien in einem 14 mL Polypropylen Rundboden Röhrchen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die 2 Lösungen11mischen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 400 X g mit Beschleunigung/Verzögerung (A/D) Wert 0 (keine Bremse) für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Mit einer 5 mL serologische pipettieren Sammeln der Granulozyten Zellschicht durch Umgehung der Plasma und peripheren mononukleären Zellen (PBMC) Schichten (Abbildung 1). Verwenden Sie eine neue pipettieren jedes Mal um Kontamination zu minimieren.</li>
	<li>Platz 4 bis 6 mL von der Polymorphnuclear (PMN) Zellschicht in ein 50 mL Polypropylen konischem Rohr. Da eine kleine Menge der Erythrozyten Aggregate zusammen mit dem PMN-Layer abgesaugt werden kann, verwenden Sie eine 1 mL serologische pipettieren, entfernen Sie vorsichtig die Erythrozyten-Aggregate, die an der Unterseite des Rohres ausgeglichen werden.</li>
	<li>Lösen Sie die verbleibenden Erythrozyten mit 20 mL kalte Reinstwasser. Invertieren Sie sanft das Rohr mehrmals für 30 bis 60 s angemessene Lyse bevor Sie hinzufügen ein gleiches Volumen an eiskaltem 1,8 % Natriumchlorid-Lösung zu gewährleisten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 112 X g für 10 min bei 4 ° C, A/D auf 0 gesetzt.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Erythrozyten Lyse Schritt, wenn dieser Pellet rot angezeigt wird. Verwerfen des Überstands vorsichtig mit einer serologischen pipettieren und sanft Aufschwemmen das Pellet in 100 µL des DPBS (5 mM Traubenzucker, 0,9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2 und 1 % Rinderserumalbumin, pH 7,3). Kombinieren Sie alle resuspendierte Zellen zu und auf Eis.</li>
	<li>Führen Sie einer Zellzahl mit einer automatisierten Zelle-Analyzer und überprüfen Sie die Anzahl die durch eine Hemocytometer. Bei Bedarf konzentrieren Sie PMNs auf einen Objektträger mit einer Cytocentrifuge (1.000 u/min, 5 min) und bestimmen Sie den Anteil der Neutrophilen durch zählen der Anzahl der Neutrophilen aus der Gesamtzahl der Zellen zu.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Neutrophilen durch einen Trypan blau Ausschluss Test wie beschrieben durch Strober Et al. 12 erfolgreiche Isolierung sollte eine Tragfähigkeit von 95 zu 100 % Ausbeute und Neutrophilen sollte mehr als 95 %.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentration von Neutrophilen Granulozyten durch Multiplikation der gesamten Zellenzahl mit die prozentuale Rentabilität und Prozent Neutrophilen. Erfolgreiche Isolierung sollte eine Konzentration von Neutrophilen von 1,5 6 x 106/mL nachgeben.</li>
	<li>Verdünnen Sie Neutrophile, eine Endkonzentration von 1 x 106/mL mit DPBS mit 0,9 mM MgCl2, 5 mM Traubenzucker, 1,9 mM CaCl2und 1 % Rinderserumalbumin mit pH 7.3 angepasst.</li>
</ol>(3) Fluoreszenz Mikroskopie der Live Neutrophilen
<ol><li>Platz 200 bis 400 μl der Neutrophilen (1 x 106/mL) in jede Vertiefung eine Poly-L-Lysin beschichtet Kultur 12-Well-Platte. Neutrophile, auf den Boden der Näpfchen zu halten, indem die Zellen bei 37 ° C für 30 min Inkubation zu ermöglichen.</li>
	<li>Beschriften Sie Nukleinsäuren mit 1 μM eines zwei Nukleinsäure-Farbstoffe, die in den Zellen mit intakten Membranen Flecken und die Flecken in Zellen mit durchlässigen Membranen (siehe Tabelle der Materialien), für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Aktivieren von Neutrophilen mit 100 μg/mL Lipopolysaccharid (LPS) (E. Coli O55. (B5), 100 nM Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) als Positivkontrolle oder gleichwertigem Umfang des DPBS als Negativkontrolle für 180 min bei 37 ° C.</li>
	<li>Abrufen von Bildern mit der GFP (Anregung: 470/22 nm, Emission: 525/50 nm) und Texas Red-Kanäle (Anregung: 585/29 nm, Emission: 628/32 nm) auf ein Fluoreszenz-Mikroskopie bei 40 X Vergrößerung zu den folgenden Zeitpunkten: 30, 90, 120 oder 180 Minuten.</li>
</ol>4. Netto-Quantifizierung und Erkennung von NET-Komponenten mit Immunfluoreszenz
<ol><li>Legen Sie vorsichtig 18 mm Durchmesser Poly-D-Lysin beschichtet Deckel rutscht in die Vertiefungen einer Kultur 12-Well-Platte. Beschriften Sie die Brunnen entsprechend.</li>
	<li>Samen 100 bis 200 μL der Neutrophilen (1 x 106/mL) direkt auf den Deckgläsern isoliert und Neutrophilen zur Einhaltung des Deckel rutscht durch Inkubation der Zellen bei 37 ° C für 30 min ermöglichen.</li>
	<li>Neutrophilen zu aktivieren, wie in 3.3 beschrieben. Hemmen Sie NET Bildung von Neutrophilen mit 200 µΜ Vorbehandeln Cl-Amidine (15 min, 37 ° C) vor der Aktivierung wie oben beschrieben von Li Et Al. 13 stellen Sie sicher, dass die ordnungsgemäße Fahrzeugkontrolle (DMSO) in das Experiment enthalten ist.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Abdeckung rutscht mit feinen Pinzette. Schicht eine Paraffin-Film-Blatt über ein Reagenzglas stehen seichte Brunnen erstellen und geben Sie 2 bis 3 Tropfen 4 % PFA in jeweils gut10. Beschriften Sie die Brunnen entsprechend und legen Sie sanft das Deckel rutscht kopfüber auf die PFA-gefüllte Vertiefungen. Können Sie Zellen bei Raumtemperatur für 20 min behoben werden.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 3 Mal in DPBS für 5 min, indem Sie sie aus einem Brunnen zum nächsten verschieben.</li>
	<li>Wenn Immunolabelling kurz nach der Neutrophilen Aktivierung und Fixierung durchgeführt werden kann, ermöglichen Sie Deckel rutscht luftgetrocknet, indem der Deckel rutscht nach oben auf ein Stück Papier Extinktion zu sein. Deckel rutscht kann bis zur weiteren Analyse bis zu 1 Woche aufgedeckt in einer beschrifteten 12-Well-Kultur-Platte bei 4 ° C aufbewahrt. Waschen Sie die Zellen 3 Mal in DPBS für 1 min mit der gleichen Technik wie unter 4.4 bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	<li>Um Zellen permeabilize, sanft lag das Deckglas auf den Kopf gestellt auf einen Rückgang von 1 % NP-40 für 1 min mit der Technik in 4.4 beschrieben. Waschen Sie 3 mal 1 min auf einer Wippe in DPBS.</li>
	<li>Nach dem Zufallsprinzip eine Reihe weisen Sie jede Probe zu und verwenden Sie eine Diamant-Markierung, um den Deckgläsern entsprechend zu kennzeichnen.</li>
	<li>Bereiten und Label individuelle Petrischalen mit Paraffin Film ausgekleidet und legen 100 bis 200 μL der 5 % ziegenserum auf den Film (blocking-Puffer). Legen Sie die Deckgläsern kopfüber auf den blockierenden Puffer. Legen Sie auf einer Wippe und 1 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal für 5 min auf einer Wippe in DPBS.</li>
	<li>Verdünnen Sie den primären Antikörper (1: 400 Kaninchen polyklonale Anti-citrullinierte Histon H3 (citH3) in 5 % ziegenserum). Inkubieren Sie Zellen in beschrifteten Petrischalen mit Paraffin Film ausgekleidet. Legen Sie jedes Deckglas kopfüber auf 50 bis 100 μL der verdünnten Antikörper-Lösung. Legen Sie auf einer Wippe und 1 h bei 37° c inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal für 5 min auf einer Wippe in DPBS.</li>
	<li>Verdünnte Sekundärantikörpers konjugiert zu einem Fluorophore (1: 200) in 5 % ziegenserum. Inkubieren Sie Zellen in beschrifteten Petrischalen mit Paraffin Film ausgekleidet. Legen Sie jedes Deckglas kopfüber auf 50 bis 100 μL der verdünnten Antikörper-Lösung. Legen Sie auf einer Wippe und inkubieren Sie 1 h bei 37 ° C im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal in DPBS für 5 min auf einer Wippe in die Dunkelheit.</li>
	<li>Für die gleichzeitige Erkennung von Myeloperoxidase (MPO) die folgenden Schritte für eine modifizierte Doppel Immunolabeling Protokoll wie von Li Et Al. beschrieben 13
</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen in beschrifteten Petrischalen mit Paraffin Film ausgekleidet. Legen Sie jedes Deckglas kopfüber auf 100 bis 200 μl 10 % Kaninchen Serum unter sanftes Schaukeln (Übernachtung, 4 ° C, im Dunkeln).</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal in DPBS für 5 min auf einer Wippe in die Dunkelheit.</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen in 50 μg/mL unconjugated Ziege Anti-Kaninchen-Fab für 2 h bei Raumtemperatur auf einem Rocker im Dunkeln Fragmente.</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal in DPBS für 5 min auf einer Wippe in die Dunkelheit.</li>
	<li>Verdünnen Sie Primärantikörper (1: 200 Kaninchen polyklonale Anti-Human MPO Antikörper) in 5 % ziegenserum. Inkubieren Sie Zellen in beschrifteten Petrischalen mit Paraffin Film ausgekleidet. Legen Sie jedes Deckglas kopfüber auf 50 bis 100 μL der verdünnten Antikörper-Lösung. Legen Sie auf einer Wippe und inkubieren Sie 1 h bei 37° C im Dunkeln.</li>
	<li>Verdünnen Sie Sekundärantikörpers konjugiert zu einem Fluorophor in 5 % ziegenserum und inkubieren Sie wie beschrieben in 4,8</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal in DPBS für 5 min auf einer Wippe in die Dunkelheit.</li>
	<li>Interferenz-Steuerelemente sollten bereit sein, durch den Ausschluss Inkubation mit beiden primären Antikörper in einem zweiten Schritt immun-Kennzeichnung.</li>
	<li>Fleck DNA mit 300 nM 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) für 5 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal in DPBS für 1 min auf einer Wippe in die Dunkelheit.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen (~ 50 μl) der antifade Eindeckmedium auf einen Objektträger. Klopfen Sie leicht den Rand das Deckglas auf einem Küchenpapier entfernen überschüssigen Puffer vor der Montage das Deckglas mit den Zellen auf den Kopf gestellt. Das Eindeckmittel sollte eine dünne Schicht zwischen dem Deckglas und der Objektträger bilden. Um Luftblasen zu entfernen, drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas mit feinen Pinzette.</li>
	<li>Lassen Sie Proben im Dunkeln bei 4 ° c über Nacht heilen Das Eindeckmittel sollte für die mikroskopische Analyse mit Immersion Linsen verhärten. Proben in 4 ° C im Dunkeln aufbewahren.</li>
</ol>(5) Neutrophilen extrazelluläre Trap Quantifizierung
<ol><li>Blenden Sie die Ortbestimmung erwerben und analysieren die Mikroskop-Bilder zu den experimentellen Bedingungen.</li>
	<li>Mit dem Fluoreszenzmikroskop bei 40 X Vergrößerung, nehmen Sie 10 Bilder nach dem Zufallsprinzip aus verschiedenen Regionen von jedem Deckglas in einem Experiment unter den jeweiligen Kanälen. Stellen Sie sicher, dass die Belichtungszeit, Helligkeit und Kontrast der einzelnen Kanäle innerhalb der Aufnahme von Bildern konsistent gehalten werden.</li>
	<li>Analysieren Sie die Bilder mit verfügbaren Software wie ImageJ (NIH). Identifizieren Sie Netze basierend auf Co Lokalisierung von Blut, citH3 und MPO (Abb. 3A, B). Die Anzahl der Netze und Neutrophilen Granulozyten in 10 ZUFALLSFELDER für jede experimentelle Bedingung zu quantifizieren. Zahlen der Netze freigegeben als Verhältnis ausgedrückt werden kann (Anzahl der Netze: Gesamtzahl der Neutrophilen) für jede experimentelle Bedingung.</li>
	<li>Um die Behandlung Auswirkungen auf die intrazelluläre citH3 Ausdruck zu bewerten, zu zählen, die Zahl der Neutrophilen mit intrazellulären citH3 und Anzahl der Neutrophilen ohne intrazellulären citH3 in 10 ZUFALLSFELDER bei 40 X Vergrößerung unter den jeweiligen Kanälen ( Abbildung 3, rote Pfeile). Intrazelluläre citH3 Ausdruck kann als das Verhältnis der Zahl der Neutrophilen mit intrazellulären citH3 die Zahl der Neutrophilen ohne intrazelluläre citH3 ausgedrückt werden.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, um die Änderungen in Kernen Konformation und Blut Release in lebenden Hunde Neutrophilen mit einer Zelle permeationsfähigen Färbung und eine Zelle impermeant Farbstoff zu beobachten. Der Hauptvorteil dieser Assay ist, dass es für Echtzeit-Erkennung von Netto Bildung durch hochauflösende Mikroskopie in live Neutrophilen ohne Fixierung der Zelle, daher bietet eine einfache und wertvolles Instrument für die Beobachtung von in-vitro- NET Bildung. Da dieser Test keine Antikörper ...

Neutrophile sind kurzlebige Granulozyten verantwortlich für die anfängliche Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger. Neutrophile, an den Ort der Infektion, rekrutiert beseitigen Mikroorganismen durch Phagozytose, Degranulation und Generierung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-1. In Anwesenheit von Bakterien oder Endotoxine verziert neutrophile Release Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen (Netze), bestehend aus extrazellulären Chromatin mit Histonen und granulare Proteine wie Elastase und Myeloperoxidase (MPO)2. Zwar Netze unverzichtbar antimikrobielle Eigenschaften, Erhöhung der experimentellen und klinischen Beweis schlägt vor, dass übereifrige NET Bildung bei Sepsis zu mehreren Organ Dysfunktion und Tod3,4, führen kann 5 , 6.
Da Netze eine ähnliche pathophysiologische Rolle bei Hunden spielen dürfen, können therapeutische Interventionen, die entweder verhindern oder verringern Netto Bildung als neue Behandlungsstrategien bei septischen Tieren dienen. Aus diesem Grund gibt es eine Notwendigkeit für eine zuverlässige Technik zu bewerten und zu quantifizieren, NETosis und NET-Komponenten bei Hunden. NET-Komponenten einschließlich zellfreie DNA (Blut) und Nukleosomen wurden zuvor im eckzahn Neutrophilen und Plasma von klinischen Hunde7,8,9bewertet. Mit Fluoreszenz-Assays, festgestellt Goggs und Letendre, dass septische Hunde höhere Niveaus von Blut als gesunde Hunde8 haben. Obwohl diese Techniken sehr objektiv und quantitative sind, ist Messung von Blut und Nukleosomen als Marker für NETosis unspezifisch, da sie von nekrotischen Zellen außer NETosing Neutrophilen abgeleitet werden können. Hier beschreiben wir eine Technik, die Fluoreszenz-Mikroskopie untersuchen die Verhalten von live NETosing Neutrophilen nutzt. Wir beschreiben auch ein modifiziertes Protokoll mit Doppel-Immunolabeling, um Netze und deren Komponenten wie MPO und citH3 in eckzahn neutrophile10subjektiv zu quantifizieren.

<table><tbody><tr><td>Dextran aus Leuconostoc spp.</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>Molekulargewicht 450.000 &ndash; 650.000</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Life Sciences</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1285801</td><td>mit zweiwertigen Kationen</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td>Ohne zweiwertige Kationen</td></tr><tr><td>E. coli O55:B5</td><td>InvivoGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Fluoreszierender Nukleinsäure-Farbstoff</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11368</td><td>5 mM in DMSO; Färbemittel in Zellen mit durchlässigen Membranen</td></tr><tr><td>SYTO Green 16 Fluoreszierender Nukleinsäure-Farbstoff</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7578</td><td>1 mM in DMSO; Färbungen in Zellen mit intakten Membranen</td></tr><tr><td>Surface-Amps NP-40</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin-beschichtete Deckgläser</td><td>neuVitro</td><td>H-12-pdl</td><td>12 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Anti-citrulliniertes Histon H3-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>Unkonjugierte Anti-Kaninchen-Fab-Fragmente</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-007-003</td><td>Spezifität: IgG (H+L)</td></tr><tr><td>Anti-Myeloperoxidase-Antikörper</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro- eckzahn neutrophilenzahl extrazelluläre trap bildung: dynamische und quantitative analyse von fluoreszenz-mikroskopie

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

Als Reaktion auf eindringende Krankheitserreger loslassen Neutrophilen Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen (Netze), die extrazelluläre Netzwerke von DNA mit Histonen und antimikrobielle Proteine verziert sind. Übermäßige Netto Bildung (NETosis) und citH3 Release bei Sepsis ist mit mehreren organdysfunktion und Mortalität bei Mäusen und Menschen, aber ihre Auswirkungen bei Hunden sind unbekannt. Hier beschreiben wir eine Technik, um Hunde Neutrophilen aus Vollblut zur Feststellung und Quantifizierung der NETosis zu isolieren. Leukozyten-reiche Plasma, erzeugt durch Dextran Sedimentation wird durch handelsübliche Dichte Gradienten Trennung Medien getrennt und Granulozyten gesammelt für Zell-Graf und Durchführbarkeit zu testen. Um Echtzeit-NETosis in live Neutrophilen beobachten, werden Zelle permeationsfähigen und Zelle impermeant fluoreszierenden Nukleinsäure Flecken Neutrophilen aktiviert durch Lipopolysaccharid (LPS) oder Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) hinzugefügt. Veränderungen in der nuklearen Morphologie und NET Bildung sind im Laufe der Zeit durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. In-vitro- NETosis zeichnet sich weiter durch co-ns1 zellfreie DNA (Blut), Myeloperoxidase (MPO) und citrullinierte Histon H3 (citH3) mit einem modifizierten Doppel-Immunolabelling-Protokoll. Um Objektiv zu quantifizieren, NET Bildung und citH3 Ausdruck mit Fluoreszenz-Mikroskopie, Netze und citH3-positiven Zellen in einer verblindeten Weise mit verfügbaren Software quantifiziert. Diese Technik ist eine spezifischen Assay, der in-vitro- Kapazität der eckzahn Neutrophilen NETosis unterziehen zu bewerten.

Unter Verwendung dieses Protokolls live Cell Imaging, können Ermittler der nuklearen Morphologie, Plasmamembran Integrität und Anwesenheit von Blut im lebenden Neutrophilen beobachten. Ein Zelle impermeant nuklearen Farbstoff Flecken Kerne Säuren rot in Zellen mit beschädigten Zellmembranen. Eine weitere Zelle permeationsfähigen Farbstoff, Etiketten intrazellulären Nukleinsäuren in lebenden Zellen mit intakten Plasmamembranen. Alle intakt Neutrophils, unabhängig von ihrer Behandlungen sol...

Wir beschreiben Methoden zum isolieren eckzahn Neutrophils aus Vollblut und NET Bildung in live Neutrophilen mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu visualisieren. Protokolle, NET Bildung und citrullinierte Histon H3 zu quantifizieren sind auch beschrieben (citH3) Ausdruck mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie.

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Diese Methode kann wichtige Fragen zur extrazellulären Fallenbildung von Neutrophilen oder zur NET-Bildung bei Hunden oder anderen Spezies beantworten. Zu den Hauptvorteilen dieser Techniken gehören die reale Live-Detektion der NET-Bildung und die Identifizierung von NET-Komponenten wie milder Peroxidase und citrulliniertem Histon H3. Beginnen Sie damit, 10 bis 20 Milliliter Blut aus der Halsvene eines gesunden Hundespenders zu gewinnen, entfernen Sie die Nadel aus der Spritze, bevor Sie das Blut in Natriumheparinröhrchen abgeben, um ein übermäßiges Teilen zu vermeiden. Drehen Sie die Röhrchen einige Male vorsichtig um, um eine ausreichende Mischung von Blut und Antikoagulans zu gewährleisten, und prüfen Sie sie auf Gerinnsel und Erythrozytenaggregate, bevor Sie die Proben auf Eis legen.Verdünnen Sie das antikoagulierte Blut mit einem gleichen Volumen eiskaltem Dulbecco's PBS und geben Sie acht Milliliter verdünntes Blut in ein konisches 50-Milliliter-Polypropylenröhrchen mit 25 Millilitern filtriertem 3%igem Dextran. Stellen Sie das Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur aufrecht, um die Aggregation und Sedimentation der Erythrozyten zu ermöglichen. Schichten Sie dann vorsichtig fünf Milliliter leukozytenreiches Plasma auf fünf Milliliter Dichtegradientenmedium in einem 14-Milliliter-Polypropylen-Rundbodenröhrchen.Nach der Dichtegradientenzentrifugation wird die intermediäre Granulozytenzellschicht mit einer Fünf-Milliliter-Serologiepipette in eine konische 50-Milliliter-Zellschicht überführt und alle Erythrozyten, die mit den polymorphkernigen Zellen co-aspiriert wurden, mit 20 Millilitern kaltem, ultrareinem Wasser lysiert. Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig 30 bis 60 Sekunden lang um, um eine ausreichende Lyse zu gewährleisten, bevor Sie die Zellen in einem gleichen Volumen eiskalter 1,8%iger Natriumchloridlösung waschen. Nachdem Sie das Röhrchen einige Male umgedreht haben, zentrifugieren Sie es bei vier Grad Celsius.Verwenden Sie eine serologische Pipette, um den Überstand vorsichtig zu entfernen, und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 100 Mikrolitern Zellkulturpuffer. Zählen und bestätigen Sie ihre Lebensfähigkeit durch Ausschluss von Trypanblau. Verdünnen Sie dann die Neutrophilen auf eine eins mal zehn auf die sechs Zellen pro Milliliter Zellkulturpuffer.Es ist wichtig, eine geeignete sterile Technik zu verwenden und die Neutrophilen während des gesamten Isolierungsprozesses vorsichtig zu behandeln, da Kontamination und Scherkräfte zu In-vitro-Nekrose und Zelllyse führen können. Um die Neutrophilen durch Fluoreszenzmikroskopie abzubilden, geben Sie 200 bis 400 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung einer Poly-L-Lysin-beschichteten 12-Well-Kulturplatte für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Wenn sich die Neutrophilen am Boden der Vertiefungen festgesetzt haben, markieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem geeigneten fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff.Am Ende der Inkubation aktivieren Sie die Neutrophilen mit 100 Mikrogramm pro Milliliter LPS, 100 Nanomolar PMA als Positivkontrolle oder einem gleichwertigen Volumen Zellkulturpuffer als Negativkontrolle bei 37 Grad Celsius. Anschließend bilden Sie die Neutrophilenkulturen mittels Fluoreszenzmikroskopie mit 40-facher Vergrößerung zu den angegebenen Zeitpunkten ab. Für eine NET-Quantifizierung legen Sie Poly-D-Lysin-beschichtete Deckgläser mit einem Durchmesser von 18 Millimetern vorsichtig in einzelne Vertiefungen einer 12-Well-Kulturplatte und beschriften Sie die Vertiefungen entsprechend dem experimentellen Stimulus.Anschließend säen Sie 100 bis 200 Mikroliter der isolierten Neutrophilen direkt auf die Deckgläser für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Wenn die Neutrophilen an den Deckgläsern haften, aktivieren Sie die Neutrophilen in jeder Vertiefung 180 Minuten lang mit LPS, PMA oder DPBS, wie gerade gezeigt. Während der letzten 30 Minuten der Inkubation legen Sie eine Paraffinfilmfolie über einen Reagenzglasständer, um flache Vertiefungen zu schaffen, und geben Sie zwei bis drei Tropfen 4%iges Paraformaldehyd in jede Vertiefung.Beschriften Sie die Vertiefungen als experimentell geeignet und übertragen Sie mit einer feinen Pinzette die Deckgläser vorsichtig aus jeder Plattenvertiefung kopfüber auf die entsprechende PFA-gefüllte Vertiefung. Waschen Sie die fixierten Zellen nach 20 Minuten bei Raumtemperatur dreimal für fünf Minuten in zwei bis drei Tropfen gepufferter Kochsalzlösung pro Waschgang, indem Sie die Zellen von einer Vertiefung mit DPBS in die nächste bewegen. Um die Zellen zu permeabilisieren, legen Sie die Deckgläser eine Minute lang vorsichtig kopfüber auf einen Tropfen 1%NP-40, gefolgt von drei einminütigen gepufferten Kochsalzlösungswaschungen auf einer Wippe.Legen Sie die Deckgläser nach dem letzten Waschen kopfüber in 100 bis 200 Mikroliter 5%iges Ziegenserum in individuell beschriftete Petrischale, die mit frischer Plastikparaffinfolie ausgelegt sind, für eine einstündige Inkubation bei 37 Grad Celsius mit Schaukeln. Waschen Sie die Deckgläser am Ende der Blockinkubation dreimal in gepufferter Kochsalzlösung unter Schaukeln, wie gerade gezeigt. Übertragen Sie die Deckgläser in einzelne, mit Paraffinfolien ausgekleidete Petrischalen aus Kunststoff in 50 bis 100 Mikroliter des entsprechenden Antikörpers für eine einstündige Inkubation bei 37 Grad Celsius mit Schaukeln.Nach dem Waschen die Deckgläser mit dem entsprechenden Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius lichtgeschützt inkubieren. Am Ende der Sekundärantikörper-Inkubation waschen Sie die Deckgläser dreimal in gepufferter Kochsalzlösung im Dunkeln unter Schaukeln, gefolgt von einer Nukleinsäure-Farbstofffärbung mit DAPI für fünf Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach drei einminütigen gepufferten Kochsalzlösungswaschungen im Dunkeln unter Schaukeln tragen Sie einen 50-Mikroliter-Tropfen Antifading-Eindeckmittel auf einen Objektträger pro Probe auf und montieren Sie jedes getrocknete Deckglas vorsichtig kopfüber auf einen Tropfen Eindeckmedium.Anschließend lassen Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius lichtgeschützt aushärten. Am nächsten Morgen erhalten Sie 10 Bilder nach dem Zufallsprinzip aus verschiedenen Bereichen jedes Deckglases mit einer 40-fachen Vergrößerung. Alle intakten Neutrophilen sollten, unabhängig von der Behandlung, grün erscheinen und null bis 30 Minuten nach der Stimulation die charakteristischen gelappten Zellkerne aufweisen.Nach etwa 90 Minuten beginnen die Zellkerne der PMA-behandelten Neutrophilen ihr läppiges Aussehen zu verlieren und dekondensieren weiter bis zur Freisetzung der zellfreien DNA. LPS, ein langsameres und physiologischeres Stimulans von Neutrophilen bei Hunden, führt in der Regel erst 90 Minuten nach der Stimulation zu einer Chromatin-Dekondensation oder NETose. Nach 120 Minuten sind LPS- und PMA-aktivierte Neutrophile zu sehen, die von zellfreier DNA umgeben sind.Im Vergleich zu LPS-stimulierten Zellen verlieren mehr PMA-aktivierte Neutrophile ihre Plasmamembranintegrität, was durch ihre Färbung mit zellundurchlässigem Farbstoff belegt wird. Unstimulierte Neutrophile sollten ihre lappulierten Kerne und intakten Plasmamembranen während der gesamten Inkubationszeit beibehalten. Neutrophile, die 180 Minuten lang durch LPS stimuliert werden, produzieren diskrete netzartige NET-Gerüste in unmittelbarer Nähe zu nahegelegenen Neutrophilen.Im Gegensatz dazu produzieren PMA-aktivierte Neutrophile große Mengen an NETs, die deutlich größer sind. Tatsächlich induziert PMA, ein starkes Stimulans eines Enzyms, das die essentielle NET-Komponente intrazelluläres citrulliniertes Histon H3 katalysiert, eine höhere Anzahl von intrazellulären citrullinierten Histon-H3-exprimierenden Zellen im Vergleich zu nicht stimulierten und LPS-stimulierten Neutrophilen. Bei der Durchführung dieses Assays ist es äußerst wichtig, dass der Bediener, der die Mikroskopbilder aufnimmt und analysiert, für die experimentellen Bedingungen verblindet wird, um eine objektive Bewertung des Assays zu gewährleisten.Bei der Hälfte dieser Verfahren können Assays, wie der ELISA oder die Durchflusszytometrie, durchgeführt werden, um citrulliniertes Histon H3 in Zellen weiter zu quantifizieren. Vergessen Sie nicht, Negativkontrollen einzubeziehen, die entweder aus nicht stimulierten Neutrophilen oder Neutrophilen bestehen, die mit dem Peptidylarginin-Hemmer Chrolidamid behandelt wurden. Wir empfehlen außerdem, unterschiedliche Verdünnungen von primären und sekundären Antikörpern zu testen, um unspezifische Bindungen und Interferenzen zu minimieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind ein wichtiger angeborenen Immunsystems Mechanismus auf pathogene Bakterien, Pilze und Parasiten zu kämpfen. Hier beschreiben wir Methoden, um neutrophilen Granulozyten aus menschlichem Blut zu isolieren und sie zu aktivieren, um NETs zu bilden. Wir präsentieren Vorbereitung Techniken, um NETs in Licht-und Elektronenmikroskopie zu visualisieren.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Dieses Video zeigt die Induktion und Visualisierung von extrazellulären Neutrophilen-Fallen oder NETs in vormarkierten Neutrophilen unter Verwendung von Patientenserum, das zytoplasmatische Antikörper gegen Neutrophile enthält. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines undurchlässigen DNA-Farbstoffs und der Fluoreszenzmikroskopie die Visualisierung von NETs.

Induktion und Visualisierung von extrazellulären Fallen von Neutrophilen in vormarkierten Neutrophilen

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind Netzwerke von DNA, Histone und Neutrophilen-Proteine. Obwohl eine Komponente der angeborenen Immunantwort sind NETs in Autoimmun- und Thrombose beteiligt. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zur Hunde- Neutrophilen Isolierung und Quantifizierung von NETs Mikrotiterplatten-Fluoreszenztest verwendet wird.

Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) und zum Betrieb von NETQUANT vor, einer vollautomatischen Softwareoption zur Quantifizierung von NETs in Immunfluoreszenzbildern.

Automatisierte bildbasierte Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit NETQUANT

Dieses Protokoll beschreibt einen hochempfindliche und hohen Durchsatz Neutrophilenzahl extrazelluläre Falle (NET) Assay für die halbautomatische Quantifizierung von ex-Vivo NET Bildung durch Immunfluoreszenz dreidimensionale konfokalen Mikroskopie. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um NET Bildung und Abbau nach verschiedenen Reize zu bewerten und kann verwendet werden, um mögliche NET gezielte Therapien zu studieren.

Ein High-Throughput-Assay zu beurteilen und zu quantifizieren Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind dreidimensionale Strukturen, die durch stimulierte neutrophile Granulozyten erzeugt werden. In den letzten Jahren hat sich herabimsiert, dass NETs an einer Vielzahl von Krankheiten beteiligt sind. Der Nachweis von NETs im Gewebe kann diagnostische Relevanz haben, daher sind standardisierte Protokolle für die Kennzeichnung von NET-Komponenten erforderlich.

Immunfluoreszenz-Kennzeichnung von humanen und murinen neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Tissue

Wir beschreiben eine Methode zur Identifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) in formaldehydfixierten und paraffin-eingebetteten kardiogenen arterieogenen arteriellen Thromben mit wärmeinduziertem Antigen-Retrieval und einem doppelten Immunlabeling-Protokoll.

Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Feline Arteriellen Thrombi mittels Immunfluoreszenzmikroskopie

Hier wird ein Protokoll für die Induktion und Analyse von in vitro neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) vorgestellt. Die Quantifizierung von DNA, Cathelicidin (LL37) und Enzymaktivität ergab Daten, die die Variabilität in der Zusammensetzung und Morphologie von NETs zeigen, die durch mikrobielle und chemische Stimuli unter ähnlichen kontrollierten Bedingungen induziert werden.

Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, und Immunfluoreszenz wird häufig für ihre Visualisierung verwendet. Es gibt jedoch verschiedene Färbeprotokolle, und in vielen Fällen wird nur eine Art von Gewebe untersucht. Hier etablieren wir ein allgemein anwendbares Protokoll für die Färbung von NETs in Maus und menschlichem Gewebe.

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Wir präsentieren eine automatisierte Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) unter Verwendung des Lebendzellanalysesystems, gekoppelt mit einem membranpermeabilitätsabhängigen Dual-Farbstoff-Ansatz.

Echtzeit-Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Bildung extrazellulärer Neutrophilenfallen in menschlichen Neutrophilen

Dieses definierte Protokoll beschreibt einen Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopie-Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung der Freisetzung von extrazellulären Traps (NET) bei humanen Neutrophilen in vitro. Die reproduzierbare Methode ermöglicht die Untersuchung der Eigenschaften und Kinetik der NET-Freisetzung nach Stimulation mit unterschiedlichen NETosis-Induktoren und ermöglicht die Beurteilung der Pharmakologie von NETosis-Antagonisten.

Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopische Quantifizierung der Freisetzung extrazellulärer Fallen bei humanen Neutrophilen und Bewertung der Pharmakologie von Antagonisten

Lernen Sie die Isolation kaniner Neutrophilen aus Blut und die Visualisierung von NET-Bildung mittels Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse von citrulliniertem Histon H3.

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

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