Lungenfixierung unter konstantem Druck zur Beurteilung von Emphysem bei Mäusen
26. September 2019
Hier wird ein nützliches Protokoll zur Lungenfixierung vorgestellt, das einen stabilen Zustand für die histologische Auswertung von Lungenproben aus einem Mausmodell von Emphysem schafft. Der Hauptvorteil dieses Modells ist, dass es viele Lungen mit dem gleichen konstanten Druck ohne Lungenkollaps oder Deflation reparieren kann.
Der konstante Druck innerhalb der Fixiervorrichtung hält die Lunge in einem einigermaßen aufgeblasenen Zustand und erzeugt eine histologische Lungenprobe, die für die Beurteilung von mild Zigarettenrauch induziertem Emphysem geeignet ist. Der Hauptvorteil dieses Modells ist, dass es viele Lungen gleichzeitig mit dem gleichen konstanten Druck ohne Lungenkollaps oder Deflation fixieren kann. Demonstriert das Verfahren wird Naoko Arano ein Student aus meinem Labor sein.
Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Reflexbewegung machen einen Schnitt in der Haut und Muskelgewebe entlang der medialen Linie der Maus, Ziel für die Cephalie-Region, und schneiden seitlich, um einen breiteren Arbeitsbereich zu schaffen. Nach der Exposition der Membranschicht punktieren Sie das Gewebe mit Zangen und öffnen Sie den Brustraum. Schneiden Sie den Sternbereich, so dass die Lunge und das Herz visualisiert werden können.
Und schneiden Sie das linke Atrium und den rechten Ventrikel. Legen Sie eine 24 Gauge Kanüle, die mit einer Perfusionspumpe verbunden ist, in den rechten Ventrikelbereich ein und leiten Sie die Kanüle in den Cephalabereich, bis sie die Lungenarterie erreicht. Schalten Sie dann die Pumpe ein und durchdringen Sie das Gewebe mit etwa 200 MilliliterPBS für eine Stunde, bis sich das gesamte Lungengewebe in eine weiße Farbe geändert hat.
Am Ende der Perfusion schneiden Sie das Bindegewebe um die Luftröhre, Lunge und Herz, und verwenden Sie eine Naht, um die rechten Hauptbronchus zu binden. Als nächstes ernten Sie alle einzelnen Lappen der rechten Lunge und legen Sie das Herz und die Lappen der linken Lunge in einzelne 10-Milliliter-Spritzen, die ein entsprechendes Fixativ enthalten. Ziehen Sie den Kolben ein, wodurch ein Vakuum in der Spritze entsteht, um die Lunge aufzublasen und die Lunge aus der Spritze zu entfernen.
Legen Sie eine 20 Gauge Kanüle in die Luftröhre und verwenden Sie eine Naht, um die Kanüle an Ort und Stelle zu sichern. Schließen Sie eine mit Fixativ gefüllte Milliliterspritze an die Kanüle an und füllen Sie die Lunge mit zusätzlichem Fixativ, um auf Leckagen zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass die Einsteckstelle gesichert wurde, um zu verhindern, dass sich die Lungenprobe während der Fixierung von der Lungenplatine löst.
Dann übertragen Sie das Gewebe auf die Lungenfixierung Druckgeräte, entfernen Sie die Probe und binden Sie die Luftröhre mit einem Knoten am Ende der Fixierungsphase. Die untere Komponente der Lungenfixierungsdruckausrüstung, in die die Lungenprobe eingeführt wird, wird über eine 20-Spur-Kanüle mit einem Drei-Wege-Stopphahn an die Spitze des Formalinstroms angeschlossen. Der Druck wird aus den unterschiedlichen Oberflächenebenen des Fixativs zwischen dem unteren und oberen Fach erzeugt.
Der Druckunterschied beträgt 25 Zentimeter Wasser, aber der Höhenverstellknopf kann verwendet werden, um den Druck auf zwischen 25 und 30 Zentimeter Wasser einzustellen. Eine Pumpe verbindet den unteren und oberen Behälter, wobei ein Unterschied von 25 Zentimetern in der fixativen Oberflächenhöhe erhalten bleibt, und leitet den Fluss des Mittels. Nach 48 Stunden Fixierung weisen die Lungen von SMP30-Knockout-Mäusen, die der Umgebungsluft ausgesetzt sind, keine deutliche Luftraumvergrößerung auf.
Signifikante Luftraumvergrößerung und Zerstörung der Alveolarwand werden jedoch bei SMP30-Knockout-Mäusen beobachtet, die chronischem Zigarettenrauch ausgesetzt sind. Darüber hinaus sind der mittlere lineare Abfang- und destruktiver Index der Lungenproben in den rauchexponierten SMP30-Knockout-Mäusen signifikant größer als in den luftexponierten Tieren. Unser Labor verwendet 10%formalin, aber Forscher können andere Fixierungsmittel entsprechend ihren experimentellen Bedürfnissen verwenden.
Wie wir berichtet haben, können mit dem demonstrierten Fixierungssystem Lungenproben aus verschiedenen Mausemphysemmodellen für ihre morphometrische Auswertung geerntet werden. Da Fixiermittel gefährlich sein können, tragen Sie immer die entsprechende Schutzausrüstung des Personals und arbeiten in einem gut belüfteten Raum.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Lungenfixierung, die stabile Bedingungen für die histologische Untersuchung von Lungenproben aus einem Mausmodell der Emphyseme gewährleistet. Die Technik ermöglicht die gleichzeitige Fixierung mehrerer Lungen ohne Einsturz oder Entlüftung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Histologie
Hintergrund
- Emphysem ist eine Lungenerkrankung, die häufig durch Zigarettenrauch verursacht wird.
- Die histologische Beurteilung ist entscheidend für das Verständnis der Lungenerkrankung.
- Die Aufrechterhaltung der Lungeninflation während der Fixierung ist für eine genaue Beurteilung unerlässlich.
- Dieses Protokoll befasst sich mit Herausforderungen bei den Techniken der Lungenfixierung.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Lungenfixierung vorstellen.
- Die Beurteilung von Lungenproben in der Forschung erleichtern.
- Die Konsistenz bei der histologischen Analyse von Emphysem-Modellen verbessern.
Verwendete Methoden
- Verwendung einer Fixiervorrichtung, die einen konstanten Druck aufrechterhält.
- Inzision entlang der Mittellinie der Maus, um auf die Brusthöhle zuzugreifen.
- Durchstechen des Zwerchfells, um den Brustkorbraum zu öffnen.
- Sichtbarmachung von Lunge und Herz zur Probennahme.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Aufrechterhaltung der Lungeninflation während der Fixierung.
- Möglichkeit, mehrere Lungen gleichzeitig zu fixieren.
- Stabile histologische Präparate, geeignet zur Auswertung.
- Demonstration des Verfahrens durch einen Doktoranden.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Lungenfixierung.
- Es verbessert die Qualität histologischer Bewertungen in der Forschung.
- Diese Technik kann auf verschiedene Studien zur Lungenerkrankung angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine konsistente Lungenfixierung unter konstantem Druck löst eine entscheidende Herausforderung in präklinischen Modellen von Atemwegserkrankungen, indem sie eine reproduzierbare histologische Beurteilung von Emphysemen bei Mäusen ermöglicht. Diese Methode unterstützt eine zuverlässige morphometrische Analyse, verringert die Variabilität und erhöht das Vorhersagevertrauen bei der Validierung von Zielstrukturen im frühen Stadium der COPD-Forschung. Die Möglichkeit, mehrere Proben gleichzeitig zu bearbeiten, beschleunigt vergleichende Studien und unterstützt fundierte Entscheidungen bei der Portfolio-Priorisierung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine standardisierte morphometrische Beurteilung des Schweregrads einer Emphysema-Erkrankung in Mausmodellen.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielkandidaten durch die Bereitstellung einer reproduzierbaren Gewebearchitektur.
- Erleichtert die biologische Risikominderung, indem artefakte durch Fixierung minimiert werden.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit bei der Verknüpfung histologischer Endpunkte mit mechanistischen Hypothesen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Lungenproben für quantitative histologische Analysen nachgeschalteter Verfahren vor.
- Gewährleistet Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit über experimentelle Kohorten hinweg.
- Ermöglicht eine skalierbare Aufbereitung mehrerer Proben unter identischen Bedingungen.
- Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung der Wirkstoffeffekte auf die Lungenstruktur in Screening-Kampagnen.
Translationale und präklinische Forschung
- Verknüpft präklinische Modelle der Lungenerkrankungspathologie mit krankheitsrelevanten Endpunkten für translationsmedizinische Studien.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch Standardisierung der Gewebepräparation.
- Verringert das Risiko artefaktischer Befunde, die die Bewertung von Biomarkern oder Wirksamkeit beeinträchtigen könnten.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung auf der Grundlage robuster histologischer Daten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Fixierungsmethode bei konstantem Druck ist in den Kontinuum der frühen Entdeckung und präklinischen Validierung integriert und unterstützt sowohl die Target-Validierung als auch die Identifizierung von Leitverbindungen in Modellen respiratorischer Erkrankungen.
- Entdeckungsbioanalyse: Bietet eine zuverlässige Gewebearchitektur für Hypothesentests und Pfadanalysen in Modellen der Emphyseme.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative histologische Ergebnisse zur Beurteilung von Wirkstoffen.
- Analytik: Ermöglicht morphometrische Messungen wie den mittleren linearen Interzept und den Zerstörungsindex für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Unterstützt gegebenenfalls die Abstimmung präklinischer Befunde mit der klinischen Pathologie des Emphysems.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine standardisierte Fixierungsmöglichkeit, die an verschiedene Mausmodellsysteme von Lungenerkrankungen anpassbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert die Vorhersagesicherheit und die Validierung von Zielstrukturen, indem Variabilitäten bei der Fixierung minimiert werden.
- Operativer Wert: Erhöht Durchsatz und Standardisierung, da die gleichzeitige Fixierung mehrerer Proben ermöglicht wird.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz durch die Unterstützung robuster histologischer Endpunkte.
- Portfolio-Implikationen: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Programmen zu Atemwegserkrankungen basierend auf verlässlichen Gewebedaten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in chirurgischen Mausverfahren und im Umgang mit Lungengewebe.
- Benötigt spezielle Fixierungsausrüstung, die in der Lage ist, einen konstanten Druck aufrechtzuerhalten.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bei den Fixierungsparametern zur Reproduzierbarkeit voraus.
- Kann je nach experimentellen Anforderungen an verschiedene Fixiermittel angepasst werden.
- Muss Sicherheitsprotokolle für den Umgang mit gefährlichen Fixierstoffen berücksichtigen.
