Name: Neuartiges Verfahren für den 3D-Druck Decellularized Matrizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Erfahren Sie ein Co-Printing-Verfahren für Gewebescaffolds mit synthetischen und biologischen Komponenten unter Verwendung von PCL-Filamenten mit eingebetteten PLA-Mikrosphären. Diese Methode ermöglicht die Kapselung dezellularisierter Matrizen aus porcinem Knorpel.

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Dieses Projekt wurde teilweise finanziert durch einen Zuschuss aus der pädiatrischen orthopädischen Gesellschaft von Nordamerika (POSNA) und die National Institutes of Health NIBIB R21EB025378-01 (explorative Bioengineering Research Grant) zu gewähren.

1. Erhalt und Vorverarbeitung Mikrosphären
<ol><li>Mikrosphären mit dem gewünschten Matrix gekapselt (PLA-DM)2zu produzieren. Hinweis: Es ist unerlässlich, dass die Mikrosphären einheitlicher Größe. Aus diesem Grund ist es unerlässlich, Siebung der Mikrosphären vor dem Gebrauch. Obwohl in früheren Publikationen2Matrix Decellularization und Kapselung detaillierte worden, folgt eine kurze Zusammenfassung des Prozesses.<ol>
<li>Erstens ernten Sie Knorpel Stecker von porcinen Hinterbeine. Decellularize des Knorpels in einer Reihe von Waschungen mit 0,05 % Trypsin/0,5 mm Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA), Dulbecco modifizierten Adlers Medium (DMEM) und 1,5 % Peressigsäure und 2,0 % Triton x-100 für 4 h mit destilliertem Wasser wäscht vor und nach jedem Schritt2.</li>
		<li>Ablassen der decellularized Matrix, Einfrieren, lyophilize, Schleifen und lösen sich in Pepsin Lösung. Mischen Sie nach Auflösung die Pepsin-Lösung mit PLA die in Dichlormethan aufgelöst worden ist.</li>
		<li>Die Mischung in eine 3 % Polyvinylalkohol in Wasserlösung tropfenweise hinzufügen. Zentrifugieren Sie die resultierende Mikrosphären, spülen, abtropfen lassen und wieder lyophilize. Hinweis: Ausführliche Informationen über den Prozess finden Sie unter den zuvor veröffentlichten Protokoll Nr.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sieb die Mikrosphären.<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass alle Sieb Platten gründlich gereinigt wurden und sind vor der Verwendung trocken. Wenn nötig, saubere Siebe mit Ultraschall Reiniger um sicherzustellen, dass alle Kugeln vom Sieb entfernt werden.</li>
		<li>Montieren Sie den Sieb Shaker mit 106 µm-Sieb-Fach an der Spitze, das 53 µm Fach nach, und das Sieb unten schwenken.</li>
		<li>Legen Sie trockenere Mikrosphären in das oberste Sieb-Fach und legen Sie den Deckel auf das obere Fach. Schalten Sie groben Siebung für 8 bis 10 min. wiederholen auf Geldstrafe für 8 bis 10 Minuten. Hinweis: Die Sieb-Zeiten müssen je nach Charge verringert oder erhöht werden.</li>
		<li>Vorsichtig entfernen Sie die Sieb-Platten einzeln und legen Sie sie auf dem Kopf stehend auf einem großen wiegen Papier. Tippen Sie auf den Seiten vorsichtig, um sicherzustellen, dass die meisten der Kugeln aus dem Sieb und auf das Papier gefallen haben.</li>
		<li>Die überdimensionalen Sphären zu verwerfen (> 106 µm) und untermaßige Sphären (< 53 µm). Fügen Sie die Kugeln, die im Bereich von 53 bis 106 µm Größe zu einem beschrifteten Zentrifugenröhrchen mit der Art und Batch dann Platz im Gefrierschrank-20 ° C bis zur weiteren Verwendung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Mikrosphären Qualitätskontrolle Bewertungen
Hinweis: Siehe Abbildung 1.
<ol><li>Führen Sie makroskopische/visuelle Bewertung zu überprüfen, dass die Mikrosphären einheitlich und kugelförmig, mit keine Aggregate vorhanden sind.</li>
	<li>Die Mikrosphären mit einem scanning Electron Schliffbild (SEM) zu beurteilen.<ol>
<li>Dazu Platz Mikrosphären auf ein SEM chuck und sputter-Mantel mit Gold-Palladium in Argon-Atmosphäre mit einem Sputter Coater auf eine Dicke von 4 nm.</li>
		<li>Beobachten, Oberflächeneigenschaften, Morphologie und Durchmessern von den Mikrosphären mit einer 10 kV Spannung und einem 10 mm Arbeitsabstand zu beschleunigen, um sicherzustellen, dass die Produktion und Siebung von den Mikrosphären erfolgreich war.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Filament Kreation für den 3D-Druck
<ol><li>Messung und Aufzeichnung der Mass die Mikrosphären aus Schritt 2 und 3 erhalten; mindestens 25 g ist erforderlich.</li>
	<li>Die Mikrosphären für eine 1:4-Gewichts-Verhältnis von Mikrosphären zu PCL Polycaprolactons (PCL) Pulver hinzufügen.</li>
	<li>Mischen Sie die Pulvermischung auf eine Miniatur rollenden Mischer bei 20 u/min für 5 min dann drehen Sie den Behälter und mischen bei 20 u/min für eine zusätzliche 5 min (siehe Abbildung 2).</li>
	<li>Viele im Handel erhältlichen Extruder (siehe die Tabelle der Materialien) haben isolierende Jacken, weil ihre beabsichtigten Arbeitstemperaturen für traditionelle fused Deposition modeling (FDM) Filamente sind. Ändern Sie den Extruder durch das isolierende Material entfernen (falls erforderlich) zu und verwenden Sie es in Kombination mit Tischventilatoren (die Umgebungsluft auf den Extruder und extrudierten Filament wehen), des Extruders bei niedrigeren Temperaturen zu verwenden. Hinweis: Desktop-Lüfter die Luft zur Kühlung der Extruder und Filament wehen eignen sich für dieses Verfahren.</li>
	<li>Richten Sie das Geräte-Setup für die Extrusion. Siehe Abbildung 3.<ol>
<li>Richten Sie den Extruder, so dass dessen Ausgang ~ 60 cm vom Einlass an den Spooler mit einen direkten Weg aus der Extrusion-Steckdose mit dem Spooler-Einlass ist. Hinweis: Der Spooler kann optional 3-4 Zoll von der Bank ausgelöst werden wenn feststeht, dass der Faden bis zu dem Punkt der Berührung der Benchtop herabhängenden ist.</li>
		<li>Legen Sie eine Desktop-Fan ~ 15 cm von der Heizmantel und in Richtung Heizmantel Kühlung mit Luft während der Filament-Produktion anbieten. Legen Sie einen zweiten Lüfter etwa auf halbem Weg zwischen dem Extruder und Spooler und richten Sie es auf das Extrudat, bei der Kühlung der Glühfaden mit Umgebungsluft.</li>
		<li>Passen Sie die Positionierung bei Bedarf während des Prozesses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Den modifizierte Extruder Heizelement auf 52 ° C eingestellt, auf dem Desktop Lüfter drehen und ermöglichen das Instrument zu Gleichgewicht für 20 bis 30 min. Stellen Sie sicher, dass die richtige Düse des Extruders angebracht ist.</li>
	<li>Kurz vor Beginn, füllen Sie den Extruder-Trichter mit der Mikrosphären/PCL Mischung aus Schritt 3.3. Schalten Sie den Spooler und die Schnecke Extruder Extrusion von Filament zu initiieren.</li>
	<li>Wenn das erste Filament extrudiert wird, manuell das Extrudat aus der Extrusion-Steckdose mit der Pinzette ziehen und an dem Glühfaden-Spooler zu ernähren.</li>
	<li>Das gewünschte Filament dauert seine Zeit, aus den Spooler zu kommen. Mit getrennten Spulen oder Klebeband, eindeutig kennzeichnen Sie die Filament-Zusammensetzung optisch einheitlich erscheint.</li>
	<li>Den Prozess überwachen und Parameter nach Bedarf ändern. Passen Sie die Extruder-Temperatur, Extrusion Schneckendrehzahl und Spooler Geschwindigkeit zu einem 1,75 mm Durchmesser Filament Bremssättel gemessen. Passen Sie die Fans nach Abkühlen den Faden richtig zur Vermeidung unrunde Filament Querschnitte Bedarf an. Mischen Sie und füllen Sie den Behälter nach Bedarf. Hinweis: Große Aufmerksamkeit wird während dieses Prozesses, angemessene Filament für nachfolgende 3D-Druck zu erhalten benötigt. Die oben genannten Parameter ändert sich abhängig von den Umgebungsbedingungen, Füllstand und Einheitlichkeit der Mischung in den Trichter und die Thermodynamik und Flow Dynamik der bestimmten Chargen von PCL und Mikrosphären.</li>
	<li>Fahren Sie fort, Extrudieren, bis alle des Pulvers verwendet wurde und der Behälter fast leer ist. Den Trichter zu spülen, die Mikrosphären-Mischung, die derzeit im Extruder fügen Sie PCL-Pulver (ohne Mikrosphären hinzu). Weiter den Trichter PCL Pulver hinzu, bis keine weitere Mikrosphären in das Extrudat sichtbar sind.</li>
	<li>Achten Sie darauf, beschriften und separate Heizfaden enthält die Mikrosphären in der gewünschten Konzentration, als nach dem Heizfaden Abkühlen ist schwieriger zu einheitlichere Filament von ungleichmäßigen Filament zu unterscheiden.</li>
	<li>Extrudieren bis gibt es minimale Pulver in den Trichter links weiter, dann schalten Sie den Spooler, Extruder Schnecke, Extruder-Heizelement und Lüfter.</li>
</ol>(4) Drucken mit dem Filament
<ol><li>Entwerfen Sie eine Geometrie der gewünschten Form und Form mit einem Computer-aided-Design-Software. Dann schneiden Sie das Modell und diktieren des Werkzeugwegs mit slicing-Software, die kompatibel mit der 3D Druckmaschine verwendet wird.</li>
	<li>Laden Sie das Filament aus Schritt 3 auf jeden Standarddrucker FDM mit Standarddüsen mit dem gewünschten Durchmesser (in der Regel 0,4 mm) ausgestattet. Wie die benutzerdefinierte Filament abgeschiedenen Schicht für Schicht durch die Maschine ist beginnen Sie den Druck (in der Regel mit 65-70 ° C und 300 mm/min lineare Geschwindigkeit).</li>
	<li>Achten Sie darauf, besonderes Augenmerk auf die erste Schicht und passen die Einstellungen wie erforderlich, um eine gute Qualität drucken. Hinweis: Um die Druckgeschwindigkeit, Drucktemperatur Plattform Temperatur, Extrusion Multiplikator und andere Parameter können Anpassungen vorgenommen werden. Beziehen sich auf den Drucker und slicing Hersteller Anleitung zur Fehlerbehebung für weitere Unterstützung.</li>
</ol>5. Qualitätskontrolle Beurteilung
<ol><li>Legen Sie die gedruckten Konstrukte auf SEM Chucks und sputter-Mantel mit Gold-Palladium in Argon-Atmosphäre mit einem Sputter Coater auf eine Dicke von 4 nm.</li>
	<li>Beobachten, unter dem Mikroskop mit einer 10 kV Spannung und einem 10 mm Arbeitsabstand zu beschleunigen, Oberflächeneigenschaften zu überprüfen und für das Vorhandensein oder Fehlen von Mikrosphären, falls zutreffend.</li>
</ol>6. Funktionsprüfung der gedruckten Konstrukte
Hinweis: Alkalischer Phosphatase (ALP) kann verwendet werden als Ersatz für decellularized Matrix um festzustellen, ob gekapselte Proteine nach der Glühfaden Herstellung biologisch aktiv sind. ALP wird verwendet, weil es eine Reaktion von einem Substrat, p-Nitrophenyl Phosphat, Wechsel von farblos zu gelben Nebenprodukte, p-Nitrophenol und anorganischem Phosphat katalysiert, aber nur, wenn ALP in die funktionelle Konformation ist.
<ol><li>Drucken Sie eine Geometrie (n = 3), die hat eine Ende-Masse von mindestens 400 mg mit der ALP Mikrosphären Filament (PLA-ALP/PCL) mit identischen Druckparameter als PLA-DM/PCL-Gerüste. Auch drucken PCL-nur (PCL(-)) Gerüste die gleiche Geometrie wie der PLA-ALP/PCL-Gerüste. Tauchen sie ein in 1 mL Tris-HCl-Puffer und inkubieren Sie für 24 h bei 37 ° C und 110 u/min drehen um Enzym Verbreitung zu ermöglichen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL 1 mg/mL p-Nitrophenyl Phosphat, Binatrium-Hexahydrat in Tris-HCl. Inkubation bei 37 ° C, 110 u/min für eine zusätzliche 10 h. lesen überstand Extinktion bei 415 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -T., Leahy, J. C. <a target="_blank" href="https://www.astm.org/DIGITAL_LIBRARY/STP/PAGES/STP15307S.htm">Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone.</a> Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).</li>
<li>Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -Y., Whitlock, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29394158">Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold.</a> Biofabrication. , (2018).</li>
<li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li>
<li>Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11071603">Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage.</a> Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).</li>
<li>Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+biodegradable+lumbar+interbody+fusion+cage+design+and+fabrication+using+integrated+global-local+topology+optimization+with+laser+sintering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering.</a> Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).</li>
<li>Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00158-010-0508-8">Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity.</a> Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).</li>
<li>Lin, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+bone+engineering+using+ex+vivo.+gene+therapy+and+topology-optimized%2C+biodegradable+polymer+composite+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds.</a> Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).</li>
<li>Lin, C. -Y., Hsiao, C. -C., Chen, P. -Q., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interbody+Fusion+Cage+Design+Using+Integrated+Global+Layout+and+Local+Microstructure+Topology+Optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization.</a> Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).</li>
<li>Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioresorbable+Airway+Splint+Created+with+a+Three-Dimensional+Printer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).</li>
<li>Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ornamenting+3D+printed+scaffolds+with+cell-laid+extracellular+matrix+for+bone+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration.</a> Biomaterials. 37, 230-241 (2015).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+interface+microstructure+on+interfacial+shear+strength+for+osteochondral+scaffolds+based+on+biomimetic+design+and+3D+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering+C%22%5BJournal%5D)">The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing.</a> Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).</li>
<li>Williams, J. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15763261">tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering.</a> Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).</li>
<li>Monibi, F. A., Cook, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Derived+Extracellular+Matrix+Bioscaffolds%3A+Emerging+Applications+in+Cartilage+and+Meniscus+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).</li>
<li>Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Host+Immune+Response+to+Tissue-Engineered+Organs%3A+Current+Problems+and+Future+Directions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).</li>
<li>Sutherland, A. J., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Microsphere-Based+Scaffolds+Containing+Decellularized+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage.</a> Macromolecular Bioscience. , (2015).</li>
<li>Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naturally+derived%2C+cytocompatible%2C+and+architecturally+optimized+scaffold+for+tendon+and+ligament+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration.</a> Biomaterials. , (2007).</li>
<li>Whitlock, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cyclic+strain+on+tensile+properties+of+a+naturally+derived%2C+decellularized+tendon+scaffold+seeded+with+allogeneic+tenocytes+and+associated+messenger+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+surgical+orthopaedic+advances%22%5BJournal%5D)">Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression.</a> Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).</li>
<li>Whitlock, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+process+for+optimizing+musculoskeletal+allograft+tissue+to+improve+safety%2C+ultrastructural+properties%2C+and+cell+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+-+Series+A%22%5BJournal%5D)">A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration.</a> Journal of Bone and Joint Surgery - Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).</li>
<li>Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21362080">Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment.</a> Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).</li>
<li>Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).</li>
<li>Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+kidneys+as+a+source+of+ECM+scaffold+for+kidney+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering+C%22%5BJournal%5D)">Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration.</a> Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).</li>
<li>Dean, R. L. <a target="_blank" href="https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/bmb.2002.494030060138">Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Beide decellularized Matrizen und 3D gedruckte PCL Gerüste haben unabhängig voneinander gezeigt worden, um Adhäsion und Proliferation von Zellen, überprüfen ihre Verwendung für osteochondrale10,11,12reparieren lassen. Die Verwendung von decellularized Matrix engineering Ansätze zur Gewebereparatur wurde ein viel Interesse und Erfolg in der jüngsten Vergangenheit2,3,...

Aktuelle Gewebe-engineering-Techniken für klinische Anwendungen wie Knochen, Knorpel, Sehnen und Bänder Wiederaufbau verwenden Sie Auto und Allografts, um geschädigtes Gewebe zu reparieren. Jede dieser Techniken wird routinemäßig als "Goldstandard" in der klinischen Praxis durchgeführt, indem zuerst Ernte Spendergewebe entweder der Patient oder ein cadaveric Spiel, und dann das Spendergewebe in den defekt Seite2. Allerdings sind diese Strategien durch Spender Website Morbidität, Spender Website Knappheit für große Mängel, Risiko von Infektionen und Schwierigkeiten, die Transplantate, die die gewünschte Geometrie entsprechen begrenzt. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass Allografts verwendet für den Wiederaufbau mechanische und biologische Eigenschaften im Vergleich zu nativen Gewebe3reduziert haben. Mit diesen Überlegungen im Auge Gewebe-Ingenieure vor kurzem wandte sich an drei dreidimensionale (3D) Bioprinting, kundenspezifische, komplexe Geometrien herzustellen, die sind biologisch aktiv und entwickelt, um die Defekt-Größe und Form und bietet ausreichend Platz für mechanischen Eigenschaften bis biologischen Umbau abgeschlossen ist.
Im Idealfall bestünde ein 3D-gedruckten Gerüst aus Polymeren Rückgrat, die die erforderliche mechanische Stabilität des nativen Gewebe behalten können, während die eingearbeiteten Biologics biochemische Signale bieten zu umgebenden Zellen, was zu ihrer Migration, Verbreitung, Differenzierung und Gewebe Produktion2,5. Leider sind die meisten Konstrukte, die biologische Komponenten enthalten gemacht mit Gels oder Polymeren zu schwach, um in Vivo erlebt durch die gezielte Gewebe für Auto/Allograft Wiederaufbau standhalten. Andere Polymere wie Polymilchsäure (PLA) sind bioresorbierbare, 3D druckbare und strukturell klingen, aber sind bei Temperaturen bei oder über 210 ° C - so dass es unmöglich für Biologics Co gedruckten während der Fertigung werden gedruckt. Polycaprolactons (PCL) ist eine andere-FDA-Zulassung, bioresorbierbare Polymer, das 3D bei einer niedrigeren Temperatur (65 ° C), die in der Herstellung von patientenspezifischen Implantaten mit komplexer Morphologien5,6 immer beliebter geworden ist gedruckt werden kann ,7,8,9. Aber machen die meisten Bioprinters, die mit pneumatischer Technologie es unmöglich, PCL bei niedrigeren Temperaturen zu drucken, wo biologische Aktivitäten unverletzt bleiben kann. Bisher hat die Integration dieser Polymere mit Auto/Allografts in neuartigen druckbare Biomaterial noch erreicht werden. In Ermangelung eines solchen Materials ist eine wahre Gewebezüchtungen Herangehensweise an Gewebe Wiederaufbau unwahrscheinlich. Deshalb haben wir versucht, PLA, PCL, kombinieren und decellularized Allograft Matrizen (DM), die Vorteile der einzelnen Materialien zu verwenden, um eine tragfähige Konstruktion in der Lage, komplexe Gewebe zu rekonstruieren herzustellen. Dabei böte die erste mechanische Festigkeit muß widerstehen in Vivo Kräfte und der thermischen Stabilität, additiven Fertigung in einem Konstrukt unterzubringen, die Bildung der gewünschten Gewebe induziert.
In einem letzten Versuch an die oben genannten Hürden haben wir gezeigt, dass ist es möglich, decellularized Knorpel extrazelluläre Matrix innerhalb einer thermisch Schutzbarriere PLA Kapseln, die in PCL Fäden extrudiert werden können Aufrechterhaltung der Fähigkeit des DM, umliegenden Host Zellen2zu beeinflussen. Dies inspirierte uns klinisch wirksame Konzepte für den Wiederaufbau der Gewebe zu suchen. In der aktuellen Studie nutzen wir die Plattformtechnologie zur all-in-One-Gerüste bauen, die PLA, DM und PCL (PLA-DM/PCL) enthalten.
Unser Ziel ist es zur Verbesserung der Wirksamkeit und Nützlichkeit von Allografts mit der vorgeschlagenen Roman Biofabrication Technik, genauer rekapitulieren nativen Gewebe, um sie letztendlich in verschiedenen Anwendungen zu verwenden.

<table><tbody><tr><td>Siebmaschine</td><td>Haver & Boecker Tyler</td><td>Ro-Tap RX 29-E Pure</td><td></td></tr><tr><td>Sieve 90 um</td><td>Fisherbrand</td><td>170328156</td><td>Nr. 170</td></tr><tr><td>Sieve 53 um</td><td>Fisherbrand</td><td>162513588</td><td>No. 270</td></tr><tr><td>Sieve 106 um</td><td>Fisherbrand</td><td>162018121</td><td>No. 140</td></tr><tr><td>Sputter Coater</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>Hitachi, USA</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Filabot EX2</td><td>Filabot.com</td><td>FB00061</td><td></td></tr><tr><td>Filabot Spooler</td><td>Filabot.com</td><td>FB00073</td><td></td></tr><tr><td>CAPA 6506</td><td>Perstorp</td><td>24980-41-4</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>6" Fan</td><td>Comfort Zone, Amazon</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschall Wasserbad</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-08895-13</td><td></td></tr><tr><td>Dreamer</td><td>FlashForge</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Drum Mixer</td><td>Custom</td><td>made n/a</td><td>Ähnliches Gerät: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no& gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Mikrowaage</td><td>Mettler Toledo, Fisher Scientific</td><td>01-913-851</td><td></td></tr><tr><td>Simplify3D</td><td>Simplify3D</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>SolidWorks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokugeln</td><td>Eigenproduziert, siehe gleichzeitig eingereicht JoVE Einreichung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p-Nitrophenylphosphat, Dinatriumsalz, Hexahydrat</td><td>Millipore</td><td>4876-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase, alkalisch</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10 713 023 001</td><td></td></tr><tr><td>Absorbance Reader</td><td>Tecan</td><td>Sunrise</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6455-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Beheizter Shaker</td><td>Neu Brunswick Scientific</td><td>Excella E24</td><td></td></tr></tbody></table>

neuartiges verfahren für den 3d-druck decellularized matrizen

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

3D Bioprinting zielt darauf ab, eigene Gerüste zu schaffen, die sind biologisch aktiv und Platz für die gewünschte Größe und Geometrie. Ein thermoplastischer Backbone kann mechanischen Stabilität ähnlich wie bei nativen Gewebe bereitzustellen, während biologische Agenten kompositorischen Signale zu Vorläuferzellen, bieten ihre Migration, Proliferation und Differenzierung, das ursprüngliche Gewebe wiederherzustellen / Organe,1,2. Leider sind viele 3D Druck kompatibel, resorbierbaren Polymeren (z. B. Polymilchsäure PLA) gedruckten bei einer Temperatur von 210 ° C oder höher - Temperaturen, sind schädlich für Biologics. Auf der anderen Seite ist Polycaprolactons (PCL), eine andere Art von Polyester, eine bioresorbierbare, 3D druckbare Material, das eine sanftere Druck Temperatur von 65 ° C. Es wurde daher vermutet, dass decellularized extrazelluläre Matrix (DM) enthaltenen thermisch Schutzwall PLA konnte innerhalb von PCL Filament gedruckt werden und bleiben in seine funktionelle Konformation. In dieser Arbeit war osteochondrale Reparatur der Anwendung, für die die Hypothese getestet wurde. Als solche war porcinen Knorpel decellularized und gekapselt in sauren Polymilchsäure (PLA) Mikrosphären, die dann mit Polycaprolactons (PCL) extrudiert wurden in Filament, 3D Konstrukte über fused Deposition Modellierung zu produzieren. Die Konstrukte mit oder ohne die Mikrosphären (PLA-DM/PCL und PCL(-), beziehungsweise) wurden für unterschiedliche Oberflächeneigenschaften ausgewertet.

Nach Siebung, sollten Mikrosphären erscheinen einheitlich und frei von Aggregaten. Unter SEM werden die gesiebten Mikrosphären möglicherweise kleine Poren auf der Oberfläche, jedoch ansonsten sphärische und glatt, wie in Abbildung 1dargestellt. Alle extrudierten Filamente sollte der einheitlichen Durchmesser und kreisförmigen Querschnitt. Ein Filament, das Mikrokugeln (PLA-DM/PCL) enthält haben eine etwas mehr Matte während einer PCL-nur zu beenden (PCL(-)) F...

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Polycaprolactons (PCL) Filament mit eingebetteten Polymilchsäure (PLA) Säure Mikrosphären die decellularized Matrizen (DM) für den 3D-Druck von strukturellen Gewebetechnik Konstrukte enthalten.

Neuartiges Verfahren für den 3D-Druck Decellularized Matrizen

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Diese Methode ermöglicht den Co-Druck sowohl von strukturellen Kunststoffen als auch von biologischen Komponenten für gewebegefertigte Gerüste. Diese Gerüste können die native Gewebeumgebung genauer replizieren, was für kultivierte Zellen von Vorteil sein kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie mechanisch fundierte Strukturen drucken kann, ohne das in den Gerüsten eingekapselte biologische Material in einer All-in-One-Technik für die Tissue-Engineering zu beschädigen.Erzeugen Sie Mikrosphären mit der gewünschten Matrix gekapselt. Diese Mikrosphären wurden mit dezellularisiertem Knorpel aus Schweinehinterbeinen hergestellt. Sie variieren in der Größe.Arbeiten Sie mit einer Siebmaschine, um Mikrosphären von uniformierter Größe zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die drei Siebschalen vor der Verwendung gründlich gereinigt und getrocknet wurden. Montieren Sie den Siebschüttler mit dem größeren Mesh-Tray oben und dem kleineren Netzteil in der Mitte.Die Siebpfanne auf den Boden legen. Legen Sie trockene Mikrosphären in das oberste Tablett. Legen Sie dann den Deckel auf das Tablett.Grobsieb für acht bis zehn Minuten. Dann feines Sieb für acht bis zehn Minuten. Während des Wartens wiegen Sie Das papier für die gesiebten Kugeln.Wenn das Sieben abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig ein Siebtablett. Legen Sie das Fach auf den Kopf auf das Wägepapier. Tippen Sie vorsichtig auf die Seiten, um sicherzustellen, dass die meisten Kugeln herausfallen.Wenn alle Siebplatten auf gewogenes Papier entleert sind, entsorgen Sie die übergroßen und untergroßen Kugeln. Die übrigen Kugeln haben die richtige Größe für die Verwendung in den nachfolgenden Schritten. Platzieren Sie diese Kugeln in ein beschriftetes Zentrifugenrohr.Bewahren Sie das Rohr in einem 20 Grad Celsius Gefrierschrank auf, bis es benötigt wird. Wiegen Sie das Material, das notwendig ist, um das Filamentmaterial herzustellen. Machen Sie ein Ein-zu-vier-Gewicht-Verhältnis von Mikrosphären zu Polycaprolacton Pulver mit mindestens 25 Gramm Mikrosphären.Die Pulvermischung auf einen Miniatur-Walzmischer übertragen. Mischen Sie das Pulver bei 20 Umdrehungen pro Minute für fünf Minuten. Beenden Sie nach fünf Minuten die Drehung und kippen Sie den Behälter.Dann bei 20 Rpm für weitere fünf Minuten mischen. Um fortzufahren, nehmen Sie die Mischung zu einem Extruder- und Spooler-Setup. Richten Sie den Extruder so ein, dass sein Auslass etwa 60 Zentimeter vom Einlass eines Spoolers entfernt ist.Achten Sie dann am Extruder-Heizelement darauf, dass es keine Isolierjacke gibt. Platzieren Sie einen Desktop-Lüfter etwa auf halbem Weg zwischen Extruder und Spooler, um das Extrudat zu kühlen. Setzen Sie einen weiteren Lüfter in die Nähe der Heizjacke, um sie mit Umgebungsluft zu kühlen.Als nächstes stellen Sie sicher, dass die richtige Düse am Extruder befestigt ist und stellen Sie die Temperatur des Heizelements ein. Starten Sie die Kühllüfter und lassen Sie das Gerät einen stabilen Zustand erreichen. Nach 20 bis 30 Minuten die MikrosphärePCL-Mischung erhalten und den Extrudertrichter füllen.Schalten Sie den Spooler und die Extruderschnecke ein, um die Filamentextrusion zu initiieren. Verwenden Sie Zangen und ziehen Sie manuell das erste extrudierte Filament. Führen Sie das Filament an den Filamentspooler.Beachten Sie beim Extrudieren das Filament, um seine Zusammensetzung zu identifizieren. Nach einiger Zeit erscheint die Filamentzusammensetzung einheitlich, was gewünscht wird. Wrap Tape um das Filament, um den Beginn der einheitlichen Region zu markieren.Überwachen Sie über die Spoolerwalzen hinaus den Durchmesser des Filaments. Verwenden Sie Sättel, um zu testen, ob der Durchmesser nahe an den gewünschten 1,75 mm liegt. Stellen Sie die Spooler- und Extrudergeschwindigkeiten und -temperaturen nach Bedarf ein.Um den Filamentdurchmesser anzupassen, ändern Sie zunächst die Spooler- und Extrudergeschwindigkeiten. Sie können auch die Extrudertemperatur ändern, obwohl dies in der Regel nicht notwendig ist. Fahren Sie mit dem Nachfüllen des Trichters fort und extrudieren Sie, bis das gesamte Pulver verwendet ist.Wenn der Trichter fast leer ist, fügen Sie dem Trichter PCL-Pulver hinzu, um das Mikrosphärengemisch auszuspülen. Überwachen Sie das Extrudat beim Hinzufügen des PCL-Pulvers. Zunächst werden Mikrosphären im Extrudat noch sichtbar sein.Wenn keine Mikrosphären mehr sichtbar sind, beenden Sie das Hinzufügen der PCL. Trennen und beschriften Sie das Filament mit Mikrosphären in der gewünschten Konzentration. Wenn sich minimales Pulver im Trichter befindet, stoppen Sie das Extrudieren und schalten Sie das Gerät aus.Das Filament kann in einem Standard-Fused-Depositionsmodellierungsdrucker verwendet werden. Laden Sie das Filament in den Drucker, der mit Düsen des gewünschten Durchmessers ausgestattet ist. Wenn das Modell geladen ist, stellen Sie die Temperatur und die Lineline-Geschwindigkeit für den Druck ein und beginnen Sie mit der Ablagerung des Filaments.Das benutzerdefinierte Filament wird Schicht für Schicht abgelagert. Achten Sie besonders auf die erste Schicht und passen Sie die Einstellungen nach Bedarf an. Diese beiden 3D-gedruckten Gerüste sind in dieser Größenordnung schwer zu unterscheiden.Man hat Filament, das Polycapralacton enthält, nur PCL. Das andere hat PCL-Filament mit eingebetteten Mikrosphären aus Polymilchsäure und dezellulierten Matrizen. Betrachtet man die Rasterelektronenmikroskopie, wirkt das PCL-Gerüst meist glatt.Im Gegensatz dazu sind für das andere Filament Mikrosphären, die in die PCL eingebettet sind, in der gesamten Probe sichtbar. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass über- oder unterdimensionierte Mikrosphären die Strömungsdynamik des Materials im Extruder beeinflussen können. Achten Sie daher darauf, Ihre Mikrosphären vor der Anwendung richtig vorzubereiten.Um den Abfall zu minimieren, ist es ratsam, eine große Charge Filament zu erstellen, die für alle Experimente erforderlich ist, anstatt häufiger kleinere Chargen zu erstellen. Die Expertise in der Filamentproduktion wird mit der Zeit kommen. Gerüste, die nach diesem Verfahren hergestellt werden, können in vitro und in vivo weiter bewertet werden, um zusätzliche Fragen zur verbesserten Induktion und mechanischen Festigkeit im Vergleich zu anderen biogedruckten Gerüsten zu beantworten.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Tissue-Engineering, um die kontragene Induktion von dezellularisierter Schweinematrix innerhalb der 3D-Gerüste zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit kleinen Partikeln Atemwegsgefahren darstellen kann. Das Tragen einer kleinen Partikelmaske wird während dieses Verfahrens empfohlen.

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Neuartiges Verfahren für den 3D-Druck Decellularized Matrizen

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