Neuartiges Verfahren für den 3D-Druck Decellularized Matrizen
January 7th, 2019
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Polycaprolactons (PCL) Filament mit eingebetteten Polymilchsäure (PLA) Säure Mikrosphären die decellularized Matrizen (DM) für den 3D-Druck von strukturellen Gewebetechnik Konstrukte enthalten.
Diese Methode ermöglicht den Co-Druck sowohl von strukturellen Kunststoffen als auch von biologischen Komponenten für gewebegefertigte Gerüste. Diese Gerüste können die native Gewebeumgebung genauer replizieren, was für kultivierte Zellen von Vorteil sein kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie mechanisch fundierte Strukturen drucken kann, ohne das in den Gerüsten eingekapselte biologische Material in einer All-in-One-Technik für die Tissue-Engineering zu beschädigen.
Erzeugen Sie Mikrosphären mit der gewünschten Matrix gekapselt. Diese Mikrosphären wurden mit dezellularisiertem Knorpel aus Schweinehinterbeinen hergestellt. Sie variieren in der Größe.
Arbeiten Sie mit einer Siebmaschine, um Mikrosphären von uniformierter Größe zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die drei Siebschalen vor der Verwendung gründlich gereinigt und getrocknet wurden. Montieren Sie den Siebschüttler mit dem größeren Mesh-Tray oben und dem kleineren Netzteil in der Mitte.
Die Siebpfanne auf den Boden legen. Legen Sie trockene Mikrosphären in das oberste Tablett. Legen Sie dann den Deckel auf das Tablett.
Grobsieb für acht bis zehn Minuten. Dann feines Sieb für acht bis zehn Minuten. Während des Wartens wiegen Sie Das papier für die gesiebten Kugeln.
Wenn das Sieben abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig ein Siebtablett. Legen Sie das Fach auf den Kopf auf das Wägepapier. Tippen Sie vorsichtig auf die Seiten, um sicherzustellen, dass die meisten Kugeln herausfallen.
Wenn alle Siebplatten auf gewogenes Papier entleert sind, entsorgen Sie die übergroßen und untergroßen Kugeln. Die übrigen Kugeln haben die richtige Größe für die Verwendung in den nachfolgenden Schritten. Platzieren Sie diese Kugeln in ein beschriftetes Zentrifugenrohr.
Bewahren Sie das Rohr in einem 20 Grad Celsius Gefrierschrank auf, bis es benötigt wird. Wiegen Sie das Material, das notwendig ist, um das Filamentmaterial herzustellen. Machen Sie ein Ein-zu-vier-Gewicht-Verhältnis von Mikrosphären zu Polycaprolacton Pulver mit mindestens 25 Gramm Mikrosphären.
Die Pulvermischung auf einen Miniatur-Walzmischer übertragen. Mischen Sie das Pulver bei 20 Umdrehungen pro Minute für fünf Minuten. Beenden Sie nach fünf Minuten die Drehung und kippen Sie den Behälter.
Dann bei 20 Rpm für weitere fünf Minuten mischen. Um fortzufahren, nehmen Sie die Mischung zu einem Extruder- und Spooler-Setup. Richten Sie den Extruder so ein, dass sein Auslass etwa 60 Zentimeter vom Einlass eines Spoolers entfernt ist.
Achten Sie dann am Extruder-Heizelement darauf, dass es keine Isolierjacke gibt. Platzieren Sie einen Desktop-Lüfter etwa auf halbem Weg zwischen Extruder und Spooler, um das Extrudat zu kühlen. Setzen Sie einen weiteren Lüfter in die Nähe der Heizjacke, um sie mit Umgebungsluft zu kühlen.
Als nächstes stellen Sie sicher, dass die richtige Düse am Extruder befestigt ist und stellen Sie die Temperatur des Heizelements ein. Starten Sie die Kühllüfter und lassen Sie das Gerät einen stabilen Zustand erreichen. Nach 20 bis 30 Minuten die MikrosphärePCL-Mischung erhalten und den Extrudertrichter füllen.
Schalten Sie den Spooler und die Extruderschnecke ein, um die Filamentextrusion zu initiieren. Verwenden Sie Zangen und ziehen Sie manuell das erste extrudierte Filament. Führen Sie das Filament an den Filamentspooler.
Beachten Sie beim Extrudieren das Filament, um seine Zusammensetzung zu identifizieren. Nach einiger Zeit erscheint die Filamentzusammensetzung einheitlich, was gewünscht wird. Wrap Tape um das Filament, um den Beginn der einheitlichen Region zu markieren.
Überwachen Sie über die Spoolerwalzen hinaus den Durchmesser des Filaments. Verwenden Sie Sättel, um zu testen, ob der Durchmesser nahe an den gewünschten 1,75 mm liegt. Stellen Sie die Spooler- und Extrudergeschwindigkeiten und -temperaturen nach Bedarf ein.
Um den Filamentdurchmesser anzupassen, ändern Sie zunächst die Spooler- und Extrudergeschwindigkeiten. Sie können auch die Extrudertemperatur ändern, obwohl dies in der Regel nicht notwendig ist. Fahren Sie mit dem Nachfüllen des Trichters fort und extrudieren Sie, bis das gesamte Pulver verwendet ist.
Wenn der Trichter fast leer ist, fügen Sie dem Trichter PCL-Pulver hinzu, um das Mikrosphärengemisch auszuspülen. Überwachen Sie das Extrudat beim Hinzufügen des PCL-Pulvers. Zunächst werden Mikrosphären im Extrudat noch sichtbar sein.
Wenn keine Mikrosphären mehr sichtbar sind, beenden Sie das Hinzufügen der PCL. Trennen und beschriften Sie das Filament mit Mikrosphären in der gewünschten Konzentration. Wenn sich minimales Pulver im Trichter befindet, stoppen Sie das Extrudieren und schalten Sie das Gerät aus.
Das Filament kann in einem Standard-Fused-Depositionsmodellierungsdrucker verwendet werden. Laden Sie das Filament in den Drucker, der mit Düsen des gewünschten Durchmessers ausgestattet ist. Wenn das Modell geladen ist, stellen Sie die Temperatur und die Lineline-Geschwindigkeit für den Druck ein und beginnen Sie mit der Ablagerung des Filaments.
Das benutzerdefinierte Filament wird Schicht für Schicht abgelagert. Achten Sie besonders auf die erste Schicht und passen Sie die Einstellungen nach Bedarf an. Diese beiden 3D-gedruckten Gerüste sind in dieser Größenordnung schwer zu unterscheiden.
Man hat Filament, das Polycapralacton enthält, nur PCL. Das andere hat PCL-Filament mit eingebetteten Mikrosphären aus Polymilchsäure und dezellulierten Matrizen. Betrachtet man die Rasterelektronenmikroskopie, wirkt das PCL-Gerüst meist glatt.
Im Gegensatz dazu sind für das andere Filament Mikrosphären, die in die PCL eingebettet sind, in der gesamten Probe sichtbar. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass über- oder unterdimensionierte Mikrosphären die Strömungsdynamik des Materials im Extruder beeinflussen können. Achten Sie daher darauf, Ihre Mikrosphären vor der Anwendung richtig vorzubereiten.
Um den Abfall zu minimieren, ist es ratsam, eine große Charge Filament zu erstellen, die für alle Experimente erforderlich ist, anstatt häufiger kleinere Chargen zu erstellen. Die Expertise in der Filamentproduktion wird mit der Zeit kommen. Gerüste, die nach diesem Verfahren hergestellt werden, können in vitro und in vivo weiter bewertet werden, um zusätzliche Fragen zur verbesserten Induktion und mechanischen Festigkeit im Vergleich zu anderen biogedruckten Gerüsten zu beantworten.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Tissue-Engineering, um die kontragene Induktion von dezellularisierter Schweinematrix innerhalb der 3D-Gerüste zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit kleinen Partikeln Atemwegsgefahren darstellen kann. Das Tragen einer kleinen Partikelmaske wird während dieses Verfahrens empfohlen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Ko-Drucken struktureller Synthetika und biologischer Komponenten zur Erstellung von gewebegezüchteten Gerüsten. Diese Gerüste können die native Gewebeumgebung genauer replizieren und sind vorteilhaft für kultivierte Zellen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Gewebezüchtung
- 3D-Druck
- Biomaterialien
Hintergrund
- Dezellularisierte Matrizen (DM) werden zur Verbesserung der Gerüstfunktionalität eingesetzt.
- Polycaprolacton (PCL) und Polymilchsäure (PLA) sind Schlüsselmaterialien bei der Gerüstproduktion.
- Mikrosphären können biologische Materialien ohne Beschädigung verkapseln.
- Diese Technik ermöglicht die Integration von mechanischen und biologischen Eigenschaften in Gerüste.
Zweck der Studie
- Mechanisch stabile gewebegezüchtete Gerüste herzustellen.
- Dezellularisierte Matrizen in Mikrosphären für verbesserte Zellkultur zu verkapseln.
- Eine Methode zu entwickeln, die strukturelle und biologische Komponenten in einem Druckprozess kombiniert.
Verwendete Methoden
- Herstellung von PCL-Filament mit eingebetteten PLA-Mikrosphären.
- Verwendung von dezellularisiertem Knorpel aus Schweinehinterbeinen.
- 3D-Drucktechniken für die Gerüstfertigung.
- Charakterisierung von Mikrosphärengröße und -eigenschaften.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erstellung von Gerüsten, die die strukturelle Integrität beibehalten.
- Nachgewiesene Fähigkeit, biologische Materialien effektiv zu verkapseln.
- Verbesserte Zellkulturbedingungen innerhalb der Gerüste gezeigt.
- Methode zur Herstellung komplexer gewebegezüchteter Konstrukte validiert.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode erhöht das Potenzial für die Erstellung funktionaler Gewebegerüste.
- Ko-Drucktechniken können die Lücke zwischen synthetischen und biologischen Materialien überbrücken.
- Zukünftige Anwendungen könnten regenerative Medizin und Gewebereparatur umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Integrating decellularized matrices within 3D-printed scaffolds enables the creation of tissue-engineered constructs that combine mechanical integrity with biologic functionality. This approach addresses a critical challenge in early discovery and preclinical research by preserving bioactivity during fabrication, supporting predictive confidence in tissue modeling. The method positions bioprinting as a platform for developing disease-relevant systems and advancing translational biomaterials research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-matrix interactions in a controlled 3D environment.
- Supports functional validation of biomaterial cues for progenitor cell behavior.
- Facilitates mechanistic de-risking by preserving biologic agent activity during scaffold fabrication.
- Improves predictive confidence in tissue engineering hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible 3D scaffolds for downstream cell-based assays.
- Enables quantitative comparison of scaffold surface features and cell responses.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound or biomaterial screening.
- Prepares validated biological systems for reliable evaluation of regenerative cues.
Translational & Preclinical Research
- Aligns scaffold composition with disease-relevant tissue environments for translational studies.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of tissue repair strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by maintaining biologic function in constructs.
- Facilitates in vitro and in vivo assessment of scaffold performance.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, assay development, and preclinical research by enabling the fabrication of biologically active, mechanically robust 3D scaffolds.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell-matrix interactions and biological de-risking.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative scaffold outputs for assay readiness.
- Analytics: Provides measurable surface features and composition for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains functional biomaterial cues for preclinical model alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for diverse tissue engineering applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence and target validation in tissue engineering.
- Operational Value: Standardizes scaffold production with reproducible and scalable outputs.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk and supports efficient go/no-go decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of regenerative medicine programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterials processing and 3D printing instrumentation.
- Demands analytical infrastructure for scaffold characterization and quality control.
- Necessitates cross-team standardization of microsphere preparation and extrusion parameters.
- Adaptation may be needed for different tissue types or biologic agents.
- Proper handling of particulates and batch scaling are essential for reproducibility and safety.
