Neuartiges Verfahren für den 3D-Druck Decellularized Matrizen
7. Januar 2019
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Polycaprolactons (PCL) Filament mit eingebetteten Polymilchsäure (PLA) Säure Mikrosphären die decellularized Matrizen (DM) für den 3D-Druck von strukturellen Gewebetechnik Konstrukte enthalten.
Diese Methode ermöglicht den Co-Druck sowohl von strukturellen Kunststoffen als auch von biologischen Komponenten für gewebegefertigte Gerüste. Diese Gerüste können die native Gewebeumgebung genauer replizieren, was für kultivierte Zellen von Vorteil sein kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie mechanisch fundierte Strukturen drucken kann, ohne das in den Gerüsten eingekapselte biologische Material in einer All-in-One-Technik für die Tissue-Engineering zu beschädigen.
Erzeugen Sie Mikrosphären mit der gewünschten Matrix gekapselt. Diese Mikrosphären wurden mit dezellularisiertem Knorpel aus Schweinehinterbeinen hergestellt. Sie variieren in der Größe.
Arbeiten Sie mit einer Siebmaschine, um Mikrosphären von uniformierter Größe zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die drei Siebschalen vor der Verwendung gründlich gereinigt und getrocknet wurden. Montieren Sie den Siebschüttler mit dem größeren Mesh-Tray oben und dem kleineren Netzteil in der Mitte.
Die Siebpfanne auf den Boden legen. Legen Sie trockene Mikrosphären in das oberste Tablett. Legen Sie dann den Deckel auf das Tablett.
Grobsieb für acht bis zehn Minuten. Dann feines Sieb für acht bis zehn Minuten. Während des Wartens wiegen Sie Das papier für die gesiebten Kugeln.
Wenn das Sieben abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig ein Siebtablett. Legen Sie das Fach auf den Kopf auf das Wägepapier. Tippen Sie vorsichtig auf die Seiten, um sicherzustellen, dass die meisten Kugeln herausfallen.
Wenn alle Siebplatten auf gewogenes Papier entleert sind, entsorgen Sie die übergroßen und untergroßen Kugeln. Die übrigen Kugeln haben die richtige Größe für die Verwendung in den nachfolgenden Schritten. Platzieren Sie diese Kugeln in ein beschriftetes Zentrifugenrohr.
Bewahren Sie das Rohr in einem 20 Grad Celsius Gefrierschrank auf, bis es benötigt wird. Wiegen Sie das Material, das notwendig ist, um das Filamentmaterial herzustellen. Machen Sie ein Ein-zu-vier-Gewicht-Verhältnis von Mikrosphären zu Polycaprolacton Pulver mit mindestens 25 Gramm Mikrosphären.
Die Pulvermischung auf einen Miniatur-Walzmischer übertragen. Mischen Sie das Pulver bei 20 Umdrehungen pro Minute für fünf Minuten. Beenden Sie nach fünf Minuten die Drehung und kippen Sie den Behälter.
Dann bei 20 Rpm für weitere fünf Minuten mischen. Um fortzufahren, nehmen Sie die Mischung zu einem Extruder- und Spooler-Setup. Richten Sie den Extruder so ein, dass sein Auslass etwa 60 Zentimeter vom Einlass eines Spoolers entfernt ist.
Achten Sie dann am Extruder-Heizelement darauf, dass es keine Isolierjacke gibt. Platzieren Sie einen Desktop-Lüfter etwa auf halbem Weg zwischen Extruder und Spooler, um das Extrudat zu kühlen. Setzen Sie einen weiteren Lüfter in die Nähe der Heizjacke, um sie mit Umgebungsluft zu kühlen.
Als nächstes stellen Sie sicher, dass die richtige Düse am Extruder befestigt ist und stellen Sie die Temperatur des Heizelements ein. Starten Sie die Kühllüfter und lassen Sie das Gerät einen stabilen Zustand erreichen. Nach 20 bis 30 Minuten die MikrosphärePCL-Mischung erhalten und den Extrudertrichter füllen.
Schalten Sie den Spooler und die Extruderschnecke ein, um die Filamentextrusion zu initiieren. Verwenden Sie Zangen und ziehen Sie manuell das erste extrudierte Filament. Führen Sie das Filament an den Filamentspooler.
Beachten Sie beim Extrudieren das Filament, um seine Zusammensetzung zu identifizieren. Nach einiger Zeit erscheint die Filamentzusammensetzung einheitlich, was gewünscht wird. Wrap Tape um das Filament, um den Beginn der einheitlichen Region zu markieren.
Überwachen Sie über die Spoolerwalzen hinaus den Durchmesser des Filaments. Verwenden Sie Sättel, um zu testen, ob der Durchmesser nahe an den gewünschten 1,75 mm liegt. Stellen Sie die Spooler- und Extrudergeschwindigkeiten und -temperaturen nach Bedarf ein.
Um den Filamentdurchmesser anzupassen, ändern Sie zunächst die Spooler- und Extrudergeschwindigkeiten. Sie können auch die Extrudertemperatur ändern, obwohl dies in der Regel nicht notwendig ist. Fahren Sie mit dem Nachfüllen des Trichters fort und extrudieren Sie, bis das gesamte Pulver verwendet ist.
Wenn der Trichter fast leer ist, fügen Sie dem Trichter PCL-Pulver hinzu, um das Mikrosphärengemisch auszuspülen. Überwachen Sie das Extrudat beim Hinzufügen des PCL-Pulvers. Zunächst werden Mikrosphären im Extrudat noch sichtbar sein.
Wenn keine Mikrosphären mehr sichtbar sind, beenden Sie das Hinzufügen der PCL. Trennen und beschriften Sie das Filament mit Mikrosphären in der gewünschten Konzentration. Wenn sich minimales Pulver im Trichter befindet, stoppen Sie das Extrudieren und schalten Sie das Gerät aus.
Das Filament kann in einem Standard-Fused-Depositionsmodellierungsdrucker verwendet werden. Laden Sie das Filament in den Drucker, der mit Düsen des gewünschten Durchmessers ausgestattet ist. Wenn das Modell geladen ist, stellen Sie die Temperatur und die Lineline-Geschwindigkeit für den Druck ein und beginnen Sie mit der Ablagerung des Filaments.
Das benutzerdefinierte Filament wird Schicht für Schicht abgelagert. Achten Sie besonders auf die erste Schicht und passen Sie die Einstellungen nach Bedarf an. Diese beiden 3D-gedruckten Gerüste sind in dieser Größenordnung schwer zu unterscheiden.
Man hat Filament, das Polycapralacton enthält, nur PCL. Das andere hat PCL-Filament mit eingebetteten Mikrosphären aus Polymilchsäure und dezellulierten Matrizen. Betrachtet man die Rasterelektronenmikroskopie, wirkt das PCL-Gerüst meist glatt.
Im Gegensatz dazu sind für das andere Filament Mikrosphären, die in die PCL eingebettet sind, in der gesamten Probe sichtbar. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass über- oder unterdimensionierte Mikrosphären die Strömungsdynamik des Materials im Extruder beeinflussen können. Achten Sie daher darauf, Ihre Mikrosphären vor der Anwendung richtig vorzubereiten.
Um den Abfall zu minimieren, ist es ratsam, eine große Charge Filament zu erstellen, die für alle Experimente erforderlich ist, anstatt häufiger kleinere Chargen zu erstellen. Die Expertise in der Filamentproduktion wird mit der Zeit kommen. Gerüste, die nach diesem Verfahren hergestellt werden, können in vitro und in vivo weiter bewertet werden, um zusätzliche Fragen zur verbesserten Induktion und mechanischen Festigkeit im Vergleich zu anderen biogedruckten Gerüsten zu beantworten.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Tissue-Engineering, um die kontragene Induktion von dezellularisierter Schweinematrix innerhalb der 3D-Gerüste zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit kleinen Partikeln Atemwegsgefahren darstellen kann. Das Tragen einer kleinen Partikelmaske wird während dieses Verfahrens empfohlen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum gleichzeitigen Druck von strukturellen Synthetika und biologischen Komponenten, um gewebeengineeringbasierte Gerüste herzustellen. Diese Gerüste können das native Gewebemilieu genauer nachbilden und somit kultivierten Zellen zugutekommen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Gewebetechnik
- 3D-Druck
- Biomaterialien
Hintergrund
- Entzelligte Matrizes (DM) werden verwendet, um die Funktionalität von Gerüsten zu verbessern.
- Polycaprolacton (PCL) und Polylactid (PLA) sind Schlüsselmaterialien in der Gerüsterzeugung.
- Mikrokügelchen können biologische Materialien einhüllen, ohne diese zu schädigen.
- Diese Technik ermöglicht die Integration mechanischer und biologischer Eigenschaften in Gerüste.
Zweck der Studie
- Herstellung mechanisch stabiler, gewebetechnisch hergestellter Gerüste.
- Einschließung von dezellularisierten Matrizen in Mikrosphären zur Verbesserung der Zellkultur.
- Entwicklung einer Methode, die strukturelle und biologische Komponenten in einem einzigen Druckverfahren kombiniert.
Verwendete Methoden
- Herstellung von PCL-Filament mit eingebetteten PLA-Mikrosphären.
- Verwendung von entzelluliertem Knorpel aus Schweinen hinteren Gliedmaßen.
- 3D-Drucktechniken zur Herstellung von Gerüsten.
- Charakterisierung der Größe und Eigenschaften der Mikrosphären.
Hauptergebnisse
- Erfolgreich erzeugte Gerüste, die strukturelle Integrität aufrechterhalten.
- Nachweis der Fähigkeit, biologische Materialien effektiv einzukapseln.
- Verbesserte Zellkulturbedingungen innerhalb der Gerüste gezeigt.
- Methode zur Herstellung komplexer, gewebeengineeringbasierter Konstrukte validiert.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode erhöht das Potenzial zur Herstellung funktioneller Gewebegerüste.
- Kombinierte Drucktechniken können die Lücke zwischen synthetischen und biologischen Materialien schließen.
- Zukünftige Anwendungen könnten regenerative Medizin und die Reparatur von Gewebe umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Integration von entzellulären Matrizen in 3D-gedruckten Gerüsten ermöglicht die Herstellung von gewebeengineeringbasierten Konstrukten, die mechanische Stabilität mit biologischer Funktionalität verbinden. Dieser Ansatz begegnet einer zentralen Herausforderung in der frühen Forschung und präklinischen Untersuchung, indem er die Bioaktivität während der Herstellung erhält und somit das Vorhersagevertrauen in der Gewebemodellierung stützt. Die Methode positioniert das Bioprinting als Plattform zur Entwicklung krankheitsrelevanter Systeme und zur Weiterentwicklung translationsorientierter Biomaterialforschung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von Zell-Matrix-Interaktionen in einer kontrollierten 3D-Umgebung.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung biomaterialbedingter Signale für das Verhalten von Vorläuferzellen.
- Erleichtert die mechanistische Risikominimierung, indem die biologische Aktivität von Wirkstoffen während der Gerüstherstellung erhalten bleibt.
- Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich Hypothesen in der Gewebeengineering-Forschung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert standardisierte, reproduzierbare 3D-Gerüste für nachgeschaltete zellbasierte Assays.
- Ermöglicht den quantitativen Vergleich von Oberflächenmerkmalen der Gerüste und zellulären Reaktionen.
- Unterstützt die Skalierbarkeit von Assays und die Wiederverwendung von Plattformen für die Screening von Wirkstoffen oder Biomaterialien.
- Bereitet validierte biologische Systeme für die zuverlässige Bewertung regenerativer Signale vor.
Translationale und präklinische Forschung
- Passt die Gerüstzusammensetzung an krankheitsrelevante Gewebemilieus für translationsmedizinische Studien an.
- Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung von Gewebereparaturstrategien.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen für die Weiterentwicklung, indem die biologische Funktion in den Konstrukten erhalten bleibt.
- Erleichtert die in-vitro- und in-vivo-Bewertung der Gerüstleistung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode verbindet die frühe Entdeckung, die Assay-Entwicklung und die präklinische Forschung, indem sie die Herstellung biologisch aktiver, mechanisch stabiler 3D-Gerüste ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zu Zell-Matrix-Interaktionen und die biologische Risikominderung.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Gerüstausgaben für die Bereitschaft von Assays.
- Analytik: Bietet messbare Oberflächenmerkmale und -zusammensetzung für den vergleichenden Nachweis.
- Translationale Forschung: Erhält funktionelle biomaterielle Signale zur Abstimmung mit präklinischen Modellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen wiederverwendbaren Arbeitsablauf für vielfältige Anwendungen in der Gewebetechnik.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und die Validierung von Zielstrukturen im Gewebeengineering.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Herstellung von Gerüsten mit reproduzierbaren und skalierbaren Ergebnissen.
- Strategischer Wert: Verringert biologische Risiken in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien und unterstützt effiziente Go/No-Go-Entscheidungen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Programmen in der regenerativen Medizin.
Durchführungsaspekte
- Benötigt Fachkenntnisse in der Verarbeitung von Biomaterialien und der Instrumentierung des 3D-Drucks.
- Erfordert analytische Infrastruktur zur Charakterisierung und Qualitätskontrolle von Gerüsten.
- Setzt eine Standardisierung der Mikrokugelherstellung und Extrusionsparameter über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus.
- Kann je nach Gewebetyp oder biologischem Wirkstoff Anpassungen erfordern.
- Korrektes Handling von Partikeln und die Skalierung von Chargen sind für Reproduzierbarkeit und Sicherheit unerlässlich.
