Name: Pseudomonas Aeruginosa mit einem automatisierten höheren Durchsatz mikrofluidischen System Zelle Analyse der Schubspannung weiterleben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Analyse von Scherkräften auf Pseudomonas aeruginosa-Biofilme mit einem hochdurchsatzfähigen mikrofluidischen Bioreaktor. Diese Methode ermöglicht schnelle, statistisch signifikante Ergebnisse zur Biofilmentwicklung.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute für allgemeine medizinische Wissenschaft (NIGMS) (5P20GM103427), eine Komponente des National Institute of Health (NIH) möglich

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das mikrofluidischen System und Bild Analyseverfahren diskutiert hier konzentriert sich auf die Ausführung von mikrofluidischen Biofilm Experimente zur morphologische Eigenschaften bestimmen, die nicht die volle dreidimensionale Informationen in der Regel aus konfokale benötigen Mikroskop-Studien. Dazu gehörten Microcolony Substrat Abdeckung (prozentuale Abdeckung), Oberflächenrauhigkeit, gemessen an der Rauheit Koeffizient und strukturelle Entropie. Eine Methode zur Schätzung der gesamten relativen Biofilm Zelle Ansammlung wird ebenfalls dargestellt von welchen Wachstumsraten im Protokoll Phase berechnet werden kann.
Es gibt mehrere kleine, aber wichtige Schritte, die in dieser Methode hervorgehoben werden sollte. Wischen die Oberfläche mit Alkohol vermeidet Kontamination von anderen Bakterien in going von Experiment zu Experiment, aber auch von Brunnen zu Brunnen in einem Experiment. Grundierung und Aussaat sind ebenfalls sehr wichtig, weil Priming ermöglicht es dem Benutzer zu bestimmen, welche Kanäle die Medien durch die Kanäle ungestört fließen zulassen oder Verstopfung. Kanäle sollte auch nicht gestört (d. h. sie sollten ständig voller Medien sein) nach dem Grundieren zur Erhöhung der Chancen auf ein erfolgreiches Experiment mit keine Luftblasen oder verstopfen. Die Aussaat Schritt variiert werden nach der Art der Bakterien und sollte also für Zellhaftung optimiert werden. Zum Beispiel wenn Zellen nicht zu legen scheinen, Oberflächenmodifikationen möglicherweise auf der Mikrofluidik-Platte vor der Aussaat auftreten oder längere Inkubationen Zeiten erforderlich sein. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass das Mikroskop korrekt eingerichtet ist, dass ein Bild im Fokus zu erhalten und sollten in regelmäßigen Abständen überwacht werden, während das Experiment zu versichern, dass die Bildqualität erzielt werden. Wenn der Fokus deaktiviert ist, wird das Mikroskop kann und sollte angepasst werden, wie das Experiment geht weiter. Während die Bild-Erfassungszeit sollte die letzte Wellenlänge Alle geschlossen festgelegt werden, zur Vermeidung die Exposition von Filter und Beleuchtung, nur einen Kanal während der Wartezeit, die zwischen den Bild-Akquisitionen auftritt. Auch war die Bildanalyse, die bestimmt, die % Flächendeckung im Haus konzipiert, da Montage-Software-Handbuch nicht explizit beschrieben. Darüber hinaus um zu erweitern auf die Bildanalyse und andere Merkmale wie Oberflächenrauhigkeit usw.zu bestimmen., open Source Python-basierten Code45 wurde im Haus und freigegebenen auf GitHub Repository entwickelt. Es gibt auch Einschränkungen auf wie viele Daten können gespeichert und verwaltet auf der lokalen Festplatte, so dass eine externe Festplatte oder Online-Datenaustausch wie CyVerse46erforderlich ist.
Herkömmlichen Bioreaktoren, wie dem CDC-Reaktor und die Tropfen fließen Reaktor34, erfordert viel Medien bieten weniger Stichprobengrößen und verlangen ein hohes Maß an Sterilisation der Geräte. Im Gegensatz dazu die Vorteile dieser höheren Durchsatz-Plattform gehört die Fähigkeit, Kontrolle Scherung, Durchflussmengen, und die Annahme, dass die in-vitro- Experimenten eng ähneln in Vivo -Bedingungen. Nachteile des Systems gehören mehrere Zubehör und Software, die erfordern eine sorgfältige einrichten, die in der richtigen Reihenfolge der Ereignisse durchgeführt werden muss. Darüber hinaus die Anleitung, die für die Ausrüstung bereitgestellt wird nicht vollständig zu erklären jeden Schritt der Experimente und die Softwarebefehle, und folglich viele Fehler auftreten, während der Experimente, einschließlich Verstopfung der Kanäle, Mangel an Wachstum oder Anlage, oder der Mangel an qualitativ hochwertige Mikroskopie Bilder oder Filme. Das Instrument selbst und Verbrauchsmaterialien, wie die mikrofluidischen Platten sind auch mit einem Preis von über $200 pro Platte relativ teuer und sind nicht wiederverwendbar. So, während die Technik starke Ergebnisse verleiht, technische Fachkenntnisse für seine Verwendung ist relativ hoch und erfordert wiederholte Ausbildung von Experten auf dem Gebiet. Dieser Bericht versucht, dieses Problem zu beheben, indem Sie eine Anleitung für neue Benutzer von diesen Bioreaktoren Biofilme Eigenschaften zu studieren.
Das mikrofluidischen System, das zelluläre Analyse durchführen kann, hat beträchtliche Aufmerksamkeit für verschiedene wissenschaftliche Modalitäten, wie z. B. in Mikrobiologie, Immunologie, Hämatologie, Onkologie und Stammzellenforschung gewonnen. Genauer gesagt, hat die Technologie führte in vielen Publikationen beschreiben Themen, die für medizinische Anwendungen37,47, einschließlich mikrobielle mündliche Adhäsion48, Bestimmung der Auswirkungen von großer Bedeutung sind Biosurfactants auf Pseudomonas Aeruginosa und Staphylococcus Aureus49,50, host-Pathogen Interaktionen in E. Coli51, Streptococcus Einhaltung52und Behandlung Mukoviszidose-53. Angesichts der Tatsache, dass dieses mikrofluidischen System sehr vielseitig ist, ist davon auszugehen, dass immer mehr Systeme in der ganzen Welt verteilt werden.
Einige spezifische Protokoll Schritte sollte sorgfältig abgewogen werden. Medien können verdünnt werden, um 50 % mit dH2O zur Vermeidung von Luftblasen und Verstopfungen aber war in diesem Fall nicht erforderlich. Der spezifische Wert der OD600 verwendet für die Aussaat muss ermittelt werden, mit Probeläufen eines Experiments Wachstum um zu sehen, was funktioniert am besten für die bestimmten Satz von Bedingungen verwendet. Luftblasen in den Brunnen vor dem Versiegeln zu Bläschen in mikrofluidischen Kanälen führen können und sollte entfernt werden, durch geknallt oder mit einer Pipettenspitze abgesaugt. Es ist wichtig, um Bakterien aus den kleinen Serpentinen Kanälen zu halten. Dadurch, dass gleiche Mengen an Medien in die ein- und Ausgabe bei der Aussaat, wird Fluss aufgrund des Drucks durch das Flüssigkeitsvolumen gesteuert werden, also nur durch den anliegenden Druck aus dem System läuft. Die Kalibrierung Entfernungen sollten durch die Vertreter des Unternehmens während der Installation eingerichtet werden. Diese Einstellungen sind spezifisch für jede Kamera.
Es gibt mehrere Herausforderungen, die auftreten, wenn die repräsentativsten Schwelle für ein Bild zu finden. Maximale Grenzwerte festlegen kann schwierig sein, wenn die durchschnittliche Pixel Intensität in den Regionen des Hintergrundes verursacht entweder wählen Sie eine Bühne-Position, die nicht in der Mitte des Kanals oder Trümmer auf der Platte ist nicht konsistent sind. Klicken Sie unter MM Standardauf Vorgang, und wählen Sie Hintergrund und Shading Korrektur -Tool zur Korrektur für diese Ungereimtheiten. Dieses Tool ist jedoch im Allgemeinen nur hilfreich, wenn der Nutzer Bilder der Kanäle vor der Aussaat getroffen hat, die sie als Referenzbilder verwenden können. Oder, wenn Hintergrundschattierung/Referenz Bilder sind nicht verfügbar, der Benutzer muss ihr Urteil zu verwenden, um ein Schwellenwert festgelegt, die die meisten Zelle Bereich abdeckt, ohne Hintergrund für das gesamte Bild. Alternativ wählen Sie repräsentative Bereiche zu messen, die Regionen der Inkonsistenz durch Klick Rechteckigen Bereich, Ellipse Regionoder Trace Region , wählen eine Region und Aktiven Region anstatt gesamte ausschließen Bild auf Fenster Zeigen Statistiken zu einer Region (unter Analyse-Tools). Wenn eine repräsentative Region genutzt wird für Schwellwerte das Hellfeld-Bild, die gleiche Region für Messung des entsprechenden Bildes FITC verwendet werden soll. Es ist hilfreich, erfassen die spezifische räumlichen Statistiken (Links, Top, Breite, Höhe, Fläche, Umfang) dieser repräsentativen Region zugeordnet, so dass die gleiche Region gefunden werden und gemessen auf das entsprechende Bild, FITC.
Um eine Ansammlung von Daten auf der Festplatte zu verhindern, durch die den Computer langsamer wird, kann eine externe Festplatte für die Datenspeicherung erworben werden. Eine weitere Option für die Datenspeicherung und erleichtern den Datenaustausch ist die CyVerse-Bioinformatik-Plattform. Erstellen Sie ein Konto auf dem CyVerse-System, indem Sie auf http://www.cyverse.org/. Einmal eingeloggt, starten Sie die Entdeckung-Umgebung zu und wählen Sie dann "Log in CyVerse". Wählen Sie "Daten" und navigieren Sie zu du hast den Ordner. Wenn der Bild-Stack auf dem lokalen Computer ist, wählen Sie "hochladen" und dann "Einfache Hochladen von Desktop". Finden Sie die Image-Stapel-Datei und wählen Sie für den Upload. Die Datei oder einen Ordner kann mit Mitarbeitern geteilt werden, wenn sie ein CyVerse-Konto und Berechtigung erteilt werden. Freigeben des Ordners Data für die breite Öffentlichkeit erfordert, dass die Metadaten hinzugefügt werden für jede Datei mit CyVerse Normen zugelassen. Dieses Verfahren wird hier nicht diskutiert werden, weil dies nicht im Rahmen dieser Arbeit ist.

Hier zeigen wir ein Verfahren zur Messung der Wirkung der Schubspannung auf die Bildung von Leuchtstofflampen Pseudomonas Aeruginosa (p. Aeruginosa) PA01 Biofilme mit einem automatisierten höheren Durchsatz mikrofluidischen System.
Biofilme sind Gemeinschaften von Mikroorganismen, wie Bakterien, organisiert von einer extrazellulären Polymeren Substanz, die an einem Träger befestigt sind, und sind in der Regel an der Grenzfläche zwischen einer Flüssigkeit und eine solide Oberfläche1gefunden. Dieser Biofilm Gemeinschaften kann vorteilhaft für die Umwelt, wie z. B. Verbesserung der Wasserqualität in Wasserleitungen und Bioremediation von widerspenstigen2,3Verbindungen. Biofilme kann jedoch auch sehr schädlich für die menschliche Gesundheit mit unerwünschten Folgen. Z. B. sind medizinische Geräte, wie z. B. Hüft- und Kniegelenke Implantate eine Art von Oberfläche wo Biofilm Ansammlung war eine Herausforderung und verursacht schwerwiegende medizinische Komplikationen4,5. Biofilme können auch geben Sie natürlichen Wasser-Systeme, wie Flüsse und Seen, und Wasserleitungen zu Bakterien Verunreinigungen im Trinkwasser, was zu Infektionen6,7,8zu infiltrieren. Biofilme Marineumwelt gegründet, Schiffen und anderen künstlichen Substraten haften und präsentieren ein großes Problem der wirtschaftlichen und ökologischen, wie erhöhter Reibung führt um zu Kraftstoff Verbrauch9,10zu erhöhen. Antimikrobielle Beschichtungen, wie z. B. Tributyltin, wurden entwickelt, um diese Probleme zu vermeiden, sondern sind giftig für Meereslebewesen11.
P. Aeruginosa ist ein gramnegatives Bakterium mit hohen blühende Fähigkeiten in einer Vielzahl von Umwelt-und nutrimental12. P. Aeruginosa ist eine häufige Ursache von Gemeinschaft und nosokomiale Infektionen und fand genau zu Verletzungen wie Verbrennungen und immungeschwächten Gastgeber, wie z. B. bei zystischer Fibrose (CF)5,12verbunden sind, 13, AIDS und Krebs Patienten5,13. Die Bildung von p. Aeruginosa Biofilms ist am schwersten zu CF, verbunden, wo chronische Lungenentzündungen die häufigste Todesursache für diese Krankheit5 sind.
Ein Referenz-Stamm von p. Aeruginosa, PA01, wird in diesem Bericht verwendet und ist genetisch verändert, um eine verbesserte grün fluoreszierendes Protein (PA-EGFP) auszudrücken. EGFP repräsentiert eine mutierte Form des GFP mit größeren Fluoreszenzeigenschaften ermöglicht eine in Situ Biofilm Analyse mit Fluoreszenz-Mikroskopie14,15,16. Diese Art der Fluoreszenzanalyse ist vorteilhaft für die Untersuchung von Biofilmen, weil GFP deutlich Zellwachstum und Funktion17nicht stört. Zum Beispiel wuchs Escherichia coli Zellen, die mit GFP markiert waren gut und kontinuierlich ohne toxischen Nebenwirkungen im Vergleich zu der Kontrolle Bakterien17erlitten. Andere Berichte belegen diesen Anspruch18,19,20. Darüber hinaus die Verwendung von fluoreszierenden Reporter wie EGFP ist schnell und einfach, aber nur lebende Zellen werden gemessen werden, da abgestorbene Zellen schnell aufhören zu21fluoreszieren.
Biofilme können unter verschiedenen Umweltbedingungen, einschließlich derjenigen mit unterschiedlichen Strömungsgeschwindigkeiten wachsen. Beispielsweise können Filme in Flüssen, wie z. B. in hohen Scherbeanspruchung wachsen wo Hochwasser Strömungsverhältnisse zu einer größeren mikrobiellen Diversität22 führen. Im Gegensatz dazu stehendes Wasser in Teichen oder orale Biofilme erleben Sie eine viel geringere Scherkräfte Kraft23. Neben Durchfluss, gibt es andere Faktoren, die Einfluss auf Biofilm Haftung, einschließlich Oberflächenrauhigkeit und Hydrophobie, Medienkomposition, und sogar die bakterielle Zelle Oberfläche1,4,7, 24. Bedingungen kann auch Unterschiede in der räumlichen Struktur oder Morphologie der Biofilm. Dazu gehören Umwelteinflüsse wie Scherbeanspruchung von sich bewegenden Flüssigkeit ausgeübten oder Farbverläufe in Nährstoffverfügbarkeit und biologische Faktoren wie die Art zu präsentieren, in das System, Beweglichkeit der Zellen und die spezifische Proteine in der extrazellulären Polymeren Substanz25,26,27. Unter bestimmten Bedingungen wird der Biofilm Rasen-wie sein (glatt und flach), während unter anderen Bedingungen der Biofilm wird rau, flauschige, oder auch Pilz-wie28. Während der qualitative Unterschied zwischen Biofilm Rasenflächen und Pilz Strukturen in mikroskopische Aufnahmen deutlich zu erkennen, erfordert Verständnis der Beziehung zwischen Filmstruktur und biologische Prozesse innerhalb des Films, systematische und quantitative Methoden zur Beschreibung der Morphologie. Morphologische Eigenschaften, die für die Studie von Forschern vorgeschlagen sind, Porosität, Fraktale Dimension, Diffusionsprozess Länge, Microcolony Bereich am Substrat, Microcolony Volumen, Rauheit Koeffizient und strukturelle Entropie29,30 .
Bioreaktoren werden in der Studie von Biofilmen zur realen Bedingungen31zu imitieren. Tropf-Fluss-Reaktoren (DFR) stellen eine Low-Shear Umwelt wo Nährstoffe in den Medien langsam über Zellen fließen, die an einer Oberfläche im Laufe der Zeit bilden einen Biofilm mit einer hohen Dichte32angeschlossen werden. CDC-Reaktoren sind Bioreaktoren, die sich ständig verändernden Umfeld eine hohe Scherspannung durch Kontrolle über einen Rührstab zu erstellen, die ständig in den Medien dreht Tank33gefüllt. Diese Arten von Bioreaktoren sind einfach einzurichten, aber sie sind im Umfang begrenzt, wegen des relativ geringen Stichprobenumfangs, der hohe Verbrauch von Medien, große Mengen an biogefährlichen Abfällen aus Medienströme Tropfen für Tropfen fließen Reaktoren 125 µL/Minute bis hin auf mehr als 1 mL/min für CDC-Reaktoren und die Notwendigkeit, Autoklaven große Mengen von Glaswaren und Abfall Medien34. Biofilme wachsen nicht gleichmäßig über die Oberfläche in einem Tropfen fließen Reaktor weil die geringe Scherkräfte Medien bewirkt, dass nachfolgende entlang der größeren Konglomeraten von p. Aeruginosa Bakterien daher, der Biofilm nicht sehr glatt wächst und die unebenen Proben nicht Fluoreszenz-Mikroskopie35,36 leicht analysiert werden.
Einige gemeinsame Bioreaktor Einschränkungen mithilfe eines Medium-Durchsatz mikrofluidischen Bioreaktors, wo nur Milliliter Medien erforderlich sind, und die Reaktion-Platten sind klein und leicht verfügbare nach Autoklavieren37. Darüber hinaus können je nach Anzahl der Bohrungen, viele Wiederholungen in einem Reaktor laufen, bietet die ausreichende Menge an Daten aussagekräftige statistische Analysen durchgeführt werden. In Abbildung 1sind die verschiedenen Komponenten des Systems der Mikrofluidik-Mikroskopie, die kontrollierten Bedingungen, einschließlich Temperatur ermöglichen und flow Rate38,39,40, dargestellt. Der Bioreaktor ist mit Fluoreszenz-Mikroskopie, die Fluoreszenz des EGFP Tags im PA01 unter visualisieren gekoppelt angewendet tief durch hohe Scherkräfte Bedingungen, die realistischere Szenarien zu imitieren, die in der Umgebung oder im biomedizinischen Bereich anzutreffen sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig1.jpg"> Abbildung 1 : Einzelkomponenten des Systems mikrofluidischen. Die einzelnen Komponenten sind von links nach rechts aufgeführt: 1. CCD-Kamera, 2. hohe Auflösung Inverted Mikroskop mit automatisierten Bühne, Fluoreszenz-Modul automatisiert und Autofokus-Modul, 3. Platte 4.Etappe: Imaging-System-Schnittstelle, 5: Handbuch Mikroskoptisch Regler 6: Dampf-Trap, 7: Imaging-System Controller (einschließlich Temperaturregler), 8: Hardware-Controller, 9: Fluoreszenz-Controller, 10: unterbrechungsfreie Stromversorgung, 11: externe Festplatte für Bildspeicher, 12: PC-Arbeitsplatz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ein Auszug aus der Mikrofluidik-Platte ist in Abbildung 2dargestellt. Die am häufigsten verwendeten Platten bestehen aus 48 Brunnen. Ein Experiment erfordert einen Einlass und einem Auslass Wells, insgesamt 2 Brunnen. Dies ermöglicht 24 gleichzeitige Experimente, die durchgeführt werden können mit verschiedenen experimentellen Bedingungen, wie z. B. Bakterienstämme, antimikrobielle Behandlung und Medien vielfältig von Kanal zu Kanal und Schubfluss für jede Spalte der sechs Kanäle gesteuert. Die experimentelle Temperaturregelung ist auch mit einer Temperatureinstellung in der Platte. Mikrofluidische Kanäle zeigen, dass jeder Kanal eine serpentine Region hat Bereitstellung ausreichender Gegendruck und kontrollierte Scherung.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig2.jpg"> Abbildung 2: Visualisierung der mikrofluidische Kanäle und Sichtfenster. Zwei Einlass und Auslass Brunnen mit verbindenden mikrofluidische Kanäle sind mit roten und grünen Farbstoffen markiert. Der Farbstoff macht in jedem Kanal schafft genügend Gegendruck und kontrollierten Schub während Flüssigkeitsströmung eine serpentine Region sichtbar. Jedes Anzeigekanal (innerhalb des roten Kreises) kann mit gewünschten Wellenlängen abgebildet werden. Gezeigt werden Hellfeld (oben) und Leuchtstoffröhren (unten) Mikroskopie Bilder eines einzelnen Kanals mit einem PA01-EGFP Biofilm mit einem 20 X Objektiv. Maßstabsleiste = 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung wird bereitgestellt, damit die Benutzer von mikrofluidischen Bioreaktoren, die mit Fluoreszenz-Mikroskopie für neuartige Biofilm Experimente mit verschiedenen Scheren Umgebungen gekoppelt sind. Diese Methode ermöglicht für den Ausbau der Experimente mit anderen Mikroorganismen neben Bakterien, Pilzen und Algen, die Medizin- und Umwelttechnik Anwendungen41,42,43haben. Die detaillierte Vorgehensweise wird beschrieben, wie Kultur PA01-EGFP, impfen eine 48-Well-Platte und mikrofluidischen Gerät und Software einrichten, richten Sie die Fluoreszenz-Mikroskop und demonstrieren die Softwareanalyse, um zu erhalten die Biofilm-Abdeckung, Wachstumsrate, und morphologische Eigenschaften wie Rauheit der Oberfläche.

<table><tbody><tr><td>Ammoniumchlorid, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9208-500G</td><td>Teil der minimalen Medienzusammensetzung</td></tr><tr><td>BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>910-0047</td><td></td></tr><tr><td>BioFlux 1000Z Mikrofluidisches Bildgebungssystem</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>BF 1000Z</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloriddihydrid, ACD-Qualität</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>Teil der minimalen Medienzusammensetzung</td></tr><tr><td>Dextrose, wasserfrei, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9230-500G</td><td>Teil der minimalen Medienzusammensetzung</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat ACS Grade</td><td>VWR</td><td>EM-MX0070-1</td><td>Teil der minimalen Medienzusammensetzung</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat Monobasis, ACS Grade</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td>Teil der minimalen Medienzusammensetzung</td></tr><tr><td>Pseudomonas Aeurginosa GFP</td><td>ATCC</td><td>15692GFP</td><td>Für diese Studie wurde der Bakterienstamm PA01 von Pseudomonas aeurinosa mit GFP-Modifikation verwendet.</td></tr><tr><td>Natriumchlorid, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9286-500G</td><td>Teil der minimalen Medienzusammensetzung</td></tr><tr><td>Natriumphosphat, einbasisch, wasserfrei, Reagenzqualität</td><td>VWR</td><td>97061-942</td><td>Teil der minimalen Medienzusammensetzung</td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa mit einem automatisierten höheren durchsatz mikrofluidischen system zelle analyse der schubspannung weiterleben

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Ein höheren Durchsatz mikrofluidischen in-vitro- Bioreaktor gepaart mit Fluoreszenz-Mikroskopie wurde zur bakteriellen Biofilm Wachstum und Morphologie, einschließlich Pseudomonas Aeruginosa (p. Aeruginosa). Hier werden wir beschreiben, wie das System verwendet werden kann, zu studieren, die Wachstum-Kinetik und die morphologischen Eigenschaften wie die Oberflächenrauhigkeit und strukturelle Entropie von p. Aeruginosa Belastungen PA01, die ein verbesserte grünes fluoreszierendes Protein (PA01-EGFP ausdrückt ). Ein detailliertes Protokoll wird beschrieben, wie Sie wachsen und Samen PA01-EGFP Kulturen, wie das Mikroskop und Autorun, und die Durchführung der Bildanalyse, Wachstumsrate und morphologischen Eigenschaften, die mit einer Vielzahl von Scherkräften, die durch gesteuert werden die mikrofluidische Gerät. Dieser Artikel bietet eine detaillierte Beschreibung einer Technik, die Studie von PA01-EGFP Biofilmen zu verbessern, die schließlich gegen andere Stämme von Bakterien, Pilzen oder Algen Biofilme mit dem mikrofluidischen Plattform angewendet werden können.

Abbildung 4 eine zeigt die prozentuale thresholded Bereich im Laufe der Zeit aus einer 24 h laufen auf Scherung Ströme von 0,2, 0,5 und 1,0 dyn/cm2. Der Biofilm Abdeckung oder Prozent Schwellenfläche (C [%]) wurde für alle drei scher Einstellungen unterschiedlich. Die Biofilm-Berichterstattung war der schnellste auf 1,0 dyn/cm2 Scherung, wo erhöht die Schwellenbereich von 2-5 % bis 100 % nach 200 min des Wachstums und eine stationäre Phase nach 400 min erreicht. Bei 0,5 dyn/cm2die Biofilm-Berichterstattung wurde verzögert und fing an bei 400 min erreichen 100 % Abdeckung nach 800 min zu erhöhen. Die niedrigsten Scherkräfte bei 0,2 dyn/cm2 zeigte deutlich die langsamsten Anstieg der Biofilm Abdeckung, wo Prozent Abdeckung begann bei 500 min erhöhen aber nie außerhalb des Raumes 65 % Schwelle erreicht. Diese Ergebnisse zeigten Scherung im Biofilm Flächendeckung direkten Einfluss hatte. Die höhere Scherkräfte schien eine optimale Voraussetzung für Biofilm Wachstum, möglicherweise, da die Medien die Bakterien mit mehr Nährstoffen versehen, so dass der Biofilm schneller vermehren kann.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig4.jpg"> Abbildung 4: prozentuale Schwellenbereich, total Biofilm Akkumulation, Rauheit Koeffizient und strukturelle Entropie. a) Prozent Schwellenbereich (C [%]) im Laufe der Zeit mit 0,2, 0,5 und 1,0 dyn/cm2 über einen 24 h Zeitraum. Daten wurden von einem Kanal für jede Schere Bedingung ermittelt. (b) insgesamt Biofilm Akkumulation (relatives Maß) als Funktion der Zeit mit 0,2, 0,5 und 1,0 dyn/cm2 über einen 24 h Zeitraum. Die schwarzen Linien sind die kleinsten Quadrate zu einem exponentiellen Modell passt. Daten wurden von einem Kanal für jede Schere Bedingung ermittelt. (c) Rauheit Koeffizient von PA01-EGFP mit Schubspannung Werten von 0,2, 0,5 und 1,0 dyn/cm2 überwacht über 24 h. Daten wurde von einem Kanal für jede Schere Bedingung erhalten. (d) strukturelle Entropie von PA01-EGFP mit Schubspannung Werten von 0,2, 0,5 und 1,0 dyn/cm2. Daten wurden von einem Kanal für jede Schere Bedingung ermittelt (Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Abbildung 4 b steht im Einklang mit den Erkenntnissen, die in Abbildung 4einengezeigt. Die Biofilm-Ansammlung (N[Rel]) gemessen wurde basiert auf der Annahme, dass das GFP-Signal an einem Punkt in einem Bild proportional zu der live Zelldichte an dieser Position ist. Es zeigt, dass insgesamt Relativmessung Biofilm Anhäufung als Funktion der Zeit mit 0,2, 0,5 und 1,0 dyn/cm2 über einen 24 h Zeitraum erhöht und die Wachstumsrate verringerte sich von höchsten Schubspannung auf niedrigsten Schubspannung. Es gibt eine klare geben exponentielles Wachstum, aus dem ein quantitatives Wachstum berechnet werden kann.
Abbildung 4 c zeigt die Rauheit Koeffizient (Rein) auf Scherung Ströme von 0,2, 0,5 und 1,0 dyn/cm2. Rauheit der Oberfläche, durch die Rauheit Koeffizient quantifiziert misst die Abweichung im Dickenprofil des Films. Die formale Definition ist
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926eq1.jpg">
wo Tich der ich-th Dickenmessung, Tein ist die durchschnittliche Dicke, und N ist die Anzahl der Dicke Messung30. In dieser Untersuchung beschriebene Verfahren misst die Dicke mit lebenden Zellen verbunden. Eine flache Anordnung der Zellen erbringt eine Rauheit Koeffizient von Null, während erhebliche Abweichungen der Stärke aus dem Durchschnitt eine Rauheit Koeffizient größer als eins erbringt. Ähnlich wie bei der Scherung Einfluss auf das Wachstum und die prozentuale Schwellenwert Abdeckung des Films, die Biofilme ausgestellt unterschiedlichen Topographien im Laufe der Zeit. Insgesamt verringerte sich Reine im Laufe der Zeit für alle scher Bedingungen darauf hinweist, dass alle Oberflächen glatter geworden. Führten jedoch im Vergleich zu den niedrigsten Scherung von 0,2 dyn/cm, die höhere Scherkräfte Einstellungen von 0,5 und 1,0 dyn/cm2 eine glattere Oberfläche im Laufe der Zeit darauf hinweist, dass ein schneller Schubfluss an glatter und ebenmäßiger Oberfläche, und die höchsten Scherung der beigetragen 1,0 dyn/cm2 erreichen unter 0,2 Rein.
Die Glätte, Regelmäßigkeit oder Rauigkeit der Oberfläche kann auch in strukturellen Entropie (TE) ausgedrückt werden. TE ist eine Eigenschaft, die in Bild-Analyse verwendet, um den Grad an Zufälligkeit in ein zweidimensionales Bild messen. Die Berechnung basiert auf der grauen Level Co-Occurrence Matrix festgelegten Haralick Et Al., die schaut ob Pixelwerte an einem Standort mit Pixelwerte an einem anderen Standort44korreliert sind. Ein hohes Maß an Korrelation führt zu niedriger Entropie. Abbildung 4 d zeigt die TE bei Scherung Ströme von 0,2, 0,5 und 1,0 dyn/cm2. TE erhöht im Laufe der Zeit für alle scher Bedingungen aber die höchste Schubspannung mit 1,0 dyn/cm erreicht die maximale TE (1.0) früher als die niedrigeren Schubspannungen bei 900 min. Die niedrigsten Scherung von 0,2 dyn/cm2 hatte die niedrigsten TE (0,8) erreicht sein Maximum nach 1.000 min. Die mittlere Schubspannung von 0,5 dyn/cm2 erreichte jedoch viel später als die hohe oder niedrige Schubspannung Bedingungen seine maximale TE (1.2).
Die Rauheit Koeffizient und TE messen verschiedene Funktionen. Während eine Flachfolie eine geringe Rauheit Koeffizient und niedriger Entropie hätten, ein Film mit deutlichen Unterschieden in der Dicke hätte eine hohe Rauheit Koeffizient aber könnte noch niedriger Entropie sein, wenn die Variation sinusförmige als zufällige ist. In diesem Fall verringert Reine erhöhte Schubspannung und Zeit während der TE-Trends direkt zugeordnet werden können, um Stress angewendet zur Biofilmbildung im Laufe der Zeit zu scheren.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS1.jpg"> Abbildung S1 : Von der Software Windows Bilderfassung. Software mit Multi Dimensional Erwerb Menü Fenster (oben). Steuermodul für ein AutoRun (unten) festgelegt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS2.jpg"> Abbildung S2 Bilderfassung der Software für die Überprüfung der Daten. Anwendungsfenster nach Auswahl des Datensatzes von Interesse mit dem Review Multi-dimensionalen Daten -Tool aus dem Analyse-Tools -Menü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier beschreiben wir die Verwendung eines höheren Durchsatz mikrofluidischen Bioreaktors gepaart mit einem fluoreszierenden Mikroskop für die Analyse der Schubspannung Auswirkungen auf Pseudomonas Aeruginosa Biofilms grün fluoreszierende Proteine, einschließlich Instrument zum Ausdruck zu bringen eingerichtet, die Bestimmung der Biofilm Abdeckung, Wachstumsrate und morphologischen Eigenschaften.

Pseudomonas Aeruginosa mit einem automatisierten höheren Durchsatz mikrofluidischen System Zelle Analyse der Schubspannung weiterleben

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, wie biofilmentwicklung, wie zum Beispiel, wie man wichtige Umweltbedingungen identifiziert, die das Wachstum von Biofilmen und Verhaltensmerkmale während der Entwicklung beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die mehrkanaligen, mikrofluidischen Platten eine schnelle Erfassung statistisch signifikanter Ergebnisse ermöglichen. Obwohl diese Methode Einen Einblick in die Biofilmstruktur geben kann, kann sie auch auf die Untersuchung von Antibiotika-Behandlungen und Bio-Remediation angewendet werden.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Kämpfen, weil sorgfältige Aufmerksamkeit auf die Details des Protokolls und akribische Fähigkeiten erforderlich sind. Um einen Fehler bei der Verbindung des Instruments mit der Software zu vermeiden, schalten Sie zuerst den PC-Arbeitsplatz ein, gefolgt vom Fluoreszenzmodul. Stellen Sie sicher, dass der Fluoreszenz-Verschluss eingeschaltet ist, und schalten Sie die Hardware-Controller ein.Schalten Sie als Nächstes den Imaging-Systemcontroller und die CCD-Kamera ein. Schalten Sie dann die Bildverarbeitungsstation ein. Wenn das gesamte Gerät fertig ist, starten Sie die Steuerungsanwendung und geben Sie das Kennzeichen ein, das sich auf dem Etikett auf der Seite der Platte befindet.Für die Grundierung entfernen Sie zunächst die 48 gut mikrofluidische Platte aus der Verpackung, ohne die Glasoberfläche an der Unterseite der Platte zu berühren, und reinigen Sie den Glasschlitten am Plattenboden mit einem Linsengewebe. Um die mikrofluidischen Kanäle zu grundieren, Pipette 200 Mikroliter von 37 Grad Celsius minimalen Medium in den Ausgang gut, mit Vorsicht, Blasen zu vermeiden. Legen Sie die Platte dann auf die Plattenbühne.Wischen Sie die Schnittstelle mit Ethanol ab und versiegeln Sie sie auf der Plattenbühne, sobald das Ethanol getrocknet ist. Stellen Sie im manuellen Modus am Steuermodul die Flüssigkeit als Luria-Bertani-Brühe auf 37 Grad Celsius und max. schiere als fünf Dym pro Quadratzentimeter ein. Klicken Sie auf die Ausgangsbohrungen, um den Fluss vom Ausgang zum Eingangsbrunnen zu aktivieren, um die Kanäle zu grundieren.Nach fünf Minuten den Fluss anhalten, um sich auf die Aussaat vorzubereiten, und entfernen Sie die Platte vorsichtig von der Bühne. Dann, aspirieren Sie ein beliebiges Restmedium aus dem Ausgang gut, ohne ein Medium aus dem inneren Kreis zu entfernen, das zu den mikrofluidischen Kanälen führt. Um die experimentellen Kanäle auszusäen, fügen Sie 300 Mikroliter minimalen Mediums in den Inputbrunnen, gefolgt von der Zugabe von 300 Mikrolitern Bakterienkultur, in den Output gut.Bringen Sie die Platte auf die Bildaufnahmestufe zurück, um sicherzustellen, dass die Schnittstelle mit Ethanol abwischt, bevor Sie sie auf die Platte legen, und verwenden Sie den Live-Kamera-Feed, um sich auf einen einzigen Kanal zu konzentrieren. Während der visuellen Überwachung des Live-Feeds, nehmen Sie den Fluss bei 1 bis 2 Dym pro Quadratzentimeter für etwa 2 bis 4 Sekunden, Um die Zellen in den experimentellen Kanal zu ermöglichen, aber nicht die Serpentinkanäle, und lassen Sie die Platte auf der temperaturgesteuerten Stufe für eine Stunde, damit die Zellen anhaften. Am Ende der Befestigungszeit die Platte vorsichtig von der Bühne entfernen und die Bakterien aus dem Ausgang gut absaugen, ohne den Kanal zu stören.Verwenden Sie dann eine neue Pipettenspitze, um das Medium aus den Eingangsbrunnen zu entfernen. Öffnen Sie in der Software die mehrdimensionale Erfassung, um die Bildaufnahme des Mikroskops zu steuern, und wählen Sie Zeitraffer, mehrere Stufenpositionen und mehrere Wellenlängen aus. Erstellen Sie auf der Registerkarte Speichern einen einfachen Basisnamen, der sicherstellt, dass der Basisname für Incroments, falls eine Datei vorhanden ist, aktiviert ist.Fügen Sie alle wesentlichen Details des Experiments in die Beschreibung ein. Klicken Sie auf Verzeichnis auswählen, um den Ordner auszuwählen, in dem alle Dateien gespeichert werden. Verwenden Sie den Live-Kamera-Feed und das 10-fache Ziel, um die Bühnenpositionen einzustellen, wobei sie sich auf die Mitte des Kanals konzentrieren, der sich oberhalb oder unterhalb der auf der Platte eingravierten Kanalnummern befindet.Wechseln Sie zum 20-fachen Objektiv, und suchen Sie den optimalen Anzeigebereich und die Fokusebene innerhalb des Kanals. Fügen Sie dann die Bühnenposition mit den neuen Einstellungen zur Liste hinzu. Legen Sie im Wellenlängenmenü die Anzahl der Wellenlängen auf 3 fest, und legen Sie die erste Wellenlänge auf FITC 100%kamera, mit einer Belichtungszeit von zehn Millisekunden, die zweite Wellenlänge zu hellfeld 50%Kamera 50% sichtbar, mit einer minimalen Belichtungszeit von 3 Millisekunden und die dritte Wellenlänge zu allen geschlossen, so dass kein Licht auf dem letzten Kanal zwischen den Erfassungszeiten bleibt.Öffnen Sie im Menü AutoRun bearbeiten die Registerkarte Protokolleinrichtung, und legen Sie ein neues Protokoll mit einer Dauer von 24 Stunden fest, wobei der Flow in Vorwärtsrichtung mit der entsprechenden experimentellen Scherrate eingestellt ist. Klicken Sie auf Hinzufügen und Speichern, um das Protokoll zu speichern und die Registerkarte Sequenzeinrichtung zu öffnen. Um eine neue Sequenz einzurichten, wählen Sie Luria-Bertani Brühe bei 37 Grad, als Standardflüssigkeit für alle Kanäle.Wählen Sie unter Schrittiteration 1 für die Kanäle 1 bis 12 das Protokoll mit der ersten experimentellen Scherrate aus und aktivieren Sie alle Kanäle. Wählen Sie für die Kanäle 13 bis 24 das Protokoll mit der zweiten experimentellen Scherrate aus und aktivieren Sie alle Kanäle. Wählen Sie dann Anwenden und Speichern unter aus, um die Sequenz zu speichern und das AutoRun-Menü zu öffnen, um die gespeicherte Sequenz auszuwählen, die für den AutoRun verwendet werden soll.Um das zeitnahe Wachstums-Biofilmexperiment einzurichten, fügen Sie bis zu 1300 Mikroliter steriles minimales Medium in den Eingangsbrunnen der mikrofluidischen Platte ein und geben sie in die Bildaufnahme zurück. Wischen Sie dann die Schnittstelle mit Ethanol ab und versiegeln Sie die Platte. Vergewissern Sie sich, dass die Protokolle und Sequenzen ordnungsgemäß eingerichtet sind.Wählen Sie Start aus, um den AutoRun zu starten, und klicken Sie sofort auf Abrufen, um die Bildsammlung des Mikroskops zu starten. Klicken Sie am Ende der ersten Bildaufnahme auf Pause, und wählen Sie den Livebildmodus in der Wellenlänge des hellfelden aus. Wählen Sie zum Anzeigen jeder Bühnenposition und zum Festlegen der neuen Einstellungen aus, um jede Bühnenposition anzuzeigen, und wählen Sie auf aktuell gesetzt aus.Klicken Sie dann auf "Fortsetzen", bevor Sie mit der nächsten geplanten Erfassung beginnen. In diesem repräsentativen zeitgefristeten Biofilmwachstumsexperiment war die Biofilmabdeckung oder die prozentuale Schwellenoberfläche für alle drei Schereinstellungen unterschiedlich, was darauf hindeutet, dass die Schere einen direkten Einfluss auf die Abdeckung der Biofilmoberfläche hatte. Die gesamte relative Messung der Biofilmakkumulation, erhöht als Funktion der Zeit, wobei die Wachstumsrate von der höchsten Scherspannung auf die niedrigste Scherspannung zurückgeht.Unter jeder Bedingung gab es auch eine klare Periode exponentiellen Wachstums, aus der eine quantitative Wachstumsrate berechnet werden konnte. Insgesamt verringerte sich der Rauheitskoeffizient im Laufe der Zeit unter allen Scherbedingungen, was darauf hindeutet, dass alle Biofilmoberflächen glatter wurden. Im Vergleich zur niedrigsten Schere führten die höheren Schereinstellungen jedoch zu einer glatteren Oberfläche im Laufe der Zeit, was darauf hindeutet, dass ein schnellerer Scherfluss zu einer glatteren und gleichmäßigeren Oberfläche beiträgt.Darüber hinaus nahm die texturale Entropie oder die Zufälligkeit in der Morphologie im Laufe der Zeit für alle Scherbedingungen zu. Beim Ausführen dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die angegebene Reihenfolge zu befolgen und sich die Zeit zu nehmen, jeden Schritt genau auszuführen. Die benötigten Fähigkeiten können ein paar Läufe dauern, um zu meistern.Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie HBLC oder GCMS durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über die Konzentrationen von Substraights, wie Glukose, zu beantworten, die verbraucht werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biofilme, um allgemeine Strömungsumgebungen in Echtzeit mit kontrollierten experimentellen Bedingungen und Hydrotherapie-Probenzuverfahren zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit BSL2-Bakterienstämmen extrem gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter Schutzausrüstungen und die Verwendung geeigneter Abfallprotokolle immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.

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