Name: Vorbereitung von Pilz und Pflanze-Materialien für strukturelle Aufklärung mittels dynamischen atomare Polarisation Festkörper-NMR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Probenpräparation für Festkörper-NMR und dynamische Kernpolarisation an Pilzen und Pflanzen. Diese Methode ermöglicht die strukturelle Aufklärung komplexer Biomaterialien in ihrer nativen Umgebung.

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Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation durch NSF OIA-1833040 unterstützt. Die nationale hohe magnetische Feld Labor (NHMFL) wird vom Nationalfonds durch DMR-1157490 und der Zustand von Florida unterstützt. Das MAS-DNP-System bei NHMFL wird teilweise von NIH S10 OD018519 und NSF-CHE-1229170 finanziert.

1. Wachstum von 13C, 15N beschriftet Aspergillus Fumigatus Flüssigmedium
<ol><li>Vorbereitung der unbeschrifteten und 13C, 15N beschriftet Wachstumsmedium Hinweis: Beide Hefe Extrakt Pepton Traubenzucker Medium (YPD) und der verbesserten minimale mittlere43 dienten für die Erhaltung der pilzartige Kultur. Alle Schritte nach dem Autoklavieren erfolgt in einer Laminar-Flow-Haube um Kontamination zu minimieren.<ol>
<li>Vorbereitung der unbeschrifteten flüssigen Medium: lösen Sie 6,5 g YPD Pulver in 100 mL destilliertem Wasser und dann Autoklaven für 25 min bei 134 ° C.</li>
		<li>Vorbereitung der unbeschrifteten festem medium<ol>
<li>1,5 g Agar und 6,5 g YPD Pulver in 100 mL destilliertem Wasser hinzufügen.</li>
			<li>Autoklaven das Medium für 25 min bei 121 ° C und dann auf ca. 50 ° c abkühlen</li>
			<li>13-15 mL des Mediums in jeder Pre-sterile Kunststoff Petrischale und bedecken Sie die Schüssel mit einem Deckel sofort.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vorbereitung von 13C, 15N beschriftet flüssigen medium Hinweis: Um die Wachstums-Lösung Isotop etikettieren, minimalen 13-haltigem Medium vorzubereiten C-Glukose und 15N-Natrium Nitrat und Spurenelement Lösung sind separat hergestellt und dann vor Gebrauch gemischt.<ol>
<li>Bereiten Sie 100 mL der Isotopen-haltigen minimaler Medium vor, wie in Tabelle 1aufgeführt. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,6 mit NaOH (1 M) oder HCl (1M)-Lösung.</li>
			<li>Autoklaven der minimalen Medium für 25 min bei 121 ° C.</li>
			<li>Bereiten Sie 100 mL (1, 000 X) Spurenelemente Lösung, lösen sich die Salze, die in Tabelle 2 im destillierten Wasser aufgeführt. Autoklaven die Lösung für 25 min bei 134 ° C. Kühlen Sie lassen ab und speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für den kurzfristigen Gebrauch zu. Der pH-Wert wird ungefähr 6.5 und kann mit dem pH-Meter geprüft werden.</li>
			<li>100 mL 13C, 15N beschriftet minimaler Medium fügen Sie 0,1 mL Spurenelemente Lösung wie vor Gebrauch in Tabelle 2 aufgeführt hinzu.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wachstum der Pilzen Materialien<ol>
<li>Eine kleine Menge von Pilzen aus dem Speicher auf eine YPD-Platte mit einer Impfkeimen Schleife in einer Laminar-Flow-Haube zu übertragen. Halten Sie die Kultur bei 30 ° C für 2 Tage im Inkubator.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Impfkeimen Schleife, um eine aktive wachsende Pilz Flanke bis 13C,15N-Kennzeichnung Lösung in einer Laminar-Flow-Haube zu übertragen. Halten Sie die Kultur bei 30 ° C für ca. 3-5 Tage bei 220 u/min in einem schütteln Inkubator.</li>
		<li>Zentrifugieren bei 4.000 X g für 20 min. Überstands entfernen und das Pellet zu sammeln.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Pinzette, um ~0.5 g gut hydratisiert Pellet zu sammeln (> 50 wt % Feuchtigkeit) für NMR-Studien. Verlust der Hydratation an jedem Punkt wird die spektrale Auflösung wesentlich verschlechtern. Hinweis: Bei Bedarf eine kleine Menge (0,1 g) hydratisiert Myzelien kann getrennt und vollständig getrocknet werden unter N2 Gasstrom in eine Kapuze oder ein Gefriertrockner zur Schätzung der Wasserhaushalt und der trockenen Massenanteil berechnen. In der Regel ein Granulat mit ~0.3 g Trockenmasse nach 3 Tagen erhalten werden. Wenn das NMR-Experiment durchgeführt werden lang ist (> 7 Tage) und/oder wenn der Zustand der Pilze werden behoben muss, der Pilze Material kann tief eingefroren werden in Flüssigkeit N2 für 10-20 min vor der Weiterverarbeitung. Wenn das Experiment wird kurz sein (3-6 Tage), das Einfrieren kann übersprungen werden, so dass die Probe frisch zu bleiben.</li>
		<li>Mischen Sie das überschüssige Material mit 20 % (V/V) Glycerin in ein Zentrifugenröhrchen und halten Sie es in einer Gefriertruhe-80 ᵒC für langfristige Lagerung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung des A. Fumigatus für Solid-State-NMR und DNP-Studien
<ol><li>Vorbereitung von A. Fumigatus für Festkörper-NMR-Experimente<ol>
<li>Dialyse 13C, 15N-Label Pilz Probe (Schritt 1.2.4.) gegen 1 L 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) bei 4 ° C mit einem Dialyse-Tasche mit einem 3,5 kDa Molekulargewicht cutoff, um kleine Moleküle aus das Wachstumsmedium für einen Gesamtzeitraum von 3 Tagen zu entfernen. Ändern Sie den Puffer zweimal täglich. Hinweis: Alternativ die Probe kann gewaschen werden für 6-bis 10-Mal mit entionisiertem Wasser um verbleibende kleine Moleküle zu entfernen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Probe in eine 15 mL-Tube und Zentrifuge für 5 min (10.000 X g) mit einer Benchtop-Zentrifuge. Den Überstand zu entfernen und die verbleibenden Pilzen Materialien zu sammeln.</li>
		<li>70-80 mg packen die einheitlich 13C beschriftet und gut hydratisiert Probe-Paste in ein 4-mm-ZrO2 Rotor oder 30-50 mg bis 3,2 mm Rotoren für NMR-Experimente. Wiederholt drücken Sie sanft mit einem Metallstab Probe und absorbieren Sie das überschüssige Wasser mit Papier.</li>
		<li>Dicht verschließen Sie des Rotors und legen Sie die Probe in das Spektrometer für Festkörper-NMR-Charakterisierung. Hinweis: Die brandneue Rotoren werden vorgeschlagen, um zu minimieren die Möglichkeit der Rotor Absturz und probieren Sie Ölkatastrophe in der NMR-Spektrometer. Bei Bedarf kann eine Einweg-Kel-F Wendeplatte mit Abdichtung Schrauben eingesetzt werden, dienen als sekundäre Container innerhalb des Rotors.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von A. Fumigatus Proben für DNP Experimente<ol>
<li>13C,15N-Label Pilz Proben 100 µL DNP Lösungsmittel29,44 (auch bekannt als die DNP-Matrix) in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch vorbereiten. Diese DNP-Matrix enthält eine Mischung aus d8-Glycerin/D2O/H2O (60/30/10 Vol%). Hinweis: Wenn unbeschriftete Proben untersucht werden sollen, dann bereiten Sie die DNP-Matrix mit 13C-abgereicherte d8-Glycerin (12C399,95 %; D8, 98 %) und D2O und H2O 13C zu vermeiden signal Beitrag von Lösungsmittel.</li>
		<li>0,7 mg AMUPol45 in 100 µL DNP Lösungsmittel zu Formular 10 mM radikale Stammlösung auflösen. Vortex für 2-3 min um sicherzustellen, dass radikale in der Lösung vollständig aufgelöst sind.</li>
		<li>Genießen Sie 10 mg der dialysierten 13C, 15N-Label Pilz Materialien, wie in vorherigen Schritte (2.1.1 und 2.1.2) in 50 µL AMUPol Lösung beschrieben und Schleifen Sie leicht die Mischung mit einem Stößel und Mörser, um Eindringen von den radikalen in sicherzustellen die porösen Zellwände. Hinweis: Um die Verlustrate der Hydratation zu verringern, kann das Schleifen auch in einem Microcentrifuge Schlauch mit einer Micropestle erfolgen.</li>
		<li>Hinzu kommt ein weiteres 30 µL der radikalen Lösung gemahlenen Pellets um weitere Hydrat Pilz Probe.</li>
		<li>Packen Sie das Pellet in ein 3,2 mm Saphir Rotor, zusammendrücken Sie leicht und entfernen Sie überschüssige DNP Lösungsmittel zu. Fügen Sie einen 3,2 mm Silikon-Stecker, um den Verlust von Feuchtigkeit zu verhindern. 5-30 mg der Probe kann in der Regel auf den Rotor verpackt werden. Die genaue Menge muss durch die Bestimmung der Empfindlichkeit der NMR-Experimente durchgeführt werden bestimmt werden.</li>
		<li>Einfügen Sie und drehen Sie sich die Probe in einem DNP-Spektrometer, Messen Sie ein DNP-erweiterte Spektrum unter Mikrowellenstrahlung und vergleichen Sie es mit der Mikrowelle-off-Spektrum. Dies führt zu einer Verstärkung Faktor εein-/ausschalten, 20-40 für diese komplexe Materialien sein sollten. Führen Sie die entworfene Experimente zur Zellwandstruktur zu bestimmen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung der pflanzlichen Biomasse für NMR und DNP-Studien
<ol><li>Vorbereitung von Pflanzenmaterial für Festkörper-NMR<ol>
<li>Produzieren Sie 13C-markierten Pflanzen im Haus mit 13CO2 Lieferungen in einer Kammer oder 13C-Glukose Wachstumsmedium wie zuvor beschrieben46,47 einheitlich zu oder kaufen Sie direkt beschriftete Materialien aus Isotopen-Kennzeichnung Unternehmen. Hinweis: 13C-Glukose nur in dunklen Wachstum lässt sich um die Einführung des 12C zu vermeiden durch Photosynthese.</li>
		<li>Schneiden Sie die einheitlich beschriftet 13C Pflanzenmaterial in kleine Stücke (in der Regel 1-2 mm Dimension) mit einer Rasierklinge Labor. Hinweis: Je nach Zweck, die extrahierten Zellwände werden manchmal verwendet für strukturelle Charakterisierung und detaillierte Protokolle sind in früheren Studien21,46berichtet.</li>
		<li>Wenn die Probe vorher getrocknet wurde, fügen 100 µL Wasser auf 30 mg von Pflanzenmaterial in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, Wirbel, equilibrate für 1 Tag bei Raumtemperatur. 4.000 x g für 10 min Zentrifugieren Sie und entfernen Sie das überschüssige Wasser mit einer Pipette.</li>
		<li>Wenn die Probe an jedem beliebigen Punkt nie getrocknet war, direkt anhand des Beispiels ohne weitere Behandlung.</li>
		<li>Packen Sie die daraus resultierenden Pflanzenmaterial in 3,2 mm oder 4 mm ZrO2 Rotoren für Festkörper-NMR-Experimente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von Pflanzenmaterial für DNP Studien<ol>
<li>Bereiten Sie 60 µL Stammlösung von 10 mM AMUPol radikal wie beschriebenen Schritte 2.2.1 und 2.2.2.</li>
		<li>Schneiden Sie die einheitlich 13C beschriftet Pflanzenmaterial in kleine Stücke (1-2 mm Dimension) untersucht werden mit einer Rasierklinge Labor und wiegen 20 mg von pflanzlichen Stoffen.</li>
		<li>Hand-Grind die Werk-Stücke in kleine Partikel (~ 1-2 mm in der Größe) mit einem Mörser und Stößel. Die endgültige Pulver haben ein homogenes Erscheinungsbild.</li>
		<li>Fügen Sie im vorherigen Schritt (2.2.2), das Pflanzenmaterial 40 µL der Stammlösung DNP vorbereitet und Schleifen Sie leicht für 5 min um homogene Vermischung mit der radikalen zu gewährleisten.</li>
		<li>Fügen Sie ein weiteres 20 µL der Stammlösung weiter das Pflanzenmaterial nach dem Schleifen Hydrat.</li>
		<li>Packen Sie die ausgewogenen Anlage Probe in ein 3,2 mm Saphir Rotor für DNP Experimente. Legen Sie einen Silikon-Stecker, um den Verlust von Feuchtigkeit zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. standard Festkörper-NMR-Experimente zur ersten Charakterisierung von Kohlenhydrat-reiche Biomaterialien
Hinweis: In diesem Abschnitt ist eine kurze Übersicht über die NMR-Experimente bereitgestellt. Strukturelle Aufklärung erfordert jedoch in der Regel umfangreiche Expertise. Kooperationen mit NMR Partikelproben wird daher empfohlen.
<ol><li>Maßnahme 1D 13C Cross Polarisation (CP), 13C direkten Polarisation (DP) mit 2-s und 35-s zu recyceln, Verzögerungen und 1H -13C UNFÄHIGEN48,49 Spektren, ein allgemeines Verständnis von der dynamischen zu erhalten Verteilung der Zellbestandteile (Abbildung 1a). Die Zellwände sind in der Regel relativ starren Teil und dominante Signale im CP Spektrum aufweisen.</li>
	<li>Eine Reihe von standard 2D 13C -13C Korrelation Experimenten für Resonanz Zuordnungen von 13C Signale zu messen. Beginnen Sie mit neu ausgerichtete unzureichend50,51 , Kohlenstoff-Verbindungen zu erhalten, die von einer Reihe von Experimenten mit Platz wie 1,5 ms RFDR52 (Abbildung 1 b) und 50-ms-Kabel unterstützt werden müssen/DARR53 Experimente. Hinweis: Wenn es von Interesse, eine Probe reich an eine bestimmte Komponente, z. B. zu finden ist die primäre oder sekundäre Zellwände, dann mehrere Segmente oder mehrere Pflanzen müssen separat gemessen werden, um die Probe mit der optimalen Zusammensetzung zu finden.</li>
	<li>Führen Sie 2D 15N -13C Korrelation Experimente, die gemessen werden kann, um die Resonanz-Zuordnungen von Eiweißen und Kohlenhydraten Nitrogenated zu erleichtern. Hinweis: Die Resonanz-Zuordnung ist in der Regel zeitaufwendig. Eine Methode wird derzeit weiterentwickelt, um die Resonanz Zuordnung der Kohlenhydrat-Signale für diese Wissenschaftler ohne Vorkenntnisse zu erleichtern.</li>
	<li>Messen Sie spezialisiertere Experimente durchführen, um festzustellen, die räumliche Nähe (Abbildung 1 c, d), Hydratation und Mobilitäten von komplexen Biomolekülen zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur der Kohlenhydrat-reiche Materialien als systematisch beschriebenen22,29.</li>
</ol>

Wir haben nichts zu veröffentlichen.

Im Vergleich mit den biochemischen Methoden, hat Festkörper-NMR Vorteile als eine nicht-destruktive und hochauflösende Technik. NMR ist auch im kompositorischen Analyse quantitativer und im Gegensatz zu den meisten anderen Analysemethoden, tut nicht haben die Unsicherheiten eingeführt durch die begrenzte Löslichkeit von Biopolymeren. Errichtung des derzeitigen Protokolls ermöglicht zukünftige Studien auf kohlenhydratreiche Biomaterialien und funktionalisierten Polymere. Allerdings sollte angemerkt werden, dass die Resona...

Kohlenhydrate spielen eine zentrale Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen wie Energiespeicher, strukturelle Gebäude und zelluläre Anerkennung und Haftung. Sie sind in der Zellwand, bereichert die ist ein elementarer Bestandteil in Pflanzen, Pilze, Algen und Bakterien1,2,3. Die Zellwand dient als zentrale Quelle für die Produktion von Biokraftstoffen und Biomaterialien sowie ein viel versprechendes Ziel für antimikrobielle Therapien4,5,6,7,8 , 9.
Das gegenwärtige Verständnis dieser komplexen Materialien wurde im Wesentlichen durch jahrzehntelange Bemühungen vorgebracht worden, die die strukturelle Charakterisierung mit vier wichtigen biochemischen und genetischen Methoden gewidmet waren. Die erste wichtige Methode stützt sich auf sequenzielle Behandlungen mit ätzenden Chemikalien oder Enzyme um zu brechen die Zellwände in verschiedenen Portionen, gefolgt von kompositorischen und Kopplungsanalyse von Zucker in jedem Bruchteil10. Diese Methode gibt Aufschluss über die Domäne Verteilung von Polymeren kann, die Auslegung jedoch aufgrund der chemischen und physikalischen Eigenschaften von Biomolekülen irreführend. Zum Beispiel ist es schwierig, festzustellen, ob der Alkali-extrahierbare Anteil aus einer einzelnen Domäne weniger strukturierten Moleküle oder räumlich voneinander getrennten Moleküle mit vergleichbaren Löslichkeit stammt. Zweitens die entnommenen Teile oder ganze Zellwände auch gemessen werden mit NMR-Lösung um zu bestimmen, die kovalenten Verbindungen, auch bezeichnet als Vernetzung zwischen verschiedenen Molekülen11,12,13, 14,15. Auf diese Weise könnte die detaillierte Struktur der kovalente Anker sondiert werden, aber Einschränkungen möglicherweise vorhanden, durch die geringe Löslichkeit von Polysacchariden, die relativ kleine Anzahl von Standorten Vernetzung und die Unkenntnis der nicht-kovalente Effekte, die stabilisiert Polysaccharid-Verpackung, einschließlich Wasserstoff-Bindung, Van-Der-Waals-Kraft, elektrostatische Wechselwirkung und Polymer Verschränkung. Drittens wurde die Bindungsaffinität entschlossen in Vitro mit isolierten Polysaccharide16,17,18,19, aber die Reinigung, das Verfahren erheblich verändern kann die Struktur und die Eigenschaften dieser Biomoleküle. Diese Methode wird auch nicht die anspruchsvolle Anlagerung und Montage von Makromolekülen nach Biosynthese zu replizieren. Schließlich den Phänotyp, Zellmorphologie und mechanischen Eigenschaften von genetische Mutanten mit attenuierten Produktion bestimmten Zellwand-Komponente vergossen Lichter auf die strukturellen Funktionen von Polysacchariden, aber mehr molekularen Nachweis ist erforderlich, um diese zu überbrücken makroskopische Beobachtungen mit der technischen Funktion des Proteins Maschinen20.
Jüngste Fortschritte in der Entwicklung und Anwendung der multidimensionalen Festkörper-NMR-Spektroskopie haben eine einzigartige Gelegenheit für diese strukturellen Rätsel eingeführt. 2D/3D Festkörper-NMR-Experimente ermöglichen hochauflösenden Untersuchung der Zusammensetzung und Architektur der Kohlenhydrat-reiche Materialien im nativen Zustand ohne große Störung. Strukturelle Studien wurden erfolgreich durchgeführt, auf primären und sekundären Zellwände von Pflanzen, die katalytisch behandelten Biomasse bakterielle Biofilm, das Pigment Geister in Pilzen und vor kurzem von den Autoren, die intakte Zellwände in ein pathogener Pilz Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. die Entwicklung der dynamischen atomare Polarisation (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 erleichtert wesentlich NMR strukturelle Aufklärung, wie die Verbesserung der Empfindlichkeit von DNP deutlich verkürzt sich die experimentelle Zeit auf diese komplexen Biomaterialien. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Verfahren für die Isotopen-Kennzeichnung des Pilzes A. Fumigatus und Vorbereitung Pilz und Pflanzenproben für Festkörper-NMR und DNP Charakterisierung. Ähnliche Kennzeichnung Verfahren auf andere Pilze mit veränderten Mediums anwendbar sein sollte, und die Probenaufbereitungsverfahren sollte generell für andere Kohlenhydrat-reiche Biomaterialien.

<table><tbody><tr><td>Ammonium-Molybdat-Tetrahydrat</td><td>Acros Organics</td><td>12054-85-2</td><td></td></tr><tr><td>AMUPol</td><td>Cortecnet</td><td>C010P002</td><td></td></tr><tr><td>Analytische Waage</td><td>Ohaus</td><td>B730439218</td><td>Modell PA84C</td></tr><tr><td>Bioclave 16 L</td><td>VWR</td><td>470230-598</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank</td><td>Labconco Corporation</td><td>302319100</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>VWR</td><td>BDH9222</td><td>um 15-30 Uhr lagern; C</td></tr><tr><td>Kobalt(II)-chlorid-Hexahydrat</td><td>Honeywell|Fluka</td><td>60820</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat Pentathydrat</td><td>BDH</td><td>BDH9312</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>Corning LSE Schüttelinkumeter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7202152</td><td></td></tr><tr><td>D2</td><td>O Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td>99,9 Atom % D</td></tr><tr><td>d6-DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>99,9 Atom % D</td></tr><tr><td>d8-Glycerin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447498</td><td>&ge; 99 Atom % D</td></tr><tr><td>Dialyseschlauch 3,2 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2272</td><td>132724</td></tr><tr><td>Dikaliumphosphat</td><td>VWR</td><td>BDH9266</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>&ge&ge; 99.5 %</td></tr><tr><td>Heraus Megafuge 16R Zentrifuge</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>750004271</td><td>Maximum RZB 25.830 x g</td></tr><tr><td>HR-MAS Einweg Einsatzkit</td><td>Bruker</td><td>B4493</td><td>Kel-F</td></tr><tr><td>Eisen(II)-sulfat Heptahydrat</td><td>Alfa Aesar</td><td>14498</td><td>&ge; 99+ %</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat Heptahydrat</td><td>VWR</td><td>10034998</td><td>bei 18-26 &° lagern; C</td></tr><tr><td>Mangan(II)-chlorid-Tetrahydrat</td><td>Alfa Aesar</td><td>11563</td><td>&ge; 99 %</td></tr><tr><td>Monokaliumphosphat</td><td>VWR</td><td>470302-254</td><td>&ge; 99 %</td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Mettler Toledo</td><td>B706689216</td><td></td></tr><tr><td>Tetranatriumethylendiamintetraacetat</td><td>Acros Organics</td><td>13235-36-9</td><td>&ge; 99,5 %</td></tr><tr><td>Zinksulfat Heptahydrat</td><td>Alfa Aesar</td><td>33399</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>12C3, d8-Glycerin</td><td>Cambridge Isotope Laboratory</td><td>CDLM-8660</td><td>12C3, 99,95%; D8, 98</td></tr><tr><td>%13C6-Glukose</td><td>Sigma Alrdrich</td><td>364606</td><td>&ge; 99 % (CP)</td></tr><tr><td>15N-Natriumnitrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>364606</td><td>&ge; 98 % 15N, &ge; 99 (cp)</td></tr><tr><td>3,2 mm Saphir NMR Rotor</td><td>Cortecnet</td><td>B6939</td><td></td></tr><tr><td>3,2 mm Silikon Stecker</td><td>Bruker</td><td>B7089</td><td></td></tr><tr><td>4 mm MAS Rotor Kit</td><td>Bruker</td><td>H14355</td><td>Zirkonoxid</td></tr></tbody></table>

vorbereitung von pilz und pflanze-materialien für strukturelle aufklärung mittels dynamischen atomare polarisation festkörper-nmr

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Dieses Protokoll zeigt, wie einheitlich 13C, 15N-Label Pilz Materialien können produziert und Experimente wie diese weichen Materialien für Festkörper-NMR und erhöhter Empfindlichkeit DNP vorgegangen werden sollte. Die Probenverarbeitung Verfahren der pflanzlichen Biomasse wird auch genau beschrieben. Diese Methode ermöglicht die Messung von einer Reihe von 1D und 2D 13C -13C /15N Korrelationen Spektren, die hochauflösende strukturelle Aufklärung von komplexen Biomaterialien in ihrem nativen Zustand mit minimaler Störung ermöglicht. Die Isotopen-Kennzeichnung kann durch Quantifizierung der Intensität in 1D-Spektren und die Polarisation Auftragswirkungsgrad in 2D Korrelation Spektren untersucht werden. Der Erfolg der Probenvorbereitung dynamische atomare Polarisation (DNP) kann von der Empfindlichkeit Verstärkung Faktor ausgewertet werden. Weitere Experimente untersuchen die strukturellen Aspekte der Polysaccharide und Proteine führt zu einem Modell für die dreidimensionale Architektur. Diese Methoden können geändert und angepasst, um eine Vielzahl von Kohlenhydrat-reiche Materialien, einschließlich der natürlichen Zellwände von Pflanzen, Pilzen, Algen und Bakterien, sowie synthetisiert oder konzipiert Kohlenhydrat-Polymere und ihre komplex miteinander zu nehmen Moleküle.

Das Isotop Kennzeichnung erheblich erhöht die Empfindlichkeit der NMR und macht es möglich für die Messung eine Reihe von 2D 13C -13C und 13C -15N Korrelation Spektren, die Zusammensetzung, die Hydratation, die Mobilität zu analysieren und Verpackung von Polymere, die integriert werden, um ein dreidimensionales Modell der Zellwand Architektur (Abbildung 1) zu konstruieren. Gelingt es die einheitliche Kennzeichnung, ...

Ein Protokoll für die Probenvorbereitung 13C,15N-Label Pilz und Pflanze für multidimensionale Festkörper-NMR-Spektroskopie und dynamische atomare Polarisation (DNP) Untersuchungen wird vorgestellt.

Vorbereitung von Pilz und Pflanze-Materialien für strukturelle Aufklärung mittels dynamischen atomare Polarisation Festkörper-NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Pilz- und Pflanzenmaterialien für Festkörper-Kernspinresonanz oder NMR und dynamische Kernpolarisation (DNP) experimentefür komplexe Biosystemcharakterisierung vorzubereiten. Diese Technik ermöglicht es uns, Biomaterialien auf einer atomaren Auflösungsebene in ihrer heimischen Umgebung zu untersuchen, zum Beispiel in ganzen Zellen. Der Erwerb von hochauflösenden Strukturinformationen über Pilzmaterialien wird bei der Entwicklung von Antimykotika helfen.Die Methode bietet Einblick in Zusammensetzung und Struktur komplexer Kohlenhydrate in Pilzzellwänden und kann auf viele kohlenhydratreiche Organismen angewendet werden, darunter Pflanzen, Pilze, Algen und Bakterien. Einige Forscher können mit Pilzkontamination in ihren zellulären Kulturen zu kämpfen. Mein Rat ist, das Medium und die Ausrüstung vor dem Gebrauch gründlich zu sterilisieren, um diese Kontamination zu verhindern.Diese Demonstration wird Forschern mit wenig Erfahrung in NMR oder Zellkultur helfen, zu lernen, wie diese Techniken in Pilz- und Pflanzensystemen implementiert werden. Um unbeschriftetes flüssiges Wachstumsmedium vorzubereiten, lösen Sie 6,5 Gramm Hefeextrakt Pepton-Dextrose oder YPD-Pulver in 100 Milliliter destilliertem Wasser auf und autoklavieren Sie dann die resultierende Lösung für 25 Minuten bei 134 Grad Celsius. Um unbeschriftetes festes Wachstumsmedium vorzubereiten, fügen Sie 6,5 Gramm YPD-Agarpulver zu 100 Milliliter destilliertem Wasser hinzu und autoklavieren Sie das Medium 25 Minuten lang bei 121 Grad Celsius, bevor Sie das Medium auf etwa 50 Grad Celsius abkühlen.Dann 13 bis 15 Milliliter des geschmolzenen festgewachsenen Mediums in einzelne sterile Kunststoff-Petrischalen geben und sofort die Deckel auf das Geschirr legen. Um Kohlenstoff-13, Stickstoff-15-markiertes flüssiges Wachstumsmedium vorzubereiten, stellen Sie ein 100-Milliliter-Volumen des isotophaltigen Minimalmediums auf einen pH-Wert von 6,6 mit Säure oder Base bei Bedarf ein. Als nächstes lösen Sie die in der Tabelle aufgeführten Salze in 100 Milliliter destilliertem Wasser auf, fügen Sie dem Kohlenstoff-13, Stickstoff-15-markierten flüssigen Wachstumsmedium, und autoklavieren Sie die resultierende Lösung für 25 Minuten bei 121 Grad Celsius.Wenn die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt ist, fügen Sie 100 Mikroliter Spurenelemente Lösung auf das gesamte Volumen von Kohlenstoff-13, Stickstoff-15-markierte mandmittel. Um die Pilzmaterialien anzubauen, verwenden Sie eine Impfschleife, um eine kleine Menge Pilze aus der Lagerung auf eine YPD-Platte zu übertragen, und kultivieren Sie den Pilz für zwei Tage in einem 30-Grad-Celsius-Inkubator. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine neue Impfschleife, um eine aktive wachsende Pilzkante auf das Kohlenstoff-13-, Stickstoff-15-markierte flüssige Wachstumsmedium zu übertragen, und platzieren Sie die Kultur drei bis fünf Tage lang bei 30 Grad Celsius und 220 Umdrehungen pro Minute in einem Schüttelinkubator.Wenn große Mengen des Pilzes den Kolbenboden bedecken und in der Flüssigkeit schwimmen, die Pilze durch Zentrifugation sammeln und den Überstand entsorgen. Hydratisieren Sie das Pellet mit einer geeigneten Lösung, und verwenden Sie Zangen, um etwa 0,5 Gramm des gut hydratisierten Pellets für NMR- und DNP-Analysen zu sammeln. Dann mischen Sie das restliche Material mit einer 20%glyzerinLösung in einem konischen Rohr, und legen Sie die Pilzprobe bei minus 80 Grad Celsius für die langfristige Lagerung.Um den A.fumigatus für die Festkörper-NMR-Analyse vorzubereiten, verwenden Sie zunächst einen Dialysebeutel mit einem 3,5-Kilodalton-Molekulargewichts-Cutoff, um die 0,5-Gramm-Kohlenstoff-13, Stickstoff-15-beschriftete Pilzprobe gegen einen Liter 10-Millimolar-Phosphatpuffer bei vier Grad Celsius drei Tage lang zu dialysieren, um kleine Moleküle aus dem Wachstumsmedium zu entfernen. Am Ende der Dialyse die Probe zur Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Rohr geben und 70 bis 80 Milligramm der gleichmäßig kohlenstoff-13-markierten und gut hydratisierten Probenpaste in einen Vier-Millimeter-Zirkondioxidrotor packen. Verwenden Sie eine Metallstange, um die Probe sanft und wiederholt zu drücken, indem Sie Papier verwenden, um das überschüssige Wasser zu absorbieren.Dann den Rotor fest verschließen und die Probe in das Spektrometer für die Charakterisierung des Festkörper-NMR einfügen. Um den A.fumigatus für die DNP-Analyse vorzubereiten, fügen Sie 100 Mikroliter DNP-Matrix in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr pro Kohlenstoff-13, Kohlenstoff-15-beschriftete Pilzprobe, und lösen Sie 0,7 Milligramm Polarisationsmittel in jedes Rohr, um eine 10-Millimolar-Radikal-Stammlösung zu bilden. Nach zwei bis drei Minuten Wirbel, um sicherzustellen, dass die Radikale vollständig in der Lösung gelöst werden, tränken Sie 10 Milligramm dialysierte kohlenstoff-13, Stickstoff-15-markierte Pilzprobe in 50 Mikroliter der Polarisationsmittellösung, und verwenden Sie einen Stößel und einen Mörtel, um das Gemisch mild zu mahlen, um das Eindringen der Radikale in die porösen Zellwände zu gewährleisten.Fügen Sie dem gemahlenen Pellet weitere 30 Mikroliter der Radikallösung hinzu, um die Pilzprobe weiter zu hydratisieren, und packen Sie das Pellet in einen 3,2-Millimeter-Saphirrotor. Drücken Sie leicht und entfernen Sie das überschüssige DNP-Lösungsmittel, wie gezeigt, und fügen Sie einen 3,2-Millimeter-Silikonstecker hinzu, um den Verlust der Hydratation zu verhindern. Fügen Sie dann den Rotor zu einem NMR-Spektrometer für Routineexperimente oder einem DNP-Spektrometer zur Messung des DNP-verstärkten Spektrums unter Mikrowellenbestrahlung hinzu.Um Pflanzenmaterialien für DNP-Studien vorzubereiten, schneiden Sie das gleichmäßig kohlenstoff-13-markierte Pflanzenmaterial mit einer Rasierklinge in Ein- bis Zweimillimeterstücke. Verwenden Sie einen Mörtel und Stößel, um die Stücke zu kleineren Partikeln zu mahlen, bis das endgültige Pulver ein homogenes Aussehen hat. 40 Mikroliter 10-Millimolar-Radikalstoff-Stammlösung in das Pflanzenmaterial geben und die Probe zusätzlich fünf Minuten leicht mahlen, um eine homogene Vermischung mit dem Radikal zu gewährleisten.Hydratisieren Sie die Bodenprobe mit weiteren 20 Mikrolitern radikaler Stammlösung, und verpacken Sie die ausgelagerte Pflanzenprobe in einen 3,2-Millimeter-Saphirrotor für die DNP-Analyse. Legen Sie dann einen Silikonstecker ein, um den Verlust der Hydratation zu vermeiden, und laden Sie die Probe auf das DNP-Spektralphotometer. Die Isotop-Etikettierung erhöht die NMR-Empfindlichkeit erheblich und ermöglicht die Messung einer Reihe von zweidimensionalen Kohlenstoff-13-Kohlenstoff-13- und Kohlenstoff-13-Stickstoff-15-Korrelationsspektren, um die Zusammensetzung, Hydratation, Mobilität und Verpackung der Polymere für ihre Integration für die Konstruktion eines dreidimensionalen Modells der Zellwandarchitektur zu analysieren.Wenn off-diagonale Signale im 2D-Kohlenstoff-13-Kohlenstoff-13-Spektrum schwer zu erhalten sind, könnte eine statistische Kennzeichnung stattgefunden haben. Die beiden Kohlenstoff-13-Spitzen mit 96 und 92 Teilen pro Million sind Signatur-Kohlenstoff-1-Signale von Glukose. Daher deuten ihre starken Intensitäten in den quantitativen Kohlenstoff-13-Spektren der direkten Polarisation, die mit langen Recyclingverzögerungen von 35 Sekunden gemessen werden, typischerweise auf die Dominanz kleiner Moleküle aufgrund unvollständiger Dialyse oder Waschen hin.Mit gut markierten Proben können weiträumige Korrelationen weiter vermessen werden, um die räumlichen Wahrscheinlichkeiten von Biomolekülen zu erkennen und ein Strukturmodell der intakten Zellwände zu konstruieren. Diese Technik ermöglicht die Erforschung der Strukturfunktion in vielen natürlich vorkommenden und technischen Materialien, was zukünftige Studien zu kohlenhydratreichen Biomaterialien und funktionalisierten Polymeren ermöglicht. Da einige Pilze Infektionen oder systematische Krankheiten beim Menschen verursachen können, achten Sie darauf, Pilzmaterialien in einer laminaren Strömungshaube zum Schutz und zur Minimierung der Exposition zu behandeln.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Oberirdischen Pflanzenteile werden durch die Kutikula, einem supramolekularen Biopolyester-Wachs Montage geschützt. Wir präsentieren Protokolle, um die selektive Entfernung von epi-und intracuticular Wachsen aus Tomatenfrucht Nagelhaut auf molekularer und Micro-Bereich durch Festkörper-NMR-und Rasterkraftmikroskopie, bzw. zu überwachen und die Vernetzung von technischen Kapazität kutikularen Biopolyester beurteilen.

Isolierung und biophysikalische Untersuchung der Cuticula

Die Empfindlichkeitssteigerung durch die auflösungsdynamische Kernpolarisation (DNP) ermöglicht es, Stoffwechselprozesse in Echtzeit mittels NMR und MRT zu verfolgen. Die Eigenschaften und Leistungen eines dedizierten Dissolution-DNP-Setups, das für die Untersuchung enzymatischer Reaktionen entwickelt wurde, werden diskutiert.

Die Auflösung dynamische Kernpolarisation Besetzung für Echtzeit-enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Messungen von NMR

Dieses Protokoll beschreibt die spezifischen Techniken, die für die strukturelle Charakterisierung von Glykosylsequenz(en) im reduzierenden Endbereich (RE) und Glykosylsequenz(en) im internen Bereich von Heteroxylanen verwendet werden, indem das RE vor der enzymatischen Hydrolyse (Endoxylanase) mit 2 Aminobenzamid markiert und dann die resultierenden Oligosaccharide mittels Massenspektrometrie (MS) und Kernspinresonanz (NMR)  analysiert werden.

Sequenzierung von Pflanzenwand Heteroxylane Mit Enzymatische, Chemical (Methylierungs) und Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Strukturen der supramolekularen Protein Baugruppen in atomarer Auflösung sind wegen ihre entscheidende Rolle in einer Vielzahl von biologischen Erscheinungen von hoher Relevanz. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um hochauflösende strukturelle Studien unlöslich und nichtkristalline makromolekularen Protein-Assemblys durch Magie-Winkel drehen Festkörper-Kernspinresonanz-Spektroskopie (MAS-NMR) durchführen.

Atomarer Skala strukturelle Studien der makromolekularen Versammlungen von Festkörper-NMR-Spektroskopie

Hier wird ein Protokoll für den kryogenen Transfer von gefrorenen Proben in die dynamische Kernpolarisation (DNP) Magic Angle Spinning (MAS) Kernspinresonanzsonde (NMR) vorgestellt. Das Protokoll enthält Anweisungen für die Rotorspeicherung vor dem Experiment und Anweisungen für Lebensfähigkeitsmessungen vor und nach dem Experiment.

Kryogene Probenladung in ein magisches Winkel-Spinning-Kernspinresonanzspektrometer, das die Zelllebensfähigkeit bewahrt

31 P NMR ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur strukturellen Aufklärung von Polyphenolen. Dieses schnelle, einfache, präzise, quantitative und hochreproduzierbare Analyseverfahren, das die Quantifizierung und Differenzierung der verschiedenen Arten von Hydroxy-, Phenol- und Carbongruppen in Ligninen und Tanninen ermöglicht, ist mittlerweile zu einem routinemäßigen Analysewerkzeug geworden.

Quantitative 31P NMR Analyse von Ligninen und Tanninen

Dieser Artikel stellt die Verwendung von PSYCHE und SAPPHIRE-PSYCHE bei der metabolischen Profilerstellung von Pflanzen vor und enthält detaillierte Verfahren zur Probenvorbereitung und optimalen Aufzeichnung von Pure Shift NMR-Spektren. Es werden Beispiele diskutiert, anhand derer der durch die homonukleare Entkopplung erzielte Auflösungsgewinn ein umfassenderes Verständnis des Systems ermöglicht.

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Es wird ein Protokoll für die Anwendung der NMR-Spektroskopie zur Verstärkung der paramagnetischen Relaxation vorgestellt, um schwache und transiente inter- und intramolekulare Wechselwirkungen in intrinsisch ungeordneten Proteinen zu detektieren.

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Dieses Protokoll integriert ein speziell angefertigtes Bioreaktorsystem mit hyperpolarisierter ¹³C-NMR-Spektroskopie zur Messung des Pyruvatstoffwechsels in lebenden Zellen in Echtzeit und verbessert so die Reproduzierbarkeit und kinetische Genauigkeit für Stoffwechselstudien und Wirkstoffscreening-Anwendungen.

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Herstellung und Lieferung von Protein Microcrystals in Lipidische Cubic Phase für Serial Femtosekunden Kristallographie

Erfahren Sie die Probenpräparation für Festkörper-NMR und dynamische Kernpolarisation an Pilzen und Pflanzen. Diese Methode ermöglicht die strukturelle Aufklärung komplexer Biomaterialien in ihrer nativen Umgebung.

Vorbereitung von Pilz und Pflanze-Materialien für strukturelle Aufklärung mittels dynamischen atomare Polarisation Festkörper-NMR (Video) | JoVE Journal

Vorbereitung von Pilz und Pflanze-Materialien für strukturelle Aufklärung mittels dynamischen atomare Polarisation Festkörper-NMR

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