Name: Differenzierung-Kapazität des menschlichen Aortenklappe perivaskuläre Fettgewebe Vorläuferzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Differenzierung perivaskulärer Vorläuferzellen aus menschlichem Fettgewebe für kardiovaskuläre Forschung. Diese Methode ermöglicht Studien zur Zelltherapie und Gewebe-Regeneration.

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Wir anerkennen die Unterstützung der Forschung Navigation am Maine Medical Center für die Unterstützung bei der Beschaffung von klinischen Gewebe und der Histopathologie und Histomorphometrie Kern (unterstützt von 1P20GM121301, L. Liaw PI) bei Maine Medical Center Research Institut für schneiden und färben. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH R01 HL141149 zu gewähren (L. Liaw).

Die Verwendung von menschlichen Geweben in dieser Studie wurde bewertet und genehmigt durch die institutionelle Review Board of Maine Medical Center, und alle Mitarbeiter erhalten entsprechenden Ausbildung vor Experimenten.
1. Vorbereitungen
<ol><li>Dissoziation-Puffer zu machen 50 mg Neuaufbau tierversuchsfreie Kollagenase/Dispase Mischung von ich Lösung mit 1 mL Nanopure H2O. Prepare 1 mg/mL Lösung durch Zugabe von 49 mL hohe Glukose DMEM mit 1 % w/V BSA, rekonstituierte Kollagenase / Dispase Lösung. Speichern Sie 5 mL arbeiten Aliquote bei-20 ° C und Warm auf 37 ° C mit einer Wasser-Bad-vor um zu verwenden.</li>
	<li>Antibiotische Lösung 49 mL HBSS 1 mL 100 X Antibiotikum/antimykotische Lösung (Endkonzentration ist 200 Einheiten/mL Penicillin, 200 Einheiten/mL Streptomycin und 0,5 µg/mL Fungizone) hinzu, und speichern auf dem Eis.</li>
	<li>Gelatine-Lösung (0,2 % w/V) durch Auflösen von 200 mg Gelatine aus bovine Haut in 100 mL Nanopure H2O. Autoklaven die Lösung für 20 min Vorbereitung und Lagerung bei 4 ° C.</li>
	<li>500 mL PVAT Wachstumsmedien vorbereiten: hohe Glukose DMEM/F12 mit Glutamin ergänzen, Natrium Pyruvat und Natriumbicarbonat, ergänzt mit 10 % FBS und 100 µg/mL antimikrobieller Wirkstoff (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Bereiten Sie 50 mL adipogenen Induktion Medien: 40,8 mL hohe Glukose DMEM, ergänzt mit 7,5 mL PVAT Wachstumsmedien, 500 µL 100 x Antibiotikum/antimykotische Lösung (Endkonzentration ist 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 Einheiten/mL Streptomycin und 0,25 µg/mL Fungizone), 0,5 mM IBMX (500 mM Lager in 0,1 M NaOH), 1 µM Dexamethason (1 mM Lager in Ethanol), 5 µM Rosiglitazon (5 mM lieferbar in DMSO) 33 µM Biotin (66 mM Lager in DMSO), 100 nM Insulin (200 µM bestand in 0,1 % Essigsäure) und 20 µM Pantothensäure (100 mM Lager in H2 (O).</li>
	<li>Vorbereiten der adipogenen Linie 50 mL Steuermedien Induktion: 40,8 mL hohe Glukose DMEM mit 7,5 mL PVAT Wachstumsmedien und 500 µL des Stift-Strep (100 X bestand) ergänzt.</li>
	<li>Bereiten Sie 50 mL adipogenen Wartung Medien: 41,5 mL hohe Glukose DMEM ergänzt mit 7,5 mL PVAT Wachstumsmedien aus Schritt 1.3, 500 µL Stift-Strep (100 X bestand), 1 µM Dexamethason (1 mM Lager in EtOH), 33 µM Biotin (66 mM Lager in DMSO), 100 nM Insulin (200 µM bestand in 0,1 % Ac Schulrhythmus Säure), und 20 µM Pantothensäure (100 mM Lager in H2O).</li>
	<li>Die knochenbildenden und Chondrogenic Linien 500 mL Wachstumsmedien vorbereiten: hohe Glukose αMEM ergänzt mit 10 % FBS, 1 X Glutamin ergänzen (siehe Tabelle der Materialien), und 5 mL Stift-Strep (100 X bestand).</li>
	<li>Der knochenbildenden Linie 50 mL der Induktion Medien vorbereiten: 50 mL Knochenmark MSC Wachstumsmedien mit 10 nM Dexamethason und 10 mM β-Glycerophosphat ergänzt.</li>
	<li>Der Chondrogenic-Linie 50 mL der Induktion Medien vorbereiten: 50 mL Knochenmark MSC Wachstumsmedien mit 100 nM Dexamethason, 50 µg/mL Natrium Ascorbat-2-Phosphat und 10 ng/mL TGFβ1 ergänzt. Für die knochenbildenden und Chondrogenic Bedingungen dienen der basalen Knochenmark MSC Wachstumsmedien als Medien-Induktion.</li>
</ol>2. Protokoll 1: Kultur menschlichen PVAT Zellen von den Stromazellen vaskulären Bruch
Hinweis: PVAT ist von der Website des Transplantats Anastomose auf die Aorta ascendens narkotisierten Patienten mit koronarer Bypass-Angioplastie reseziert. Aorta PVAT ist platziert in einem 15 mL konisch mit 10 mL Eis kalt hohe Glukose DMEM-F12 und an das Labor innerhalb 2 h nach Resektion von den OP-Saal übertragen. Aorta PVAT ist ausrangierte Gewebe während Bypass-Verfahren und hielt als nicht-menschlichen Themen Forschung durch interne Revisionsabteilung Maine Medical Center.
<ol><li>Dieses Protokoll ist für ein ~ 500 mg Stück menschlichen PVAT (ca. 3 x 1 x 0,5 cm3). Übertragen Sie frische menschliche PVAT von DMEM auf eine 50 mL konische Röhrchen mit 25 mL antibiotische Lösung. Mit rockigen für 20 min bei 4 ° c inkubieren Während die PVAT in antibiotische Lösung ist, Tauwetter ein Aliquot der Dissoziation Puffer bei 37 ° C.</li>
	<li>5 mL Dissoziation Puffer 50 µL 100 X Antibiotikum/antimykotische Lösung hinzu und mit einem 0,22 µm Spritze Filter zu sterilisieren. 1 auch von einer 24-Well-Platte 1 mL Gelatine-Lösung hinzufügen. Verwenden Sie in einer Laminar-Flow-Kapuze sterile Pinzetten und Scheren, um PVAT aus der antibiotischen Lösung auf eine sterile Petrischale zu übertragen. Fügen Sie 1 mL vorgewärmten Dissoziation Puffer des Gewebes und fein hacken das gesamte Gewebe in einer Aufschlämmung (kein Stück größer als ~ 2 x 2 mm-2) mit sterilen Zange und Schere Dissektion.</li>
	<li>Übertragen Sie die Gülle 1 mL auf 4 mL Dissoziation Puffer und inkubieren Sie das Rohr auf die Seite in einem vorgewärmten 37 ° C Orbitalschüttler bei 200 u/min für 1 h. Nach 1 h keine sichtbare Gewebe Stücke werden anwesend sein, und die Lösung erscheint als eine trübe Zellsuspension.</li>
	<li>Filtern Sie die Lösung durch ein 70 µm Zelle Sieb oben auf eine 50 mL konische Rohr gesetzt. Spülen Sie das Sieb mit einer zusätzlichen 10 mL antibiotische Lösung, so viele Zellen wie möglich zu erfassen. Quetschen Sie das Sieb nicht.</li>
	<li>Pellet-Zellen für 12 min bei 300 X g in einer schwingenden Eimer-Zentrifuge. Hinweis: Nach Zentrifugation wird das Rohr in einer fetthaltigen Deckschicht aus Adipozyten, eine Interphase und ein Pellet unterteilt werden. Die Kugel ist die stromale vaskulären Fraktion mit endothelial Zellen, Blutkörperchen, Immunzellen und Vorläuferzellen.</li>
	<li>Das Pellet in 10 mL HBSS und Zentrifuge für 5 min bei 300 X gaufzuwirbeln. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von 2 Wäschen in HBSS. Lösen Sie die roten Blutkörperchen nicht nach dem letzten waschen. Wiederholte Versuche mit mehreren kommerziell verfügbare Puffer und Inkubationszeiten führten zu einem deutlichen Rückgang Stammvater Zellhaftung und Lebensfähigkeit.</li>
	<li>Aspirieren Sie Gelatine aus 24-Well-Platte. Waschen Sie vorsichtig und 1 X mit HBSS, ungebundenen Gelatine zu entfernen.</li>
	<li>Aufschwemmen Stromazellen vaskulären Bruchteil Pellet mit intakten Erythrozyten in 1 mL Wachstumsmedien und Saatgut auf die Gelatine beschichtet gut. Hinzu kommt eine Endkonzentration von 25 ng/mL im Kulturmedium menschlichen FGF2 (Nukleinsäuretablette in PBS ergänzt mit 0,01 % BSA w/V). 24 h bei 37 ° C mit 5 % CO2inkubieren.</li>
	<li>Am nächsten Tag Brunnen Wachstumsmedien entfernen und waschen 5 X mit HBSS, roten Blutkörperchen und abgestorbene Zellen zu entfernen. Fügen Sie in 1 mL frisches Wachstumsmedien mit 25 ng/mL FGF2 ergänzt.</li>
	<li>Wechseln Sie das Medium alle 48 h, achten Sie darauf, mit 25 ng/mL ergänzen frische FGF2 jedes Mal.</li>
	<li>
Zellen zu 100 % Zusammenfluss erreichen in der Regel 7-10 Tage nach Explant; Durchgang Zellen dann:
	<ol>
<li>Aspirieren Wachstum Medien und waschen monomolekularen Film 2 X in 1 mL HBSS. Aspirieren Sie alle HBSS aus dem Brunnen und Tropfen Sie ein paar der Zelle Dissoziation Lösung.</li>
		<li>Tippen Sie auf und wirbeln die Platte mehrmals und Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 5 – 7 min um die Zellen zu heben. Die freistehenden Zellen ~ 1 mL frisches Kulturmedium hinzu und verteilen 500 µL, 2 Brunnen von einer 24-Well-Platte, jeweils mit 500 µL Wachstumsmedien und 25 ng FGF2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Auch menschliche PVAT gewonnenen Zellen weiter ausbauen, wie im vorherigen Schritt angegeben. Jede Passage sollte nicht größer als eine 1:2-Spaltung sein. Zellen sind 5 – 7 mal passagiert vor Zuteilung für Differenzierung Assays.</li>
</ol>3. Protokoll 2: Kultur menschlichen Knochenmark MSC Kolonien
Hinweis: Menschlichen Knochenmark MSC wie beschrieben8 isoliert und als frühe Passage Bestände in eingefroren gelagert Einfrieren Medien (70 % FBS 20 % basale DMEM und 10 % DMSO) ~ 100.000 Zellen/ml in flüssigen N2.
<ol><li>Schnell auftauen ein Fläschchen des Knochenmarks MSC von der Flüssigkeit N2 in einem 37 ° C Wasserbad und Teller zu einem Brunnen einer Kultur 6-Well Platte mit 3 mL MSC Wachstumsmedien und Inkubation über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
	<li>Am nächsten Tag, Aspirieren MSC Nährmedien und waschen Sie die Zellen 3 X in 2 mL HBSS. Bei 100 % Zusammenströmen, Aspirieren Wachstumsmedien und waschen Sie die Zellen 3 X in 2 mL HBSS. 500 µL/Well Zelle Ablösung Lösung hinzufügen und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 5 min. Tippen Sie auf die Platte, um alle Zellen sorgen verdrängt und Inhalte in einer 6-Well-Platte mit 2 mL MSC Wachstumsmedien 2 Vertiefungen gleichmäßig zu verteilen.</li>
	<li>Erweitern Sie im menschlichen Knochenmark und PVAT abgeleitet MSC parallel für ca. 5 – 7 Passagen oder bis Sie ausreichende Mengen zum Testen erreicht wurde.</li>
</ol>4. Protokoll 3: Platte und induzieren adipogenen osteogene, und Chondrogenic Linien
<ol><li>Entsprechenden Plattennummern von Knochenmark und PVAT gewonnenen Zellen pro Bohrloch einer 12-Well-Platte und angemessen repliziert für jede Versuchsbedingung. Für adipogenen und osteogene Bedingungen, ~ 200, 000 – 225.000 Zellen/Brunnen benötigt für Chondrogenic Bedingungen, 150.000 – 175.000 Zellen/Brunnen sind erforderlich. Hinweis: Wir liefen mindestens N = 3 replizieren Brunnen für Kontrolle und induzierten Bedingungen für jede experimentelle Linie für insgesamt 2 unabhängige läuft (N = total 6 Wiederholungen).</li>
	<li>Zellen aus menschlichen PVAT Stammvater Zell-Population und der menschlichen Knochenmark MSC Bevölkerung mit Zelle Ablösung Lösung und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 5 min. Pool Populationen in separaten 15 mL konische Röhrchen zu distanzieren. Drehen Sie das Fläschchen nach unten bei 500 X g für 7 min zu die Zellen zu Pellets. In 1 mL PBS Aufschwemmen Sie und verwenden Sie eine Hemocytometer, um die Anzahl von Zellen zu schätzen.</li>
	<li>Platte die Zellen im 12-wohlen Teller wie in Schritt 4.1 angegeben. Geben Sie separate Gerichte induzierte und nicht-induzierte adipogenen, osteogene, Geschäftsbedingungen, so dass-induzierte Zustand zu einem früheren Zeitpunkt ohne Unterbrechung weiter Kultur der induzierten Zustand behoben werden kann.</li>
	<li>1,5 mL adipogenen und osteogene Induktion Medien in jede Vertiefung der induzierten Zustand hinzugeben. 1,5 mL adipogenen und osteogene-Induktion Medien in jede Vertiefung des Zustandes-induzierte hinzugeben. Beginnen Sie Inkubation der adipogenen und osteogene induzierte und nicht-induzierte Zellpopulationen bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
	<li>Spin-down das restliche Volumen des menschlichen PVAT Vorläuferzellen und menschlichen Knochenmark MSCs für 7 min bei 500 X g.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Lautstärke benötigt, um verbleibende Knochenmark und PVAT abgeleitet Zelle Pellets zu einer Dichte von 100.000 Zellen/10 µL (106 Zellen/mL) aufzuwirbeln. Pellets in das berechnete Volumen des MSC Wachstumsmedium für Chondrogenic Abstammung Induktion aufzuwirbeln. Sanft bewegen das Volumen der Zellen nach oben und unten mit einem pipettieren, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten.</li>
	<li>Pipette einen 10 µL Tropfen der Lösung konzentrierte Zelle in der Mitte von jedem Bohrloch eine Micromass von 100.000 Zellen zu bilden. Legen Sie 1 mL sterile H2O, im benachbarten Brunnen um Verdunstung zu verhindern. Inkubieren Micromass Kulturen für 2 h bei 37 ° C und 5 % CO2 erlauben die Micromass zu aggregieren.</li>
	<li>Nach 2 Stunden vorsichtig hinzugeben Chondrogenic Differenzierung Medien gespickt mit 10 ng/mL menschlichen TGFβ1 zu jedem der induzierten Zustand Brunnen. 1,5 mL der Medien-Induktion (Knochenmark MSC Wachstumsmedium) sorgfältig in die Vertiefungen-induzierte Zustand hinzufügen Verwenden Sie separate 12-Well-Platten für die induzierte und nicht-induzierten Bedingungen, so dass-induzierte Zustand zu einem früheren Zeitpunkt behoben werden kann.</li>
</ol>5. Protokoll Nr. 4: Kultur adipogenen, osteogene, und Chondrogenic Linien für 14 Tage
<ol><li>Kultur der induzierten und nicht-induzierten Bedingungen alle drei Linien für 4 Tage bei 37 ° C und 5 % CO2, erfrischende Medien alle 2 Tage. Am 4. Tag ändern Sie die induzierte adipogenen Abstammung Bedingung von Induktion Medien Wartung Medien für den Rest des Tests.</li>
	<li>Aller nicht-induzierten Bedingungen 10 % Formalin für 12 h entsorgen Formalin fixieren und waschen alle festen Brunnen 2 X mit PBS-Puffer zu entfernen alle Spuren von Formalin. Lagern Sie Platten mit PBS-Puffer bei 4 ° C bis zur Verarbeitung.</li>
	<li>Kultur der induzierten Bedingungen für eine Gesamtmenge von 14 Tagen, erfrischende Medien alle 2 Tage. Frische TGFβ1 am 10 ng/mL Endkonzentration mit jeder Aktualisierung der Chondrogenic Induktion Medien hinzufügen. Weiterhin die adipogenen Linie in der adipogenen Wartung und osteogene Abstammung Induktion Medien, alle 2 Tage erfrischende Kultur. Am 14. Tag fix alle induzierte Bedingungen für 12 h in 10 % Formalin für das Beflecken.</li>
	<li>Kratzen Sie oder Gießen Sie die Micromass in der induzierten Chondrogenic Zustand in einer Kassette für die Einbettung. Die Micromass in einer Reihe von zunehmend konzentrierter Alkohol Bäder für 5 min, beginnend bei 70 %, dann zweimal in 95 %, 80 % und zweimal mehr in absoluten Alkohol zu entwässern. Legen Sie die Kassette in einem Entalkoholisierung Agent und dann schließlich Betten Sie die Kassette in Paraffinwachs für schneiden und färben ein.</li>
</ol>6. Protokoll Nr. 5: Färbung adipogenen Zustand mit Öl rot O
<ol><li>Bereiten Sie Öl rot O-Stammlösung durch Auflösen von 350 mg Öl rot O in 100 mL 100 % Isopropanol. Mischen Sie für 2 h mit Stir Bar und Vakuum durch einen 0,2 µm-Filter. Stammlösung kann im Dunkeln bei Raumtemperatur 1 Jahr gelagert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie Öl rot O Lösung durch Mischen von 3 Teilen-Stammlösung auf 2 Teile DiH20 (z.B. 60 mL der Stammlösung auf 40 mL DiH20) arbeiten. Die Endkonzentration von Öl rot O in die Arbeitslösung ist 2,1 mg/mL.</li>
	<li>Entfernen Sie alle Flüssigkeit aus Brunnen. Waschen Sie jeden gut 2 X mit 60 % Isopropanol, achten Sie darauf, alles Wasser von den Seiten der Brunnen komplett zu entfernen. Aspirieren Sie 60 % Isopropanol und fügen Sie schnell Öl rot O funktionierende Lösung ohne Berührung der Wände der Brunnen, der Boden bedeckt hinzu. Es ist wichtig, dass dieser Schritt schnell erledigt ist, so dass der Brunnen nicht trocken.</li>
	<li>Sobald das Öl rot O hinzugefügt wird, brüten Sie für 10 min bei Raumtemperatur mit sanftes Schaukeln.</li>
	<li>Entfernen Sie alle Öl rot O und sofort fügen Sie destilliertem H2O. Wash mit destilliertem H2O 10 m zu beginnen, ungebundenen Öl rot O. entfernen hinzu Nach 10 min, Öl rot O Aspirieren und wiederholen des Waschvorgangs 3 X.</li>
	<li>Sobald die Reinigung abgeschlossen ist, fügen Sie PBS und Bild der Zellen. Lagern Sie gefärbte Zellen mit PBS-Puffer bei 4 ° c</li>
</ol>7. Protokoll 6: Färbung osteogene Zustand mit Alizarin rot
<ol><li>Entfernen Sie alle Flüssigkeit aus jedem Brunnen. Fügen Sie entsprechende Volumen der 2 % igen Alizarin roten Fleck Lösung in jede Vertiefung (1,5 mL pro Bohrloch für eine 12-Well-Platte) und leicht kippen der Platte von Seite zu Seite, bis die Lösung vollständig den Boden des Brunnens bedeckt.</li>
	<li>15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Alizarin rot aus dem Brunnen zu entfernen. Spülen Sie jeweils gut viermal mit destilliertem H2O, wobei Vorsicht, nicht zu verdrängen, Kalzium-Kristallen sanft. Trocknen lassen.</li>
</ol>8. Protokoll 7: Färbung Chondrogenic Zustand mit Masson Trichrome
<ol><li>
Backen Sie Folien in einem 60 ° C trocken Ofen für 30 min. Deparaffinize und Hydrat Abschnitte, destilliertes Wasser.
	<ol>
<li>Um deinen Durst, legen Sie Folien in drei 5 min Inkubationen mit Entalkoholisierung Agenten, gefolgt von 5 min Inkubationen in absteigender Alkoholkonzentrationen wie folgt: zwei bei 100 % (absolute Ethanol), zwei mit 95 % Alkohol, zwei bei 80 %, zwei bei 70 %, und schließlich zwei destilliert in H2kann in H2O bleiben O. gleitet, während Bouins Fixiermittel vorbereitet wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platz 40 mL Bouins Fixiermittel in einem Kunststoff microwavable Coplin Glas (unbedacht). Mikrowelle auf hoch bringen Temp auf 55 ° C. Legen Sie die Folie in beheizten Lösung für 20 min; ruhen lassen, auf der Theke abgedeckt. Waschen Sie in fließendem Leitungswasser für 10 min oder bis alle die gelbe Farbe verschwindet.</li>
	<li>Färben Sie Abschnitte in Weigerts Hämatoxylin für 10 min. Waschen in fließendem Leitungswasser für 10 min..</li>
	<li>Führen Sie Abschnitte in Beibrichs scharlachroten saures Fuchsin-Lösung für 10 min. Waschen 3 x 10 min im Leitungswasser zu Flecken. Beize Folien in Phosphotungstic/Phosphomolybdic saure Lösung für 10 Minuten. Nicht ausspülen.</li>
	<li>Legen Sie Folien direkt in Anilin blauen Lösung für 10 min. Spülen mit zwei kurzen Dips in Leitungswasser.</li>
	<li>Legen Sie Folien in 1 % Essigsäure Lösung 3 bis 5 Minuten waschen im Leitungswasser für 1 min. Platz in 95 % igem Ethanol für 1 min. gelief gemäß Schritt 5.4 und Halterung mit Kunstharz.</li>
</ol>

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<li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Adipöse Vorläuferzellen aus verschiedenen Depots unterschiedlich in Phänotyp und Differenzierung möglicher9. Kultivierung PVAT stammenden Vorfahren von einem einzigen Patienten Spender in gleichzeitige Induktion auf drei verschiedenen Linien, ermöglicht adipogenen, osteogene, und Chondrogenic, eine kontrollierte Untersuchung der pluripotenten Kapazität dieses Romans Bevölkerung von Vorläuferzellen. In diesem Bericht beschriebene Methode kann die Kapazität der Differenzierung Vorläuferzellen aus me...

Fettgewebe ist eine reiche Quelle von Multi-potenten mesenchymalen Stammzellen (MSC) in der Lage, Differenzierung in osteogene, adipogenen und Chondrogenic Linien1. Dieses Gewebe wird erweitert durch Hypertrophie der Reifen Adipozyten und de Novo Differenzierung von resident MSC zu Adipozyten. Perivaskuläre Fettgewebe (PVAT) umgibt den Blutgefäßen und regelt die Gefäßfunktion2,3. Adipositas-induzierte PVAT Erweiterung verschärft die Herz-Kreislauf-Krankheiten. Während der multipotente Potenzial von MSC aus menschlichen Subkutane Fettgewebe-Depots wurden gut untersuchte4,5, haben keine Studien explantiert und bewertet die Differenzierung Kapazität des menschlichen PVAT abgeleitet Vorläuferzellen, wahrscheinlich aufgrund die Invasivität der Beschaffung. Ziel dieser Arbeit ist es daher, liefern eine Methodik um explant und Vorläuferzellen aus menschlichen Aortenklappe PVAT von Patienten mit einer kardiovaskulären Erkrankung zu verbreiten und ihre Neigung zu knochenbildenden unterscheiden, Chondrogenic und adipogenen Linien zu testen. Unsere PVAT ist von der Website der Anastomose der Bypass-Prothese auf aufsteigende Aorta von adipösen Patienten mit koronarer Bypassoperation Transplantat. Frisch isolierte PVAT wird enzymatisch dissoziierten und Stromazellen vaskuläre Bruch ist isoliert und propagiert in-vitro-, ermöglicht uns, zum ersten Mal die Differenzierung Kapazität des menschlichen PVAT abgeleitet Vorläuferzellen zu testen.
Mit primären kultivierten menschlichen PVAT Stromazellen vaskulären Bruchteil, testeten wir drei Assays entwickelt, um Stammzellen/Vorläuferzellen in Richtung adipogenen, osteogene, oder Chondrogenic Linien unterscheiden zu induzieren. Unsere vorherige Studie identifiziert eine Bevölkerung von CD73 + CD105 + und PDGFRa + (CD140a) Zellen, die robust in Adipozyten6, differenzieren können, obwohl ihre Multipotenz nicht getestet wurde. PVAT regelt direkt vaskulären Ton und Entzündungen7. Die Begründung für die Prüfung der Differenzierung Potenzial dieser neuartigen Zellpopulation ist zu beginnen, der spezialisierten Einfluss der PVAT auf Gefäßfunktion und Mechanismen der PVAT Expansion während Fettleibigkeit zu verstehen. Diese Methode erhöht unser Verständnis der Funktionen von Fettgewebe abgeleitete Vorläuferzellen und ermöglicht es uns, zu identifizieren und vergleichen Sie Gemeinsamkeiten und Unterschiede der Vorläuferzellen aus verschiedenen Gewebe Quellen. Wir bauen auf etablierte und validierten Ansätze zum isolieren und Differenzierung von MSC auf verschiedenen Linien und optimieren Verfahren um die Lebensfähigkeit des menschlichen PVAT abgeleitet Vorläuferzellen zu maximieren. Diese Techniken haben breite Anwendungen in den Bereichen von Stamm- und Vorläuferzellen Zelle Forschung und Fettgewebe.

<table><tbody><tr><td>Tierversuchsfreie Kollagenase/Dispase-Mischung I &nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCR139</td><td>50mg</td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>NewComerSupply</td><td>1003A</td><td>1% Wässrige Lösung pH 2,5</td></tr><tr><td>Alizarin Red</td><td>Amresco</td><td>9436-25G</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12561056</td><td></td></tr><tr><td>Anilinblau</td><td>NewComerSupply</td><td>10073C</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum/Antimykotikum</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Beibrich's Scharlach Fuchsin</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A3908-25G</td><td></td></tr><tr><td>b-Glycerophosphat</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9422-10G</td><td></td></tr><tr><td>Biebrich Scharlachrot</td><td>EKI</td><td>2248-25G</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Millipore-Sigma</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Bouin's Fixiermittel</td><td>NewComerSupply</td><td>1020A</td><td></td></tr><tr><td>Rind Serumalbumin</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td>gelagert bei 4 &°; C</td></tr><tr><td>Zellablösungslösung</td><td>Accutase</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Bell Sieb (70 mm)</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D4902-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>4,5 g/L Glukose, L-Glut und Pyruvat</td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>ThermoFisher</td><td>10565-042</td><td>hoher Glukosegehalt, Glutamax, Natrium Bicarbinat</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologicals&nbsp;</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>NewComerSupply</td><td>1090</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine, Rinderhaut</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9391-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>Glutamin</td></tr><tr><td>Supplement HBSS</td><td>Lonza</td><td>10-547F</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I5879-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Insulinlösung</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Öl rot O</td><td>Millipore-Sigma</td><td>O0625-100G</td><td></td></tr><tr><td>Pantothensäure</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P5155-100G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td>100ml</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphotungstikum/Phosphomoybdsäurelösung</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P4006-100G/221856-100G</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Antimikrobielles Reagenz für Nährmedien.</td></tr><tr><td>Rosiglitazon</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R2408-10MG</td><td></td></tr><tr><td>TGFb1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Weigert's Hämatoxylin</td><td>EKI</td><td>4880-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

differenzierung-kapazität des menschlichen aortenklappe perivaskuläre fettgewebe vorläuferzellen

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Fettgewebe ist eine reiche Quelle von Multi-potenten mesenchymalen Stammzellen (MSC) in der Lage, Differenzierung in osteogene, adipogenen und Chondrogenic Linien. Adipogenen Differenzierung der Progenitorzellen ist ein wichtiger Mechanismus fahren Fettgewebe Expansion und Dysfunktion als Reaktion auf Adipositas. Verständnis Änderungen perivaskuläre Fettgewebe (PVAT) ist somit klinisch relevante in Stoffwechselerkrankung. Frühere Studien wurden jedoch überwiegend in der Maus und anderen Tieren durchgeführt Modelle. Dieses Protokoll verwendet humanen thorakale PVAT Proben von Patienten mit koronarer Bypassoperation Transplantat gesammelt. Fettgewebe aus der Aorta ascendens wurde gesammelt und verwendet für die Explantation der Stromazellen vaskulären Bruch. Wir zuvor bestätigt das Vorhandensein von adipösen Vorläuferzellen in menschlichen PVAT mit der Fähigkeit, sich in Lipid-haltigen differenzieren Adipozyten. In dieser Studie analysierten wir weiter die Differenzierung Potential der Zellen von den Stromazellen vaskulären Bruch, vermutlich mit Multi-potenten Vorläuferzellen. Wir verglichen PVAT gewonnenen Zellen menschlichen Knochenmark MSC für Unterscheidung in adipogenen, osteogene, und Chondrogenic Linien. Nach 14 Tagen der Differenzierung, bestimmte Flecken waren ausgelastet, um Lipid-Akkumulation in Adipozyten (Öl rot O), zu erkennen Schulterarthrose Ablagerungen in knochenbildenden Zellen (Alizarin rot) oder Glykosaminoglykane und Kollagen in den Chondrogenic Zellen (Masson Trichrome). Während des Knochenmarks MSC effizient in allen drei Linien differenziert, PVAT abgeleitete Zellen hatten adipogenen und Chondrogenic Potenzial, aber es fehlte ihm robuste osteogene Potenzial.

Isolierung von Stromazellen vaskulären Fraktion aus menschlichen PVAT
Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung der anatomischen Region, die darüberliegende der Aorta ascendens PVAT ermittelt wurden. Die Patientengruppen in der koronaren Bypass-Operation diese Proben von dem abgeleiteten6waren zuvor beschrie- Abbildung 1 b...

Das Ziel dieses Protokolls ist, die Fähigkeit der Vorläuferzellen aus menschlichen perivaskuläre Fettgewebe abgeleitet, in mehrere Linien der Zelle differenzieren zu testen. Differenzierung war im Vergleich zu mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen Knochenmark, die bekanntlich in Adipocyte, Osteocyte und Knorpelzelltransplantation Abstammungen zu differenzieren.

Differenzierung-Kapazität des menschlichen Aortenklappe perivaskuläre Fettgewebe Vorläuferzellen

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Perivaskuläres Fettgewebe umgibt die Blutgefäße und reguliert die kardiovaskuläre Physiologie. Dieses Protokoll wird verwendet, um Schlüsselfragen im Zusammenhang mit der Funktion menschlicher Fettvorläufer in der vaskulären Mikroumgebung zu beantworten. Adipose-Vorläuferzellen variieren je nach anatomischer Lage.Wir zeigen, dass eine Population von multipotenten Vorläufern erfolgreich aus perivaskulärem Fettgewebe von Patienten mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen abgeleitet werden kann. Der Medizinstudent spencer Scott aus meinem Labor wird das Verfahren demonstrieren. Beziehen Sie ein 500 Milligramm Stück Human Perivascular Adipose Tissue oder PVAT aus dem Operationssaal, wie im Textprotokoll beschrieben.Übertragen Sie frisches menschliches PVAT von DMEM in eine 50 Milliliter konische Röhre mit 25 Milliliter Antibiotikalösung. Mit Schaukeln für 20 Minuten bei vier Grad Celsius bebrüten. Während die PVAT in antibiotischer Lösung ist, tauen Sie einen Aliquot von Dissoziationspuffer bei 37 Grad Celsius auf.Fügen Sie 50 Mikroliter 100x Antibiotikum/Antimykotiklösung zu fünf Milliliterdissoziationspuffer hinzu und sterilisieren Sie sie mit einem 0,22-Mikron-Spritzenfilter. Fügen Sie einen Milliliter Gelatinelösung zu einem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzu. Verwenden Sie in einer laminaren Durchflusshaube sterile Zangen und Scheren, um PVAT von der Antibiotikalösung auf eine sterile Petrischale zu übertragen.Fügen Sie dem Gewebe einen Milliliter vorgewärmten Dissoziationspuffer hinzu. Das gesamte Gewebe mit sterilen Zangen und Sezierscheren fein in eine Gülle zerkleinern. Übertragen Sie die Ein-Milliliter-Gülle auf vier Milliliter Dissoziationspuffer.Inkubieren Sie die Röhre auf ihrer Seite in einem vorgewärmten 37 Grad Celsius Orbital-Shaker bei 200 U/min für eine Stunde. Nach einer Stunde sollten keine sichtbaren Gewebeteile vorhanden sein und die Lösung erscheint als trübe Zellsuspension. Filtern Sie die Lösung durch ein 70-Mikron-Zellsieb-Set auf einem 50-Milliliter-Konusrohr.Spülen Sie das Sieb mit zusätzlichen 10 Milliliter Antibiotika-Lösung, um so viele Zellen wie möglich zu erfassen. Drücken Sie das Sieb nicht. Nun pellet die Zellen für 12 Minuten bei 300 mal g in einer schwingenden Eimerzentrifuge.Nach der Zentrifugation wird das Rohr in eine fettige Deckschicht aus Adipozyten, einer Interphase und einem Pellet getrennt. Das Pellet ist die stromale Gefäßfraktion, die Endothelzellen, Immunzellen, Blutzellen und Vorläuferzellen enthält. Das Pellet in 10 Milliliter HBSS und Zentrifuge fünf Minuten bei 300 mal g wieder aufhängen.Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Wähme in HBSS. Nun die Gelatine von einer 24-Well-Platte ansaugen. Waschen Sie den Brunnen einmal mit HBSS vorsichtig, um ungebundene Gelatine zu entfernen.Setzen Sie das stromale Gefäßfraktionpellet mit intakten roten Blutkörperchen in einem Milliliter Wachstumsmedium und Samen auf den gelatinebeschichteten Brunnen aus. Dann fügen Sie menschlichen FGF2 zu einer endigen Konzentration von 25 Nanogramm pro Milliliter in Kulturmedium. 24 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 inkubieren.Nach dem Wachstum der Zellen für 24 Stunden, entfernen Sie die Wachstumsmedien und waschen Sie die Zellen fünfmal mit HBSS. Dieser Waschschritt entfernt rote Blutkörperchen und abgestorbene Zellen. Dann fügen Sie einen Milliliter frische Skaliermittel mit 25 Nanogramm pro Milliliter FGF2 zu jedem Brunnen ergänzt.Wechseln Sie die Medien alle 48 Stunden und stellen Sie sicher, dass sie jedes Mal mit 25 Nanogramm pro Milliliter frischem FGF2 ergänzt werden. Durchgangszellen, sobald sie sieben bis zehn Tage nach der Explantation 100% Zusammenfluss erreichen. Um dies zu tun, aspirieren Wachstumsmedien und waschen Sie die Monolayer zweimal mit einem Milliliter HBSS.Alle HBSS aus den Brunnen ansaugen und ein paar Tropfen Zelldissoziationslösung hinzufügen. Tippen und wirbeln Sie die Platte mehrmals und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2 für fünf bis sieben Minuten, um die Zellen zu heben. Dann fügen Sie etwa einen Milliliter frisches Kulturmedium zu den losgelösten Zellen hinzu.Verteilen Sie 500 Mikroliter der freistehenden Zellen auf zwei Brunnen einer 24-Well-Platte, die jeweils 500 Mikroliter Wachstumsmedien und 25 Nanogramm FGF2 enthält. Auch Kultur menschliches Knochenmark Mesenchymal Stammzellen oder MSC Kolonien, wie im Textprotokoll beschrieben. Die entsprechenden Anzahl von Knochenmark- und PVAT-abgeleiteten Zellen pro Bohrung einer 12-Well-Platte.Für adipogene und osteogene Erkrankungen, Platte etwa 200, 000 bis 225, 000 Zellen pro Brunnen. Während für chondrogenische Bedingungen, Platte 150, 000 bis 175, 000 Zellen pro Brunnen. Dann dissoziieren Sie Zellen sowohl von der menschlichen PVAT-Vorläuferzellpopulation als auch von der mSC-Population des menschlichen Knochenmarks, indem Sie eine Zellablösung hinzufügen.Inkubieren Sie die Zellen in der Ablösungslösung bei 37 Grad Celsius und 5%CO2 für fünf Minuten. Ziehen Sie die Populationen in separate 15 Milliliter konische Fläschchen. Drehen Sie die Durchstechflaschen sieben Minuten lang mit 500 mal g nach unten, um die Zellen zu pellet.Setzen Sie dann die Zellen in einem Milliliter PBS wieder aus und verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellzahl zu schätzen. Die Zellen wie bisher in 12-Well-Gerichten auftellern. Stellen Sie separate Gerichte für die induzierten und nicht-induzierten adipogenen und osteogene Bedingungen zur Verfügung.Und fügen Sie 1,5 Milliliter adipogene und osteogene Leitungsmedien zu jedem Brunnen des induzierten Zustands hinzu. Dann fügen Sie 1,5 Milliliter adipogene und osteogene Nicht-Induktionsmedien zu jedem Brunnen des nicht-induzierten Zustands hinzu. Beginnen Sie mit der Inkubation der adipogenen und osteogenen induzierten und nicht induzierten Zellpopulationen bei 37 Grad Celsius und 5% CO2.Drehen Sie das restliche Volumen menschlicher PVAT-Vorläuferzellen und menschlicher Knochenmark-MSCs sieben Minuten lang bei 500-fachm g herunter. Bestimmen Sie das Volumen, das benötigt wird, um das verbleibende Knochenmark und PVAT-abgeleitete Zellpellets wieder aufzuhängen, um eine Dichte von 100.000 Zellen pro 10 Mikroliter zu erreichen. Dann setzen Sie die Pellets im berechneten Volumen der MSC-Wachstumsmedien für chondrogenische Abstammungsinduktion wieder aus.Bewegen Sie das Volumen der Zellen vorsichtig mit einer Pipette nach oben und unten, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten. Nun pipette ein 10 Mikroliter Tröpfchen der konzentrierten Zelllösung in die Mitte jedes Brunnens, um eine Mikromasse von 100. 000 Zellen zu bilden. Legen Sie einen Milliliter steriles Wasser in den angrenzenden Brunnen, um Verdunstung zu verhindern.Inkubieren Sie die Mikromassenkulturen für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5%CO2, damit sich die Mikromasse aggregieren kann. Nach zwei Stunden, sorgfältig hinzufügen chondrogene Differenzierung Medien spiked mit 10 Nanogramm pro Milliliter menschlichen TGF-beta-eins zu jedem der induzierten Zustand Brunnen. Fügen Sie nun 1,5 Milliliter der nicht induktionsmittelförmigen Medien vorsichtig in die nicht induzierten Zustandsbrunnen.Verschrotten oder gießen Sie die Mikromasse in der induzierten chondrogenischen Zustand in eine Kassette, um zu dehydrieren, einbetten, und Färben der Probe, wie im Textprotokoll beschrieben. Adipogene Differenzierungsstudien wurden parallel zu den von menschlichen Knochenmark abgeleiteten MSC- und PVAT-abgeleiteten Vorläuferzellen durchgeführt. Im nicht induzierten Zustand ist keine Lipidakkumulation erkennbar.Dies steht im Gegensatz zu dem induzierten Zustand, der nach der Färbung neutraler Lipide mit Oil Red O gezeigt wurde. Während der Grad der Differenzierung in den menschlichen aortenförmigen PVAT-abgeleiteten Zellen robuster ist, zeigten beide menschlichen Zellquellen die Fähigkeit, für die adipogene Abstammung zu unterscheiden. Das osteogene Differenzierungsprotokoll wurde für menschliche Knochenmark-abgeleitete MSCs und PVAT-abgeleitete Zellen verwendet. Nicht induzierte Zellen färbten sich nicht mit Alizarin Red.Nach dem osteogenen Differenzierungsprotokoll entwickelten die menschlichen MSCs verkalkte Knötchen, die mit Alizarin Red gefärbt wurden, während menschliche Aorten-PVAT-Zellen dies nicht taten. Zellen, die sowohl von menschlichen Knochenmark-MSCs als auch von humanem PVAT abgeleitet wurden, zeigten Merkmale, die für die chondrogenische Differenzierung charakteristisch sind, mit reichlich Kollagenansammlung in der Mikromasse. Mikromasse wird aus menschlichen Knochenmark MSCs gebildet und aortenförmige PVAT-abgeleitete Zellen zeigten auch eine reichliche Ansammlung von Glykosaminoglykanen, wie durch Alcian Blue Färbung angegeben.Morphologisch wurden Strukturen ähnlich wie Lücken mit Zellen nachgewiesen, die in Hohlräumen saßen, die von Kollagenablagerungen umgeben waren. Es ist wichtig, perivaskuläres Fettgewebe vor enzymatischer Disassoziation fein zu zerkleinern und sicherzustellen, dass für jeden Liniendifferenzierungstest eine angemessene Zelldichte plattiert wird. Nach diesem Verfahren sollte quantitative PCR in Kombination mit Western Blot und Flow Zytometrie verwendet werden, um linienspezifische Marker von differenzierten Vorläufern aus perivaskulären Fett- und Knochenmarkquellen zu charakterisieren.Mit dieser Technik können wir beginnen, die Mechanismen zu verstehen, die die perivaskuläre Fettgewebeerweiterung und Dysfunktion während der Fettleibigkeit regulieren und die Implikationen, die Vorläuferzellen auf die Gefäßfunktion und Herz-Kreislauf-Erkrankungen haben.

differentiation-capacity-human-aortic-perivascular-adipose-progenitor

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Menschliche perivaskulären Stammzellen (PSCs) sind eine neue Klasse für Stammzell-Skelett-Geweberegeneration ähnlich wie mesenchymale Stammzellen (MSCs). PSCs durch FACS (fluorescence activated cell sorting) kann aus dem Fettgewebe während der üblichen Fettabsaugung Verfahren beschafft isoliert werden, dann mit einem osteoinduktiven Gerüst kombiniert, um die Knochenbildung zu...

Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

Die transkriptionelle Heterogenität innerhalb menschlicher Fettgewebe-abgeleiteter Stromazellen kann auf Einzelzellebene mit Hilfe von Zelloberflächenmarkern und osteogenen Genen definiert werden.  Wir beschreiben ein Protokoll, das die Durchflusszytometrie zur Isolierung von Zellsubpopulationen mit erhöhtem osteogenem Potenzial verwendet, das zur Verbesserung der kraniofazialen Skelettrekonstruktion verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Reife Adipozyten können durch Dedifferenzierung eine reichhaltige Quelle für Stammzellen darstellen, was zu einer homogenen Population von Fibroblasten-ähnlichen Zellen führt. Der Kollagenaseverdau wird verwendet, um reife Adipozyten aus menschlichem Fett zu isolieren. Das Ziel unseres Protokolls ist es, multipotente, dedifferenzierte Fettzellen aus humanen reifen Adipozyten zu gewinnen.

Generation of Human Fettgewebestammzellen durch Dedifferenzierung der Reife Adipozyten in Decken Kulturen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von aus Schweinefettgewebe gewonnenen Stammzellen (pADSC) aus subkutanem Fettgewebe mit Untersuchung der Multipotenz. Die multipotenten pADSC werden verwendet, um Prozesse der Adipozytendifferenzierung abzugrenzen und die Transdifferenzierung in mehrere Zelllinien des mesodermalen Mesenchyms oder weitere Linien des Ektoderms und des Endoderms für regenerative Studien zu untersuchen.

Isolierung und Differenzierung von Fettgewebe gewonnenen Stammzellen aus Porcine Subkutan Fettgewebes

Menschliche Herzgewebe birgt multi perivaskuläre Vorläuferzellpopulationen, die für myokardiale Regeneration geeignet sein können. Die hier beschriebene Technik ermöglicht die gleichzeitige Isolierung und Reinigung von zwei multi stromalen Zellpopulationen , die mit nativem Blutgefäße, dh CD146 + CD34 - Perizyten und CD34 + CD146 - Adventitia - Zellen aus dem menschlichen Herzmuskel.

Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe

Hier berichten wir über eine Methode zur Isolierung von Adipozyten-Progenitor-Zellen (APC) -Populationen aus perivaskulärem Adipositus (PVAT) mittels magnetisch-aktivierter Zellsortierung (MCS). Diese Methode ermöglicht eine erhöhte Isolierung von APC pro Gramm Fettgewebe im Vergleich zu Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS).

Expansion und Adipogenese Induktion von Adipozyten-Progenitoren aus perivaskulärem Fettgewebe, isoliert durch magnetisch aktivierte Zellsortierung

Die Unterscheidung von weiß und Beige Adipozyten aus Fettgewebe vaskulären Stammeltern trägt metabolische Verbesserungspotenzial bei Adipositas. Protokolle beschrieben für eine CD34 + CD31 + Endothelzellen losgelöst von menschlichen Fett und für eine spätere in-vitro- Erweiterung und Differenzierung in weiß und Beige Adipozyten. Mehrere downstream-Anwendungen werden diskutiert.

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Wir präsentieren ein Protokoll zur Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von neuronalen Kamm abgeleiteten Adipose-abgeleiteten Stammzellen (NCADSCs) aus dem periaortischen Fettgewebe von Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Mäuse. Die NCADSCs können eine leicht zugängliche Quelle von ADSCs zur Modellierung von Adipogenese oder Lipogenese in vitro sein.

Isolation, Kultur und adipogene Induktion von Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Wir präsentieren eine einfache Methode, um hochlebensfähige Fettvorläuferzellen von mausepididymalen Fettpolstern mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung zu isolieren.

Herstellung von Adipose-Progenitorzellen aus Maus-Epididymal-Adipose-Geweben

Das Protokoll ermöglicht die Erzeugung einer reinen Adipozytenpopulation aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs). Retinsäure wird verwendet, um iPS-Zellen in mesenchymale Stammzellen (MSCs) zu differenzieren, die für die Produktion von Adipozyten verwendet werden. Anschließend wird ein Sortieransatz auf Basis der Nilrotfärbung verwendet, um reine Adipozyten zu erhalten.

Robuste Differenzierung von humanen iPS-Zellen in eine reine Population von Adipozyten zur Untersuchung von Adipozyten-assoziierten Erkrankungen

In dieser Arbeit beschreiben wir die Isolierung, Kultivierung und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortalem Fettgewebe der Maus, was die Untersuchung der perivaskulären Fettgewebsfunktion und ihrer Beziehung zu Gefäßzellen ermöglicht.

Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortischem Fettgewebe der Maus

Erfahren Sie die Isolierung und Differenzierung perivaskulärer Vorläuferzellen aus menschlichem Fettgewebe für kardiovaskuläre Forschung. Diese Methode ermöglicht Studien zur Zelltherapie und Gewebe-Regeneration.

Differenzierung-Kapazität des menschlichen Aortenklappe perivaskuläre Fettgewebe Vorläuferzellen

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