Eine Methode zur 3D-Rekonstruktion und Virtual Reality-Analyse von Glia- und Neuronalzellen
28. September 2019
Die beschriebene Pipeline ist für die Segmentierung von Elektronenmikroskopie-Datensätzen größer als Gigabyte konzipiert, um Ganzzellmorphologien zu extrahieren. Sobald die Zellen in 3D rekonstruiert sind, kann kundenspezifische Software, die auf individuelle Bedürfnisse zugeschnitten ist, verwendet werden, um eine qualitative und quantitative Analyse direkt in 3D durchzuführen, auch mit virtueller Realität, um Die Sichtokklusion zu überwinden.
Die automatisierten seriellen Elektronenmikroskopietechniken. Der Tempobegrenzungsschritt in der Pipeline führt zur Erzeugung biologischer dreidimensionaler Modelle Bildverarbeitung. Unser Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, um eine dichtere Konstruktion von Bildvolumen in nur wenigen Tagen zu erzeugen.
Kombiniert mit einem Ansatz für quantitative Messungen mit dreidimensionalen Modellen. Mit dieser Technik kann die 3D-Struktur von Geweben, die nicht das Gehirn sind, potenziell analysiert werden, um für bestimmte Krankheiten typische strukturelle Beeinträchtigungen zu identifizieren und die diagnostische Strategie zu verbessern. Die Segmentierung ist ein mühsamer Schritt.
Nehmen Sie sich die Zeit, es so genau wie möglich zu machen, um das Korrekturlesen einer fehlerhaften Segmentierung zu vermeiden und den gesamten Prozess neu starten zu müssen. Das Design der Software manchmal nicht sehr benutzerfreundlich. Daher ist es wichtig, die Startarbeit für die Segmentierung zu sehen.
Öffnen Sie den Bildstapel, indem Sie die native Datei aus dem Mikroskop ziehen und ablegen, die den Stapel enthält, oder kaufen Sie das Ziehen und Ablegen des Ordners mit dem gesamten Bildstapel in das Softwarefenster Sobald der Stapel geöffnet wurde, gehen Sie zu Bild, Eigenschaften, um sicherzustellen, dass die Voxelgröße aus den Metadaten gelesen wurde. Verwandeln Sie das Bild in 8-Bit, indem Sie auf Bild, Typ und 8-Bit klicken. Wenn der ursprüngliche Stapel als verschiedene Kacheln erworben wird, wenden Sie Die Nähte in TrakEM2 an.
Erstellen Sie ein neues TrakEM2-Projekt mit New, TrakEM2 mit TrakEM2 Embedded Functions Segmentstrukturen von Interesse, falls erforderlich. Klicken Sie im TrakEM2-Gooey mit der rechten Maustaste auf "unter dem Vorlagenfenster", und wählen Sie neue untergeordnete Bereichsliste hinzufügen'Ziehen und ablegen Sie alles'in den Ordner, unter Projektobjekten'und eine'würde dort erscheinen. Drag & Drop, die Bereichsliste'von der Vorlage zu dem anything'located under project objects'On the image stack viewport, wählen Sie den Z-Space'mit dem Cursor.
Die Bereichsliste' wird mit der eindeutigen ID-Nummer angezeigt. Wählen Sie das Pinselwerkzeug oben und verwenden Sie die Maus, um eine Struktur zu segmentieren, indem Sie sie zytosol über den gesamten Z-Stack füllen. Exportieren Sie die segmentierte Masse, die in Ilastik als Saatgut für das Schnitzen verwendet werden soll.
Klicken Sie dazu mit der rechten Maustaste auf das Flächenlistenobjekt in der Z-Raumliste oder auf der Maske im Ansichtsport, und wählen Sie export'area list'als Beschriftungen T-I-F aus. Reduzieren Sie abhängig von der Auflösung, die für weitere Rekonstruktionen erforderlich ist, die Pixelgröße des Bildstapels durch Down-Sampling. Berücksichtigen Sie die Speicheranforderungen der Software, die für die Segmentierung und Rekonstruktion verwendet wird.
Ilastik verarbeitet Stapel von bis zu fünfhundert Pixeln auf X-Y. Berücksichtigen Sie die Mindestgröße, die die Objekte noch erkennbar erscheinen und somit segmentiert werden können. Verwenden Sie image'adjust size'Um den Kontrast zu erhöhen und die Segmentierung zu unterstützen, kann der unscharfe Maskenfilter angewendet werden, um Membranen knackiger zu machen.
Verwenden Sie process'filters'unsharp mass'Export the image stack as single images'for further processing in segmentation software, using file'save as'image sequence'and choose TIFF'format. Wählen Sie im Haupt-Ilastik-Gooey das Carving-Modul aus. Laden Sie den Bildstapel, indem Sie new'hinzufügen und fügen Sie ein einzelnes 3D/4D-Volume aus der Sequenz 'Wählen Sie das ganze Verzeichnis'und wählen Sie den Ordner mit dem Image-Stack als einzelne Dateien gespeichert'Am unteren Rand des neuen Fensters, wo Optionen zum Laden der Bilder vorhanden sind, stellen Sie sicher, dass Z"ausgewählt.
Für die folgenden Schritte finden Sie alle Operationen und Tasten auf der linken Seite der Hauptsoftware gooey. Verwenden Sie unter der Registerkarte Vorverarbeitung die bereits geprüften Standardoptionen. Verwenden Sie helle Linien 'Rich Filter'und halten Sie die Filterskala bei 1.600.
Dieser Umfang kann anschließend geändert werden. Nachdem die Vorverarbeitung abgeschlossen ist, wählen Sie die nächste Seite im Dropdown-Menü des Beschriftungsmoduls aus. Ein Objekt und ein Hintergrund sind standardmäßig vorhanden.
Wählen Sie den Objektkern aus, indem Sie darauf klicken, und zeichnen Sie eine Linie über der Interessenstruktur. Wählen Sie dann den Hintergrundkern aus, und zeichnen Sie eine oder mehrere Linien außerhalb des zu rekonstruierenden Objekts. Klicken Sie nun auf segment' und warten Sie.
Abhängig von der Leistung des Computers und der Größe des Stapels kann die Segmentierung einige Sekunden bis Stunden dauern. Sobald dies geschehen ist, sollte eine halbtransparente Maske, die die Segmentierung hervorhebt, über der segmentierten Struktur angezeigt werden. Führen Sie einen Bildlauf durch den Stapel durch, um die Segmentierung zu überprüfen.
Die Segmentierung ist möglicherweise nicht korrekt, wenn sie nicht der Struktur des Interesses folgt oder aus ihr austritt. Korrigieren Sie alle Überschüttungen, indem Sie einen Hintergrundsamen auf die verschüttete Segmentierung legen. Und fügen Sie einen Objektkern über das nicht rekonstruierte Segment des Objekts des Interesses hinzu.
Das genaue visuelle Korrekturlesen der Segmentierung mit Ilastik mag mühsam sein, aber es ist wichtig sicherzustellen, dass die exportierten Objekte keine Artefakte enthalten. Wenn die Segmentierung immer noch nicht korrekt ist, versuchen Sie, mit dem bias'Parameter zu ändern, der die Anzahl der akzeptierten unsicheren klassifizierten Pixel erhöht oder verringert. Der Wert ist standardmäßig 0,95.
Verringern Sie es, um ein Übergreifen oder Erhöhen zu begrenzen, wenn die Segmentierung zu konservativ ist. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, auf die Vorverarbeitung zu klicken und die Größe des Filters zu ändern. Durch die Erhöhung des Wertes werden die salz- und pfefferlärmähnlichen Effekte minimiert, aber auch Membranen verschwommener und kleinere Details schwerer zu erkennen sein.
Dies kann das Übergreifen begrenzen. Wiederholen Sie so viel wie nötig, solange alle gewünschten Objekte segmentiert wurden. Sobald ein Objekt fertig ist, navigieren Sie zu segment' und klicken Sie auf aktuelles Objekt speichern'Zwei neue Samen werden angezeigt, um die Segmentierung eines neuen Objekts zu starten.
Abstrakte Oberflächenmaße sofort als O-B-J-Dateien, indem Sie auf Export aller Netze klicken'Um manuell segmentierte Modelle in 3D in TrakEM2 zu visualisieren, Rechtsklickbereich Liste, dann wählen Sie in 3D anzeigen'Ein höherer Wert erzeugt eine niedrigere Auflösung Netz. Schließlich exportieren Sie das 3D-Netz als WaveFront O-B-J', indem Sie aus der Menüdatei 'export surfaces'WaveFront'Nach der Installation des Neuromorph-Toolkits, wie im Textprotokoll beschrieben, einen neuen Mixer auswählen. Importieren Sie die Objekte mithilfe des Neuromorph-Batchimports, indem Sie im Szenenmenü auf Importobjekte klicken, um mehrere Objekte gleichzeitig zu importieren.
Stellen Sie sicher, dass Sie aktivieren, neu vernetzen und glatte Schattierungen verwenden. Wählen Sie das Objekt aus dem Outliner aus, und ändern Sie die Octree-Tiefe der Re-Mesh-Funktion unter dem Menü des Modifizierers. Arbeiten Sie iterativ, um die Anzahl der Scheitelpunkte zu minimieren und zu vermeiden, dass Details in der Auflösung und korrekten Morphologie verloren gehen.
Beim Ändern der Octree-Tiefe ändert sich das Netz auf dem Haupt-Gooey entsprechend. Sobald Sie fertig sind, klicken Sie auf Anwenden, um den Prozess zu abschließen. Navigieren Sie zum Neuromorph-Menü im linken Bereich, und verwenden Sie die Bild-Superimposition-Tool-Image-Stack-Interaktionen, um den Bildstapel zu laden.
Achten Sie darauf, die physische Größe des Bildstapels für X, Y und Z einzugeben und den Pfad des Stapels auszuwählen, indem Sie auf Quelle Z.X und Y auf orthogonale Ebenen klicken. Sie sind optional und werden nur geladen, wenn der Benutzer den gültigen Pfad einfügt. Wählen Sie dann ein Netz im Ansichtsport aus, indem Sie mit der rechten Maustaste darauf klicken.
Geben Sie den Bearbeitungsmodus ein, indem Sie die Registerkarte drücken, wählen Sie einen oder mehrere Scheitelpunkte mit der rechten Maustaste aus und klicken Sie schließlich auf Bild am Scheitelpunkt anzeigen. Eine oder mehrere geschnittene Ebenen mit dem Mikrographen erscheinen überdem über dem Netz. Wählen Sie die Schnittebene aus, indem Sie mit der rechten Maustaste darauf klicken.
Drücken Sie dann die Steuerung Y und scrollen Sie über das 3D-Modell mit dem Mausscroll. Dies kann auch als Korrekturlesemethode verwendet werden. Hier ist die Segmentierung und Rekonstruktion mit TrakEM2 und Ilastik zu sehen.
Der TrakEM2 Gooey wird mit Objekten angezeigt, die manuell rot segmentiert sind. Die exportierte Maske kann dann als Eingabe für die halbautomatische Segmentierung verwendet werden. Von Ilastik können Masken zum manuellen Korrekturlesen weiter nach TrakEM2 exportiert werden.
Masken können als dreieckige 3D-Netze exportiert werden, um rekonstruierte Strukturen zu enthüllen. In diesem Beispiel wurden vier Neuronen, Astrozyten, Mikroglia und Pericyte mit diesem Verfahren rekonstruiert. Gezeigt wird eine 3D-Analyse rekonstruierter Morphologien mit kundenspezifischen Werkzeugen.
Hier ist ein isotropes Bildvolumen aus einem fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie-Datensatz. Eine dichte Rekonstruktion dieser Daten zeigt Axone, den astrozytischen Prozess und Dendriten. Dieser Mikrograph zeigt Beispiele für Ziele für Quantifizierungen wie Synapsen und astrozytische Glykogengranulate.
Die Maske aus diesem Mikrograph zeigt die Verteilung von Glykogengranulat um Synapsen. Hier ist eine grafische Darstellung der Eingabe und Ausgabe der grafischen Visualisierung des glykogenabgeleiteten Laktatabsorptionsmodells oder GLAM'Here zu sehen, bei dem ein Virtual Reality oder V-R-Headset bei der Arbeit an der dichten Rekonstruktion aus einem fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie-Dataset gezeigt wird. Aus einer Teilmenge von Neuriten kann eine immersive V-R-Szene beobachtet werden.
Der grüne Laser zeigt auf eine GLAM'Peak. ist von primärer Bedeutung, da die korrekte Größe der exportierten 3D-Objekte bestimmt wird und die Werte der tatsächlichen Größe entsprechen. Das Konzept der seriellen Schnittbildgebung, bildgebenden Segmentierung und 3D-Konstruktion ist ziemlich alt.
Die Entdeckung der technischen Beschleunigung führt zu Fortschritten bei den Colektomien bei der Überprüfung der Anatomie-Lehrbücher. Obwohl die Methode für die Hirnforschung in der Elektronenmikroskopie entwickelt wurde, kann sie auf jede mikroskopische Technik verallgemeinert werden, die Daten generiert. Außerdem kann jede Art von 3D-Bildgebungstechnik von solchen bildgebenden Segmentierungs- und Konstruktionstechniken profitieren. Inklusive C-T-Scans und M-R-I.
Übersicht
Diese Studie stellt eine Pipeline zur Segmentierung großer Datensätze der Elektronenmikroskopie vor, die zur Rekonstruktion ganzer Zellmorphologien in 3D dient. Angepasste Software ermöglicht qualitative und quantitative Analysen, indem sie die Visualisierung durch den Einsatz von Virtual Reality verbessert und Probleme durch Verdeckungen behebt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Elektronenmikroskopie
- 3D-Rekonstruktion
Hintergrund
- Es werden automatisierte Techniken der seriellen Schnitt-Elektronenmikroskopie eingesetzt.
- Die Pipeline zielt darauf ab, die für die Erstellung biologischer 3D-Modelle benötigte Zeit zu verkürzen.
- Die Segmentierung ist entscheidend, da Ungenauigkeiten zu umfangreichen Nacharbeiten führen können.
- Der Einsatz maßgeschneiderter Software kann die Analysefähigkeiten verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines optimierten Protokolls zur Rekonstruktion dichter Bildvolumina.
- Möglichkeit qualitativer und quantitativer Bewertungen in 3D.
- Analyse dreidimensionaler Strukturen verschiedener Gewebe zur Detektion krankheitsbedingter Beeinträchtigungen.
Verwendete Methoden
- Die Studie verwendet die Elektronenmikroskopie zur Erstellung volumetrischer Datensätze.
- Die Methoden konzentrieren sich auf die genaue Segmentierung zellulärer Strukturen in großen Bilddatenstapeln mithilfe verschiedener Software-Tools.
- Zu den Bildverarbeitungsschritten gehören die Vorbereitung des Bilddatenstapels, die Segmentierung und der Export von Objekten zur 3D-Visualisierung.
- Kritische Schritte umfassen die Sicherstellung der Genauigkeit der Voxelgröße, das Anwenden von Filtern und die manuelle Überprüfung der Segmentierungen.
Hauptergebnisse
- Die automatisierte Pipeline rekonstruiert erfolgreich genaue 3D-Modelle aus großen Datensätzen.
- Segmentierungsmethoden zeigten Robustheit beim Umgang mit komplexen Strukturen.
- Die visuelle Korrekturlesung ist entscheidend, um die Zuverlässigkeit rekonstruierter Objekte sicherzustellen.
- Der Ansatz bietet potenzielle Anwendungen bei der Diagnose struktureller Schädigungen in verschiedenen Geweben.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie liefert eine grundlegende Methodik zur genauen Segmentierung von großskaligen Elektronenmikroskopiedaten.
- Die beschriebene Analyse-Pipeline verbessert die Effizienz bei der Untersuchung komplexer biologischer Strukturen, was diagnostische Strategien weiterentwickeln könnte.
- Dazu zählen Fortschritte im Verständnis der Gewebestruktur in gesunden und krankhaften Zuständen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine präzise 3D-Rekonstruktion der zellulären Ultrastruktur ermöglicht eine mechanistische Risikominderung bei der Target-Validierung, indem Unklarheiten in der Beziehung zwischen Morphologie und Funktion aufgelöst werden. Dieser Ansatz stärkt die Vorhersagekraft in der frühen Entdeckungsphase, indem quantitative strukturelle Messgrößen bereitgestellt werden, die Hypothesentests und die Aufklärung von Signalwegen unterstützen. Die Integration der Analyse in virtueller Realität verbessert die Reproduzierbarkeit und die fachübergreifende Zusammenarbeit bei der Bewertung präklinischer Modelle.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch detaillierte Visualisierung der glialen und neuronalen Ultrastruktur.
- Operativer Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem komplexe Morphologien geklärt werden, die in 2D falsch interpretiert werden könnten.
- Strategischer Wert: Unterstützt die Vorhersagesicherheit und die Priorisierung von Projektportfolios, indem strukturelle Beeinträchtigungen identifiziert werden, die auf Krankheitsmechanismen hinweisen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem dichte und präzise 3D-Modelle der Gewebearchitektur generiert werden.
- Operationaler Wert: Trägt durch quantitative Messungen aus rekonstruierten Strukturen zur Standardisierung von Assays und deren Reproduzierbarkeit bei.
- Strategischer Wert: Verbessert die Eignung für Screening-Verfahren und die Wiederverwendbarkeit von Plattformen, indem eine zuverlässige Wirkstoffbewertung in krankheitsrelevanten Systemen ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erläutert die Krankheitsrelevanz durch die Analyse struktureller Schädigungen in Axonen, Dendriten und astrogialen Fortsätzen.
- Operativer Wert: Beschreibt den Zusammenhang von Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die 3D-Morphologie mit funktionellen Hypothesen wie dem Modell zur glycogenderivierten Lactatabsorption (GLAM) verknüpft wird.
- Strategischer Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem die Visualisierung synaptischer Zielstrukturen und der Verteilung von Glykogengranula eine Abstimmung mit Biomarkern ermöglicht.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode positioniert sich innerhalb des Entdeckungsprozesses von der frühen Entdeckung bis zur Leitstrukturfeststellung und präklinischen Arbeit und unterstützt Hypothesentests, die Aufklärung von Signalwegen sowie die biologische Risikominderung durch quantitative 3D-Strukturanalyse.
- Entdeckungsbiochemie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen unterstützt, indem sie ultrasruckturelle Muster aufdeckt, die in 2D-Bildgebungsverfahren nicht aufgelöst werden können.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft und Reproduzierbarkeit des Assays anhand quantitativer Auswertungen wie der Quantifizierung von Synapsen und Glykogen-Granula.
- Analytik: Betont Messungen und Nachweise, die Teams dabei helfen, verschiedene Bedingungen zu vergleichen, einschließlich struktureller Beeinträchtigungen, die typisch für bestimmte Erkrankungen sind.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der Kontinuität in der präklinischen Forschung und der Abstimmung von Biomarkern durch die Visualisierung krankheitsbedingter struktureller Veränderungen in neuronalen und glialen Zellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar, anstatt als Einmalverfahren, anwendbar über verschiedene Mikroskopietechniken hinweg, einschließlich CT und MRT.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung und Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei der glialen und neuronalen Morphologie.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Erzeugung von 3D-Modellen aus Elektronenmikroskopie-Datensätzen.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalwirtschaftlichkeit und verringertes biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen durch frühzeitige strukturelle Risikominderung.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Voranbringungsentscheidungen basierend auf quantitativer 3D-Morphologie-Analyse.
Implementierungsüberlegungen
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in Elektronenmikroskopie, Bildsegmentierung und 3D-Visualisierungssoftware wie TrakEM2, Ilastik und Blender.
- Zu den Anforderungen an Geräteausstattung und analytische Infrastruktur gehören hochauflösende EM-Abbildungsanlagen sowie rechnerische Ressourcen zur Verarbeitung großer Bilddatenstapel.
- Standardisierungsanforderungen über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bezüglich Segmentierungsprotokolle und Korrekturlesung, um Konsistenz zwischen verschiedenen Nutzern und Standorten sicherzustellen.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, da die Methode auf jedes mikroskopische Verfahren, das 3D-Daten erzeugt, verallgemeinert werden kann.
- Praktische Einschränkungen umfassen den zeitraubenden Charakter der Segmentierung sowie die Notwendigkeit einer genauen Kalibrierung der Voxelgröße, um Messartefakte zu vermeiden.
