Name: Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Lernen Sie die Droplet-digital-PCR zur sensitiven Detektion von Tumormutationen in Patienten-Biofluiden. Diese Methode ermöglicht eine nicht-invasive Überwachung des Mutationsstatus und ergänzt bildgebende Verfahren bei schwer zugänglichen Tumoren.

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Die Autoren möchten die Großzügigkeit aller Patienten und ihrer Familien würdigen. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Smashing Walnuts Foundation (Middleburg, VA), der V Foundation (Atlanta, GA), des Gabriella Miller Kids First Data Resource Center, des Clinical and Translational Science Institute at Children es National ( 5UL1TR001876-03), Musella Foundation (Hewlett, NY), Matthew Larson Foundation (Franklin Lake, NJ), The Lilabean Foundation for Pediatric Brain Cancer Research (Silver Spring, MD), the Childhood Brain Tumor Foundation (Germantown, MD), the Children es Brain Tumor Tissue Consortium (Philadelphia, PA) und Rally Foundation for Childhood Cancer Research (Atlanta, GA).

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Die in diesem Manuskript beschriebene Methode ist in einer internationalen Patentanmeldung "Methoden zum Nachweis von Krebsbiomarkern" von Javad Nazarian & Eshini Panditharatna enthalten.

Hier haben wir unsere Methode zur Detektion und Quantifizierung der Allelhäufigkeit von Tumormutationen in cfDNA aus der flüssigen Biopsie des Patienten vorgestellt. Wir betonen wichtige Schritte für den Erfolg dieser Methode, einschließlich voranalytischer Probenverarbeitung, cfDNA-Extraktion, PCR-Assay-Design und Datenanalyse. Zur Begrenzung des verwendeten Probenvolumens wird cfDNA aus 1 ml Plasma, aber nur 500 l CSF extrahiert. Bei der Extraktion aus CSF wird gemäß der Empfehlung des Herstellers das Protokoll zur Extraktion aus 1 ml Urin (nach dem cfDNA-ExtraktionskitHandbuch 12) verwendet. Der Unterschied im Probenvolumen zwischen Plasma und CSF ist auf niedrigere Mengen an tumorspezifischer cfDNA im Plasma im Vergleich zu CSF von Patienten mit Hirntumoren zurückzuführen, was größere Probenvolumina für die Mutationsdetektion erforderlich macht8. Wenn die Probe verfügbar ist, können mehr als 1 ml Plasma extrahiert werden, um eine höhere DNA-Ausbeute zu erzielen. Bei pädiatrischen Patienten ist es jedoch wichtig, die Menge des verwendeten Blutes zu minimieren, wann immer dies möglich ist, da selbst ein einfaches Verfahren wie die Blutentnahme für pädiatrische Patienten mit Krebs, die sich einer Strahlentherapie unterziehen, ermüdet. Die Extraktion aus 1 ml Aliquots Plasma ermöglicht auch Replizierungen, so dass der Assay wiederholt werden kann (z. B. bei Versagen bei der DNA-Extraktion oder Probenkontamination).
Um die nicht unbedingt erforderliche Verwendung von Proben zu reduzieren, wird cfDNA in der Regel nicht quantifiziert. Wir haben jedoch einen Bereich von cfDNA-Konzentrationen zwischen 0,2-2 ng/l bzw. 0,6-13 ng/l im Plasma bzw. CSF gefunden. Angesichts der geringen Menge an cfDNA und der Tatsache, dass tumorspezifische mutierte Allele in geringer Häufigkeit vorhanden sind, ist ein Vorverstärkungsschritt mit den gleichen Primern, die für dPCR verwendet werden, erforderlich, um die Menge der Ziel-DNA in der Probe signifikant zu erhöhen, Mutationserkennung8. Die Verdünnung des vorverstärkten Produkts im DNA-Suspensionspuffer bietet ausreichend Volumen für technische Replikationen, was bei der Unterscheidung wahrer Positivwerte hilft. Da die Anzahl der mutierten Tröpfchen gering sein kann (z. B. zwischen 0-2 mutierten Tröpfchen in einer Plasmaprobe), ist die Einbeziehung technischer Replikationen der Schlüssel zur Lösung des Mutationsstatus. Während eine PCR-Bohrung 0 mutierte Tröpfchen ergeben kann, können die anderen beiden 1-2 für eine einzelne Plasmaprobe ergeben, die in Dreifacher Richtung analysiert wird; Daher ermöglicht die Einbeziehung von Replikationen eine höhere Genauigkeit bei der Bestimmung des Mutationsstatus. Der MAF wird dann als Durchschnitt der Replikationswerte berechnet.
Multiplexierte Vorverstärkung (vorverstärkender Wildtyp und mutierte Allelen zweier Mutationen von Interesse) erhöht den Nutzen einer einzelnen Probe, da das gleiche Ausgangsmaterial verwendet werden kann, um auf zwei Mutationen zu testen. Wichtig ist, dass ein Multiplex-Vorverstärkerprodukt während dPCR in Singleplex analysiert werden kann, um die Einfachheit zu erhöhen, wie hier beschrieben. Sowohl Die Vorverstärkungs-PCR als auch dPCR können jedoch multiplexiert sein. Beim Multiplexieren müssen die Bedingungen sowohl für Primer- als auch für Sonden optimiert werden: Die Glühtemperaturen müssen ähnlich sein, um in der PCR-Verstärkung zusammen zu laufen, und Sonden sollten so konzipiert sein, dass sie unterschiedliche Cluster erzeugen (basierend auf Fluoreszenzsignal und Intensität). Führen Sie bei der Validierung eines neuen Satzes von Primern und Sonden einen Glühtemperaturgradienten aus, um die optimale Glühtemperatur basierend auf dem vom Hersteller vorgeschlagenen Bereich zu bestimmen. Vor der Prüfung von Sonden an patienten cfDNA-Proben validieren Sie sie mit synthetischen DNA-Konstrukten und/oder Tumorgewebe-gDNA verschiedener Eingänge (d. h. bis zu 10 ng).
Für den Nachweis von mutierten Allelen mit größerer Spezifität und reduzierter Diskrepanz bei der Hybridisierung der Sonde zur Ziel-DNA werden gesperrte Nukleinsäures (LNA)-Sonden verwendet. LNA ist ein Nukleinsäure-Analog mit einer Methylenbrücke, die den 2'-Sauerstoff und 4'-Kohlenstoff des Riboserings9verbindet. Die Methylenbrücke sperrt die Nukleinsäure in eine starre bizyklische Konformation, die die Flexibilität einschränkt, die thermische Duplexstabilität erhöht und die Spezifität der Sondenhybridisierung auf die Ziel-DNA10,18 , verbessert. 19. Wenn eine einzige Basisübereinstimmung zwischen LNA-Sonde und Vorlagen-DNA besteht, destabilisiert sich die Duplexbildung zwischen Sonde und Ziel. Als solche verbessern LNA-Sonden die Spezifität der Sondenbindung und führen zu einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis11. Die Analyse von Plasma und CSF von nicht-CNS-kranken pädiatrischen Patienten hat die Spezifität unseres Tests mit LNA-Sonden auf H3F3A p.K27M festgestellt, um festzustellen, dass eine allelische Häufigkeit von etwa 0,001% als falsch positiv angesehen wird. 8. Weitere Überlegungen zur Optimierung des Designs von Sonden und Primern, einschließlich GC-Gehalt, Amplicongröße, Sondenreporterfarbstoffen und Quenchern, finden Sie in den dPCR-Herstellerrichtlinien14,17. Obwohl unsere Methode für die Verwendung mit dem RainDance-System optimiert ist, kann das Protokoll für die Verwendung mit anderen dPCR-Plattformen angepasst werden.
Die hier vorgestellte Methode schöpft Kraft aus der hohen Empfindlichkeit und Zielanreicherung durch dPCR, die nach wie vor die Plattform der Wahl für den Nachweis seltener Tumormutationen in cfDNA ist. Obwohl leistungsstark, ist dPCR in der Anzahl der Mutationen begrenzt, auf die in einem einzigen Test getestet werden kann. Eine Alternative zu dPCR ist die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS), die mehrere Mutationen über viele Gene erkennen kann, was den Nutzen einer einzelnen Probe erhöht. NGS kann Mutationen in CSF und Plasma von Patienten mit Hirnstammgliomen20erkennen, ist jedoch derzeit weniger empfindlich als dPCR bei der Erkennung von Tumormutationen in cfDNA, mit Nachweisgrenzen von 0,1-10% MAF im Vergleich zu 0,001% bei PCR-basierten Ansätzen21 . dPCR erreicht außerdem eine schnellere Durchlaufzeit als NGS, was eine schnelle Erkennung von Interessensmutationen ermöglicht. Der PCR-Ansatz ist bei Krebsarten anwendbar und kann erweitert werden, um Hotspot-Mutationen und methylierte cfDNA22zu erkennen.
Die flüssige Biopsie steckt in der Tat noch in den Kinderschuhen und wird eine Weiterentwicklung für die Anpassung an bestimmte Krankheiten erfordern. Die Tumorüberwachung im Kontext der Tumorentwicklung wird die nächste Herausforderung sein, bei der eine Plattform erforderlich wäre, die in der Lage ist, neu auftretende Mutationen mit hoher Empfindlichkeit zu erkennen. Darüber hinaus werden Plattformen, die in der Lage sind, eine Vielzahl von Biomolekülen (Peptide, Zytokine, RNA) zu detektieren, bei der Beurteilung der Tumorreaktion auf die Behandlung sowie bei der Weiterentwicklung personalisierter klinischer Interventionen von großem Nutzen sein.

Aufgrund der eingeschränkten Verfügbarkeit von Tumorgewebe für molekulare Analysen ist die Entwicklung hochsensibler Methoden erforderlich, die tumorsomatische Mutationen in Biofluiden des Patienten, einschließlich Plasma, Serum und Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), erkennen können. . Beispielsweise stellen pädiatrische diffuse Mittelliniengliome (DMGs) aufgrund ihrer neuroanatomischen Lage eine Herausforderung dar. In den letzten zehn Jahren hat die molekulare Profilierung von DMG-Gewebeproben Treibermutationen in diesem Tumortyp1 aufgedeckt und räumliche und zeitliche Heterogenität von Mutationen aufgedeckt, was eine Biopsie für die Charakterisierung eines Patienten innerhalb einer Krankheit notwendig macht. Untergruppe und Förderung molekulargezielter Therapien2. Als solche, klinische Studien befürworten die Integration von chirurgischen Biopsien für Tumor molekulare Profilierung bei der Vorabdiagnose3,4,5,6. Während der Behandlung beschränkt sich die Überwachung der therapeutischen Reaktion in DMGs auf MRT, die keine Empfindlichkeit hat, um kleine Veränderungen oder Tumorgenomentwicklung zu erkennen. MRT ist auch anfällig für Pseudoprogression zu erkennen, vorübergehende Entzündung an der Stelle des Tumors, die wahre Progression auf Bildgebung imitiert und kann die Interpretation der Tumorreaktion falsch informieren7. So stellen DMGs einen Tumortyp dar, der einen hohen Bedarf an einem alternativen, minimalinvasiven Mittel zur Erkennung von Tumormutationen und zur Überwachung des klinischen Ansprechens hat. Um diesen Bedürfnissen gerecht zu werden, haben wir ein Protokoll zur Erkennung und Quantifizierung der allelischen Häufigkeit von Tumormutationen in cfDNA aus Plasma, Serum und CSF von Kindern mit Mittelliniengliomen entwickelt und optimiert8. Angesichts der Tatsache, dass DMGs im Kindesalter oft (>80%) eine somatische Lysin-Methionin-Mutation an Position 27 der Histonvariante H3.1 (H3.1K27M, 20% der Fälle) oder H3.3 (H3.3K27M, 60% der Fälle) 1 , diese und andere Mutationen, die für DMGs charakteristisch sind (d. h. ACVR1, PIK3R1) Mutant-Allel-Quantifizierung mit cfDNA8. Dieser Test kann angepasst werden, um Hotspot-Mutationen in anderen Tumortypen mit sequenzspezifischen Primern und Sonden zu erkennen. Die Vielseitigkeit dieses Ansatzes macht ihn für eine Vielzahl von Krebsarten anwendbar, die von der Integration von cfDNA-basierten diagnostischen Instrumenten und der therapeutischen Überwachung profitieren würden.
Um niedriggeschlechtliche Frequenzmutationen in cfDNA sensibel zu erkennen, verwenden wir einen Droplet Digital PCR (dPCR)-basierten Ansatz. Bei dieser Methode wird das PCR-Reaktionsgemisch mit Hilfe der dPCR-Plattform (z.B. RainDance) in ein theoretisches Maximum von 10 Millionen Tröpfchen unterteilt, wobei 7-9 Millionen Tröpfchen pro PCR in der Regel experimentell gesehen werden. Aufgrund des hohen Grades an Probenteilung können höchstens ein bis zwei DNA-Moleküle in jedem Tröpfchen vorhanden sein. PCR-Verstärkung und sequenzspezifische Fluoreszenz-Sondenhybridisierung kann in jedem Tröpfchen auftreten, so dass Millionen von Reaktionen stattfinden. Dies maximiert die Empfindlichkeit und ermöglicht den Nachweis seltener mutierter Allele, die sonst vor dem Hintergrund der Wildtyp-DNA unentdeckt bleiben könnten. Die Verwendung von lKLEINsäure(LNA)-Sonden verbessert die Spezifität des Tests, indem die Mischübereinstimmungshybridisierung eingeschränkt undeinegenaue Mutationserkennung 9,10,11unterstützt wird. Hier beschreiben wir unsere Methoden der Probenverarbeitung, cfDNA-Extraktion, Vorverstärkung von Zielallele, dPCR und Datenanalyse.

<table><tbody><tr><td>10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA DNA Suspension Puffer (pH 8,0)</td><td>Teknova</td><td>T0227</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer K2-EDTA 7,2 mg Blutentnahmeröhrchen (10 mL)</td><td>Becton Dickinson Diagnostics</td><td>367525</td><td>Für die Plasmaentnahme</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Kunststoff-Serumröhrchen mit rotem BD Hemogard-Verschluss (10 mL)</td><td>Becton Dickinson Diagnostics</td><td>367895</td><td>Für die Serumentnahme</td></tr><tr><td>Bleiche</td><td>Allgemein Laborlieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer ATL</td><td>Qiagen</td><td>19076</td><td></td></tr><tr><td>Zellfreie DNA-Blutentnahmeröhrchen</td><td>Streck</td><td>218961</td><td>cfDNA-Blutentnahmeröhrchen (optional)</td></tr><tr><td>CentriVap Konzentrator</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Kundenspezifisches Design</td></tr><tr><td>MiniAmp Thermocycler</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>Molekularbiologie Grade Absolutes Ethanol (200 proof)</td><td>Allgemeiner Laborlieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mutant Sonde</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Kundenspezifisches Design</td></tr><tr><td>PAXgene Blood ccfDNA-Röhrchen</td><td>PreAnalytiX</td><td>768115</td><td>cfDNA-Blutentnahmeröhrchen (optional)</td></tr><tr><td>PCR 8-Well-Streifenröhrchenkappen</td><td>VWR</td><td>10011-786</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8-Well-Streifenröhrchen</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (p20, p200, p1000)</td><td>Allgemeiner Laborlieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenfilterspitzen (p20, p200, p1000)</td><td>General Lab Supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>M0494S</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>cfDNA-Extraktionskit Handbuch (Ausgabe 2013)</td></tr><tr><td>QIAamp Zirkulierendes Nukleinsäure-Kit</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>cfDNA-Extraktionskit (Protokollschritt 4)&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td>Optionales Kit für die DNA-Extraktion aus kleinen (< oder =200 &micro; L) Probenvolumina</td></tr><tr><td>Qiavac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>Zur Verwendung mit dem QIAamp Kit für zirkulierende Nukleinsäuren</td></tr><tr><td>Raindance Verbrauchsmaterial-Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>20-04411</td><td>Enthält tröpfchenerzeugende Instrumentenchips, Quantifizierungsinstrumentenchips, PCR-Streifenkappen einschließlich Hochgeschwindigkeitsverschlüssen und Tröpfchenstabilisierungsöl</td></tr><tr><td>Raindance Sense Instrument</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Quantifizierungsinstrument (verwendet in Protokoll Schritt 9)</td></tr><tr><td>Raindance Source Instrument</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Tröpfchen erzeugendes Instrument (verwendet in Protokoll Schritt 9)</td></tr><tr><td>RainDrop Analyst II Software</td><td>RainDance Technologies</td><td></td><td>Analyst Software für die Datenanalyse (Protokoll Schritt 10)</td></tr><tr><td>Gekühlte Dampffalle</td><td>Savant</td><td>RVT5105-115</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>Smartblock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>05 412 506</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Genotyping Master Mix</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4371353</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>14 285 562PM</td><td></td></tr><tr><td>WT Sonde</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Kundenspezifisches Design</td></tr></tbody></table>

nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender dna in biofluiden von patienten

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Komplikationen im Zusammenhang mit vorder- und wiederholter chirurgischer Gewebeentnahme stellen die Notwendigkeit minimalinvasiver Plattformen dar, die in der Lage sind, molekulare Subklassifizierung und zeitliche Überwachung der Tumorreaktion auf die Therapie durchzuführen. Hier beschreiben wir unsere dPCR-basierte Methode zum Nachweis tumorsomatischer Mutationen in zellfreier DNA (cfDNA), die in Patientenbiofluiden leicht verfügbar ist. Obwohl die Anzahl der Mutationen, die in jedem Test getestet werden können, begrenzt ist, bietet diese Methode ein hohes Maß an Empfindlichkeit und Spezifität. Die Überwachung des Mutationsreichtums, wie von MAF berechnet, ermöglicht die Bewertung der Tumorreaktion auf die Therapie und stellt damit eine dringend benötigte Ergänzung zur Röntgenbildgebung bereit.

Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse für den erfolgreichen Nachweis der H3F3A p.K27M-Mutation im vorverstärkten Plasma (oben links) und CSF (obere rechte Gruppe) cfDNA von zwei Kindern mit DMG. cfDNA-Proben wurden in der Replikation analysiert, aber für jeden Stichprobentyp wird nur ein repräsentatives Diagramm angezeigt. Die dPCR-Plots zeigen eine erfolgreiche Tröpfchenerzeugung mit 7-9 Millionen Tröpfchen pro PCR-Brunnen (die meisten davon sind negative Tröpfchen, die keine Ziel-DNA enthalten). Mindestens 7 Millionen Tröpfchen pro PCR-Brunnen deuten auf eine erfolgreiche Tröpfchen-Tröpfung hin, während weniger als 7 Millionen auf einen Fehler des Testes hinweisen, in diesem Fall sollte der Benutzer keine Datenanalyse durchführen. Abbildung 1 zeigt eine klare Trennung zwischen mutierten und Wildtyp-Clustern entlang der x- bzw. y-Achsen. Robuste Wildtypcluster weisen darauf hin, dass die cfDNA-Extraktion erfolgreich war, da Vorlagen-DNA vorhanden ist. Mutante Cluster zeigen einen MAF von 1,60% bzw. 39,92% für die Plasma- und CSF-Proben, was einen positiven Nachweis der Mutation zeigt. Für diese Patienten entsprechen die dPCR-Ergebnisse dem Tumormutationsstatus, wie durch genomische Analyse des Biopsietumorgewebesbestätigt wird 8. Die Negativkontrolle (untere linke Seite) zeigt 0 mutierte und 0 Wildtyptröpfchen, was darauf hinweist, dass es keine Kontamination des PCR-Reaktionsgemisches gab. Das positive Kontrolltumorgewebe gDNA (unteres rechtes Panel) zeigt die Mutation, die bei der erwarteten Allelic-Frequenz für die ausgewählte Tumorprobe nachgewiesen wird.
In Abbildung 2werden repräsentative Ergebnisse für den erfolglosen Nachweis der Mutation des Interesses, H3F3A p.K27M, in Plasma-cfDNA von einem Kind mit DMG gezeigt. Der Mutationsstatus wurde durch die genomische Analyse von Tumorgewebebestätigt 8. Repräsentative Ergebnisse aus zwei replizierten PCR-Bohrungen werden angezeigt (obere Panels). Die Gesamtzahl der Tröpfchen, einschließlich negativer Tröpfchen, liegt zwischen 7-9 Millionen pro PCR-Gut, was auf eine erfolgreiche Tröpfchen-Tätung hindeutet. Die Wildtyp-Cluster, die entlang der y-Achse geplottet werden, zeigen etwa 7-8.000 Wildtyptröpfchen pro PCR-Gut für das Plasma cfDNA, was auf eine erfolgreiche cfDNA-Extraktion hindeutet (da es Ziel-Wildtyp-DNA in der Probe gibt). In der Plasmaprobe werden jedoch 0 mutierte Tröpfchen nachgewiesen. Das untere linke Bedienfeld zeigt negative Kontrolle (MB H2O) ohne Wildtyp oder mutierte Tröpfchen; und das untere rechte Panel zeigt die positive Kontrolle vorverstärkter Tumorgewebe gDNA (0,025 ng) mit positiver Mutationsdetektion. Wie in dieser Abbildung dargestellt, kann das Fehlen von Mutationsnachweis im Plasma nicht notwendigerweise bedeuten, dass der Patient Wildtyp für die Mutation des Interesses ist, da falsche Negative auftreten8. In einigen Fällen, wenn die Mutation im Plasma fehlt, das bei der Vorabbiopsie gesammelt wurde, wird sie im Plasma nachgewiesen, das von demselben Patienten zu einem späteren Zeitpunkt8erhalten wurde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59721/59721fig1v2.jpg"> Abbildung 1 : Erfolgreiche Erkennung von H3F3A p.K27M-Mutation in vorverstärktem Plasma und CSF cfDNA bei Kindern mit Mittelliniengliomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59721/59721fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59721/59721fig2.jpg"> Abbildung 2 : Falsche negative Ergebnisse aus der Analyse einer vorverstärkten Plasma-cfDNA-Probe eines Patienten, von dem bekannt ist, dass er die Mutation des Interesses birgt, H3F3A p.K27M, im Tumor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59721/59721fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Dieses Protokoll ermöglicht den Nachweis von tumorassoziierten Mutationen und ergänzt derzeit invasive chirurgische Eingriffe. Eine weitere Stärke ist die Fähigkeit, dieses Protokoll zu verwenden, um Die Tudenmutationslast überstunden zu überwachen. Die Technik ermöglicht die Tumorgenotypisierung ohne tatsächliche chirurgische Gewebebiopsie, die besonders für Tumoren an anspruchsvollen Orten wie dem Hirnstamm mit eingeschränktem Gewebezugang hilfreich ist.In Ermangelung einer wiederholten Biopsie stehen längsmolekulare Daten nicht zur Verfügung, um die MRT zu ergänzen. Die digitale PCR-Überwachung erleichtert eine molekulare Ergänzung zur Diagnose und ermöglicht so einen fundierteren Prozess der Behandlungsfindung. Ähnliche Methoden können verwendet werden, um die Expression von Genen in bestimmten System zu erkennen, mit herkömmlichen Fluo-4 und Quencher-verknüpften Sonden, aber mit einer höheren Empfindlichkeit als mit der quantitativen PCR.Vor Beginn des digitalen PcR-Verfahrens des Tröpfchens den Platz und die Ausrüstung der Bank mit 10% Bleichmittel und 70% Ethanol reinigen und sanft wirbeln und kurz alle Reagenzien zentrieren, mit Ausnahme des Tröpfchenstabilisierungsöls. Vergewissern Sie sich, dass die komprimierte Stickstoffgasflasche am Tröpfchenerzeugungsgerät befestigt ist und dass der Zylindertank auf 90 Pfund pro Quadratzoll eingestellt ist. Und 38 Mikroliter digitale PCR-Reaktionsmischung direkt in den Boden jedes Brunnens eines acht Well PCR Rohrstreifens, entfernen alle Blasen mit einer sauberen Pipettenspitze.Fügen Sie 12 Mikroliter vorverstärkter DNA-Probe in Dreifache zu den entsprechenden Brunnen des Rohrstreifens hinzu. Das volle Volumen 10 Mal vorsichtig pipette, um die Reaktionsmischung mit der DNA-Probe zu mischen und das volle Volumen von jedem Bohrplatz in die entsprechenden A-Kanäle eines Tröpfchen-Erzeugungs-Instrumentenchips zu pipette. Setzen Sie einen neuen PCR-Rohrstreifen in das Tröpfchen-Erzeugungsgerät ein und scannen Sie die Tröpfchen-Generierungs-Instrumentenchip-ID in die Software auf dem Instrumentencomputer.Klicken Sie dann auf Ausführen starten, um mit dem Dropletisieren von Beispielen zu beginnen. Wenn die Tröpfung abgeschlossen ist, entfernen Sie den PCR-Rohrstreifen und tragen Sie Rohrstreifenkappen auf. Übertragen Sie den Rohrstreifen auf einen thermischen Cycler und balancieren Sie das Rohr mit einem anderen Rohrstreifen, der 80 Mikroliter Wasser pro Brunnen enthält.Führen Sie dann den Thermischen Cycler unter den entsprechenden thermischen Radfahrbedingungen. Ersetzen Sie die Streifenkappen durch Hochgeschwindigkeitskappen. Wenn der thermische Zyklus abgeschlossen ist, übertragen Sie den Rohrstreifen auf das Quantifizierungsinstrument, klicken Sie auf Ausführen auf der Instrumentensoftware und legen Sie den Rohrstreifen in das Quantifizierungsinstrument.Legen Sie die Metallabschirmung auf einen neuen Quantifizierungsinstrumentenchip, scannen Sie die Chip-ID in das Instrument und legen Sie den Chip in die Maschine ein. Schließen Sie den Deckel des Instruments. Geben Sie in der Computersoftware einen Namen für die digitale PCR-Ausführung und für jeden der acht Kanäle ein, wählen Sie dann Den schnellen Modus aus und klicken Sie auf Start, um mit der Quantifizierung zu beginnen.Um die rohen Spektraldaten zu analysieren, starten Sie die Analystensoftware und öffnen Sie die fcs-Dateien. Wählen Sie in der Analyseansicht "intakt" aus. Klicken Sie in der Beispielansicht auf die Kästchen neben jedem der acht Beispiele.Die Software wird die Signale für die mutierten und wilden Typ Allele entlang der x- bzw. y-Achse darstellen. Verwenden Sie die berechnete Matrixfunktion, um die Spektralkompensation auf die intakten Tröpfchen anzuwenden, wie es die Herstellerinstruktoren richten, und passen Sie die Achseneinstellungen unter Achsenoptionen an. Legen Sie die x-Achse auf ein Minimum von Null und maximal 30 000 und die y-Achse auf ein Minimum von minus 5 000 und maximal 10 000 fest.Wenn Tröpfchencluster identifiziert wurden, passen Sie die Achse an, um den leeren Platz im Diagramm zu reduzieren. Wählen Sie die Probe aus, die der genomischen DNA des Positivkontrolltumorgewebes entspricht, um die negativen mutierten und wilden Typstore zu setzen, um sicherzustellen, dass die Cluster unterschiedlich und leicht zu identifizieren sind. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Alle Einstellungen auf ausgewählte Samples anwenden aus, um die Gate-Einstellungen für das Positivsteuerelement auf alle Samples anzuwenden.Klicken Sie in der grafischen Ansicht auf mehrere Beispiele, um die Diagramme für alle ausgewählten Beispiele anzuzeigen und das Bild als TIF-Datei zu exportieren. Wählen Sie dann unter Arbeitsbereich die Option Analyse exportieren aus, und speichern Sie die analysierte Datendatei als csv-Datei. Hier werden repräsentative Ergebnisse für den erfolgreichen Nachweis einer Mutation in einem vorverstärkten Plasma und zerebrospinaler Flüssigkeitszellfreie DNA von zwei Kindern mit diffusen Mittelliniengliomen gezeigt.In diesem Experiment kann eine klare Trennung zwischen den mutierten und wilden Typclustern entlang der x- bzw. y-Achse beobachtet werden. Robuste Wildtyp-Cluster deuten darauf hin, dass die zellfreie DNA-Extraktion erfolgreich war, da Vorlagen-DNA vorhanden ist. Bei diesen Patienten weisen die mutierten Cluster eine Mutations-Allelhäufigkeit von 1,6 bzw. 39,32 Prozent für die Plasma- und Zerebrospinalflüssigkeitsproben bzw. entsprechend dem Tumormutationsstatus auf, wie durch genomische Analyse des biopsied Tumorgewebes bestätigt.Die Negativkontrolle hingegen zeigt null mutierte und null Wild-Typ-Tröpfchen, die darauf hinweisen, dass es keine Kontamination des PCR-Reaktionsgemisches gab. Die positive Kontrolltumorgewebe genomische DNA zeigt die Mutation, die bei der erwarteten Allelic-Frequenz für die ausgewählte Tumorprobe nachgewiesen wird. Das Fehlen einer Mutationsdetektion im Plasma kann nicht notwendig sein, dass ein Patient wildtyp für die Mutation des Interesses ist, da falsche Negative auftreten.Zum Beispiel wurde bei diesem Patienten, obwohl die Mutation von Interesse nicht erkannt wurde, der Mutationsstatus durch genomische Analyse des Tumorgewebes bestätigt. Die PCR ist eine sehr empfindliche Technik, die eine häufige Dekontamination des Arbeitsbereichs und der Ausrüstung erfordert, um die Erfassung falsch positiver Daten zu vermeiden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

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Automatische Trennung und Sammlung von krebsrelevanten Substanzen aus klinischen Proben

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Mikrofluidik-basierte Hochdurchsatz-Sortierung von zirkulierenden Tumorzellen und Einzelzellsequenzierungstechnologie

Lernen Sie die Droplet-digital-PCR zur sensitiven Detektion von Tumormutationen in Patienten-Biofluiden. Diese Methode ermöglicht eine nicht-invasive Überwachung des Mutationsstatus und ergänzt bildgebende Verfahren bei schwer zugänglichen Tumoren.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

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