Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Dieses Protokoll ermöglicht den Nachweis von tumorassoziierten Mutationen und ergänzt derzeit invasive chirurgische Eingriffe. Eine weitere Stärke ist die Fähigkeit, dieses Protokoll zu verwenden, um Die Tudenmutationslast überstunden zu überwachen. Die Technik ermöglicht die Tumorgenotypisierung ohne tatsächliche chirurgische Gewebebiopsie, die besonders für Tumoren an anspruchsvollen Orten wie dem Hirnstamm mit eingeschränktem Gewebezugang hilfreich ist.

In Ermangelung einer wiederholten Biopsie stehen längsmolekulare Daten nicht zur Verfügung, um die MRT zu ergänzen. Die digitale PCR-Überwachung erleichtert eine molekulare Ergänzung zur Diagnose und ermöglicht so einen fundierteren Prozess der Behandlungsfindung. Ähnliche Methoden können verwendet werden, um die Expression von Genen in bestimmten System zu erkennen, mit herkömmlichen Fluo-4 und Quencher-verknüpften Sonden, aber mit einer höheren Empfindlichkeit als mit der quantitativen PCR.

Vor Beginn des digitalen PcR-Verfahrens des Tröpfchens den Platz und die Ausrüstung der Bank mit 10% Bleichmittel und 70% Ethanol reinigen und sanft wirbeln und kurz alle Reagenzien zentrieren, mit Ausnahme des Tröpfchenstabilisierungsöls. Vergewissern Sie sich, dass die komprimierte Stickstoffgasflasche am Tröpfchenerzeugungsgerät befestigt ist und dass der Zylindertank auf 90 Pfund pro Quadratzoll eingestellt ist. Und 38 Mikroliter digitale PCR-Reaktionsmischung direkt in den Boden jedes Brunnens eines acht Well PCR Rohrstreifens, entfernen alle Blasen mit einer sauberen Pipettenspitze.

Fügen Sie 12 Mikroliter vorverstärkter DNA-Probe in Dreifache zu den entsprechenden Brunnen des Rohrstreifens hinzu. Das volle Volumen 10 Mal vorsichtig pipette, um die Reaktionsmischung mit der DNA-Probe zu mischen und das volle Volumen von jedem Bohrplatz in die entsprechenden A-Kanäle eines Tröpfchen-Erzeugungs-Instrumentenchips zu pipette. Setzen Sie einen neuen PCR-Rohrstreifen in das Tröpfchen-Erzeugungsgerät ein und scannen Sie die Tröpfchen-Generierungs-Instrumentenchip-ID in die Software auf dem Instrumentencomputer.

Klicken Sie dann auf Ausführen starten, um mit dem Dropletisieren von Beispielen zu beginnen. Wenn die Tröpfung abgeschlossen ist, entfernen Sie den PCR-Rohrstreifen und tragen Sie Rohrstreifenkappen auf. Übertragen Sie den Rohrstreifen auf einen thermischen Cycler und balancieren Sie das Rohr mit einem anderen Rohrstreifen, der 80 Mikroliter Wasser pro Brunnen enthält.

Führen Sie dann den Thermischen Cycler unter den entsprechenden thermischen Radfahrbedingungen. Ersetzen Sie die Streifenkappen durch Hochgeschwindigkeitskappen. Wenn der thermische Zyklus abgeschlossen ist, übertragen Sie den Rohrstreifen auf das Quantifizierungsinstrument, klicken Sie auf Ausführen auf der Instrumentensoftware und legen Sie den Rohrstreifen in das Quantifizierungsinstrument.

Legen Sie die Metallabschirmung auf einen neuen Quantifizierungsinstrumentenchip, scannen Sie die Chip-ID in das Instrument und legen Sie den Chip in die Maschine ein. Schließen Sie den Deckel des Instruments. Geben Sie in der Computersoftware einen Namen für die digitale PCR-Ausführung und für jeden der acht Kanäle ein, wählen Sie dann Den schnellen Modus aus und klicken Sie auf Start, um mit der Quantifizierung zu beginnen.

Um die rohen Spektraldaten zu analysieren, starten Sie die Analystensoftware und öffnen Sie die fcs-Dateien. Wählen Sie in der Analyseansicht "intakt" aus. Klicken Sie in der Beispielansicht auf die Kästchen neben jedem der acht Beispiele.

Die Software wird die Signale für die mutierten und wilden Typ Allele entlang der x- bzw. y-Achse darstellen. Verwenden Sie die berechnete Matrixfunktion, um die Spektralkompensation auf die intakten Tröpfchen anzuwenden, wie es die Herstellerinstruktoren richten, und passen Sie die Achseneinstellungen unter Achsenoptionen an. Legen Sie die x-Achse auf ein Minimum von Null und maximal 30 000 und die y-Achse auf ein Minimum von minus 5 000 und maximal 10 000 fest.

Wenn Tröpfchencluster identifiziert wurden, passen Sie die Achse an, um den leeren Platz im Diagramm zu reduzieren. Wählen Sie die Probe aus, die der genomischen DNA des Positivkontrolltumorgewebes entspricht, um die negativen mutierten und wilden Typstore zu setzen, um sicherzustellen, dass die Cluster unterschiedlich und leicht zu identifizieren sind. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Alle Einstellungen auf ausgewählte Samples anwenden aus, um die Gate-Einstellungen für das Positivsteuerelement auf alle Samples anzuwenden.

Klicken Sie in der grafischen Ansicht auf mehrere Beispiele, um die Diagramme für alle ausgewählten Beispiele anzuzeigen und das Bild als TIF-Datei zu exportieren. Wählen Sie dann unter Arbeitsbereich die Option Analyse exportieren aus, und speichern Sie die analysierte Datendatei als csv-Datei. Hier werden repräsentative Ergebnisse für den erfolgreichen Nachweis einer Mutation in einem vorverstärkten Plasma und zerebrospinaler Flüssigkeitszellfreie DNA von zwei Kindern mit diffusen Mittelliniengliomen gezeigt.

In diesem Experiment kann eine klare Trennung zwischen den mutierten und wilden Typclustern entlang der x- bzw. y-Achse beobachtet werden. Robuste Wildtyp-Cluster deuten darauf hin, dass die zellfreie DNA-Extraktion erfolgreich war, da Vorlagen-DNA vorhanden ist. Bei diesen Patienten weisen die mutierten Cluster eine Mutations-Allelhäufigkeit von 1,6 bzw. 39,32 Prozent für die Plasma- und Zerebrospinalflüssigkeitsproben bzw. entsprechend dem Tumormutationsstatus auf, wie durch genomische Analyse des biopsied Tumorgewebes bestätigt.

Die Negativkontrolle hingegen zeigt null mutierte und null Wild-Typ-Tröpfchen, die darauf hinweisen, dass es keine Kontamination des PCR-Reaktionsgemisches gab. Die positive Kontrolltumorgewebe genomische DNA zeigt die Mutation, die bei der erwarteten Allelic-Frequenz für die ausgewählte Tumorprobe nachgewiesen wird. Das Fehlen einer Mutationsdetektion im Plasma kann nicht notwendig sein, dass ein Patient wildtyp für die Mutation des Interesses ist, da falsche Negative auftreten.

Zum Beispiel wurde bei diesem Patienten, obwohl die Mutation von Interesse nicht erkannt wurde, der Mutationsstatus durch genomische Analyse des Tumorgewebes bestätigt. Die PCR ist eine sehr empfindliche Technik, die eine häufige Dekontamination des Arbeitsbereichs und der Ausrüstung erfordert, um die Erfassung falsch positiver Daten zu vermeiden.