Halbautomatische PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung zirkulierender Tumorzellen von nicht-kleinen Lungenkrebspatienten durch Immunfluoreszenz

Basierend auf mikrofluidischer Technologie erfordert die Isolierung und Charakterisierung von CTCs aus normalen Blutkörperchen nicht die Verwendung spezifischer CTC-Biomarker und ist mit der Zellkultur kompatibel. Dieses Protokoll erleichtert eine hohe Rate der CTC-Extraktion und bietet eine umfassende zytologische Analyse der CTCs, indem bösartige zytomorphologische Eigenschaften bewertet werden. Die PD-L1-Expression durch CTCs hat einen prädiktiven Wert im Lungenkrebsmanagement.

Eine Verbesserung der Erkennung durch diesen Test könnte langfristig ein besseres Patientenmanagement fördern. Weitere Anwendung dieses Protokolls sind der Nachweis genetischer Aberrationen mit FISH oder die Durchführung transkriptomischer Analysen an CTCs sowie die Isolierung von Zellen fetaler Herkunft bei Müttern. Die Vorführung des Verfahrens wird Julie Balandier, eine Technikerin aus unserem Labor, zeigen.

Zur präanalytischen zirkulierenden Tumorzellanreicherung sammeln Sie zunächst 7,5 Milliliter Blut in eine Kalium-EDTA-Röhre und halten die Probe unter sanfter Erregung, um Zellsedimentation und Gerinnung zu vermeiden. Verwenden Sie innerhalb von sechs Stunden nach der Entnahme eine serologische Pipette unter einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank, um bis zu 7,5 Milliliter Vollblut in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenrohr zu übertragen und die Probe 10 Minuten bei 1600-fachem G bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwenden Sie am Ende der Zentrifugation eine Transferpipette, um die Plasmafraktion zu sammeln, ohne das buffy-Coat zu stören, und verdünnen Sie das Plasma mit einem äquivalenten PBS-Volumen von bis zu 7,5 Millilitern.

Als nächstes fügen Sie der Blutprobe vorsichtig einen Roten Blutzelllysepuffer zu einem Endvolumen von 30 Millilitern hinzu und invertieren Sie das Blutentnahmeröhrchen dreimal vorsichtig, bevor Sie das Rohr 10 Minuten lang bei Raumtemperatur platzieren. Am Ende der Inkubation, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, und sorgfältig entfernen alle bis auf die letzten vier bis fünf Milliliter überstand. Verwenden Sie eine gefilterte Mikropipette, um den verbleibenden Überstand zu entfernen, und verwenden Sie eine P1000-Mikropipette mit einer gefilterten Spitze, um einen Milliliter Resuspensionspuffer an der Rohrwand hinzuzufügen.

Um Blasen nicht einzuführen, setzen Sie das Zellpellet mit sanfter Pipettierung wieder auf, bis die Probe homogen ist. Wenn das Pellet resuspendiert wurde, fügen Sie weitere drei Milliliter Resuspensionspuffer an die Wand des Rohres, ohne Blasen einzuführen, und mischen Sie die Zellen vorsichtig wieder. Für spiralmikrofluidische Geräte zirkulierende Tumorzellanreicherung, laden Sie zuerst einen neuen Spiral-Mikrofluid-Chip auf das Gerät, und laden Sie ein leeres 50 Milliliter Zentrifugenrohr in jeden der Ein- und Ausgangsanschlüsse.

Klicken Sie auf Prime, um das mikrofluidische Spiralgerät drei Minuten lang zu grunden. Entfernen der Eingangs- und Ausgangsrohre am Ende des Zyklus. Laden Sie die resuspendierte Blutprobe in den Eingangsanschluss, und laden Sie ein klares 15 Milliliter konisches Rohr in den Ausgangsanschluss.

Klicken Sie dann auf Ausführen, und wählen Sie Programm drei aus, um das 31-minütige anreichernde Tumorzellanreicherungsprogramm zu initiieren. Am Ende des Zyklus übertragen Sie das Ausgangsrohr auf die Zentrifuge, und verwenden Sie eine fünf Milliliter serologische Pipette, um alle bis auf die letzten zwei Milliliter des Überstandes zu entfernen. Dann verwenden Sie eine Mikropipette, um alle außer den letzten 100 Mikroliter überstand zu entfernen.

Bei Immunfluoreszenzfärbung die Zellen in einem Hämozytometer zählen und die angereicherte Probe auf eine einmal zehn bis fünfte Zelle pro 100 Mikroliter mit einer Anti-Bindungslösungskonzentration verdünnen. Als nächstes verwenden Sie einen wattestäblichen Tupfer, der mit 50 Mikrolitern Anti-Bindungslösung getränkt ist, um die Kontur der Probenkammer zu befeuchten, und legen Sie eine Polylysinglasrutsche in die Probenkammer. Schließen Sie die Kammer und pipette dreimal nach oben und unten, um eine Mikropipettespitze mit der Bindungslösung zu beschichten, bevor sie die Probe in den letzten 100 Mikrolitern des Überstandes wieder aufhält.

Übertragen Sie die Zelllösung in die Probenkammer und zytospinnen Sie die Probe in einer speziellen Zentrifuge mit 400 Umdrehungen pro Minute für vier Minuten bei geringer Beschleunigung. Am Ende der Zentrifugation einen Silikonisolator um den Abscheidungsbereich legen und das Dia zwei Minuten lang unter einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank trocknen lassen, dann die Zytospun-Probe mit 100 Mikrolitern 4%Paraformaldehyd 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren, gefolgt von drei zweiminütigen Wäschen mit 200 Mikroliterpbs pro Wäsche bei Raumtemperatur. Nach der letzten Wäsche jede unspezifische Bindung mit 30 Minuten Inkubation bei blockierendem Reagenz bei Raumtemperatur blockieren, gefolgt von der Etikettierung mit 100 Mikrolitern der antibiotigen Antikörperlösung.

Legen Sie die beschriftete Rutsche in eine 100 mal 15 Milliliter Petrischale auf ein Stück saugfähiges Papier mit zwei Milliliter nsterilem Wasser befeuchtet, und legen Sie die Schale geschlossen, bei vier Grad Celsius über Nacht, vor Licht geschützt. Am nächsten Morgen die Probe dreimal mit PBS waschen, wie gezeigt, und montieren Sie die Probe mit 10 Mikrolitern einer geeigneten Montagelösung und einem Glasdeckel. Dann versiegeln Sie den Deckelschlupf mit klarem Nagellack.

Um die zytospun Proben abzubilden, laden Sie den Schlitten auf ein gerades Fluoreszenzmikroskop mit einer motorisierten X Y-Plattform und wählen Sie ein 20-faches Objektiv und die entsprechenden Kanäle entsprechend den Fluorophoren aus, die für die Antikörperkennzeichnung verwendet werden. Schalten Sie die Quecksilberlampe ein und passen Sie das Mikroskop und die zugehörige Software an einen semi-automisierten Trieb an. Wenn die Lampe bereit ist, definieren Sie im Erfassungsmenü die vier Kanäle, legen Sie die Belichtungszeit fest und definieren Sie die zu scannenden Kacheln.

Klicken Sie auf Kacheln und erweiterte Experimente, und definieren Sie den zu scannenden Bereich. Passen Sie dann den Fokus auf dem Bildschirm an, und klicken Sie auf Experiment starten. Exportieren Sie am Ende des Experiments die TIF-Dateien für jeden Kanal, und benennen Sie die Datei speziell, um die Stichprobe, die Anzahl der Male, den Farbstoff und die Anzahl der Unterkacheln einzuschließen.

Für die Bildanalyse öffnen Sie die Bildanalysesoftware von der Broad Institute-Website, und klicken Sie auf Datei, Pipeline aus Datei und Analyse vier Kanäle CTC. Löschen Sie Dateien in die Dateiliste, und aktualisieren Sie die Metadaten, um die Dateien nach Kacheln zu gruppieren. Klicken Sie dann auf Bilder analysieren, um die Tabellenkalkulationsdatei zu öffnen, die den Messintensitätsparametern entspricht.

Ohne das optimierte Dekontaminationsprotokoll wird eine hohe bakterielle Kontamination in Gewebekulturen angereicherter A549-Zelllinien bereits nach 24 Stunden beobachtet, was zu Todesfällen und zytomorphologischen Veränderungen in den eukaryotischen Zellen führt. Im Gegensatz dazu werden nach dem Reinigungsprotokoll lebende A549-Zellen in 2D-Kulturen nach 10 Stunden Gewebekultur und mittlerer Entfernung, unter 3D-Kulturbedingungen und in Patientenproben gewonnen. Mit einem flüssigen immunfluoreszenten Färbungstest oder einem immunfluoreszenten Färbetest auf polylysinbeschichteten Dias mit Cytospin kann eine klare Unterscheidung in der Anzahl der zwischen den beiden Assays aufgezählten Kerne beobachtet werden.

Ohne den Cytospin-Schritt ist es aufgrund der verschwommenen Umrisse in den Nicht-Cytospin-Zellpräparaten schwierig, die weißen Blutkörperchen von den Tumorzellen zu unterscheiden. Hier können unterschiedliche repräsentative Befunde aus verschiedenen Patientenproben beobachtet werden, wobei insbesondere die Restzahl der weißen Blutkörperchen als stark variabel und abhängig von der Vollblutprobe bestimmt ist. Eine hohe Variabilität wurde auch in den zirkulierenden Tumorzellen Subpopulationen erhalten beobachtet.

Jede Zelle auf dem Cytospin wird von der Bildanalyse-Software identifiziert und ermöglicht die Verfolgung der Zelle und manuell, um die Ergebnisse bei Bedarf zu bestätigen. Tatsächlich ergab eine Pilotanalyse eine Übereinstimmung zwischen der manuellen Enumeration und der Aufzählung der Bildanalysesoftware. Der Aufbau der eigens entwickelten feuchten Petrischale für die Protein-Antikörper-Hybridisierung ist entscheidend, da das Gerät über die gesamte Inkubationszeit ausreichend feucht bleibt.