Die Einrichtung eines Lunge Kolonisation Assays für zirkulierenden Tumor Zelle Visualisierung im Lungengewebe

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Krebsmetastasierung über die Rolle der Lungenbesiedlung bei der Durchführung von Krebsmetastasen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass frühe extravasierte Krebszellen während der Krebsmetastasierung in der Lunge sichtbar gemacht werden können. Das Verfahren wird von Cheng-Han Yang, einem Doktoranden aus meinem Labor, vorgeführt.

Wenn die Tumorzellkultur eine Konfluenz von 70 bis 80 Prozent erreicht hat, waschen Sie die Kultur zweimal in zwei Millilitern sterilem PBS pro Waschgang und geben Sie einen Milliliter 0,5 % Trypsin-EDTA in die Kulturschale. Entfernen Sie sofort 800 Mikroliter des Überstands und stellen Sie die Kulturschale 30 bis 60 Sekunden lang bei 37 Grad Celsius auf, bis sich der Großteil der Zellen von der Platte gelöst hat. Fügen Sie einen Milliliter frisches Medium hinzu, das mit 10 % FBS ergänzt ist, um die Reaktion zu stoppen, und verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die Zelllösung kräftig zu mischen.

Die resultierende einzellige Suspension wird in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Suspendieren Sie dann das Tumorzellpellet erneut in 1,5 Millilitern Medium, das mit 20 % FBS versetzt ist, und drehen Sie die Zellen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation werden die lebensfähigen Zellen durch Trypanblau-Ausschluss gezählt und durch Zentrifugation gesammelt.

Das Pellet wird für eine zweite Zentrifugation in einem Milliliter sterilem PBS resuspendiert und das Pellet in 500 Mikrolitern PBS, ergänzt mit 10 % FBS und 20 Mikromilliliter CFSE, erneut suspendiert. Nach zehn Minuten bei 37 Grad Celsius im Dunkeln zentrifugieren Sie die Zellen und suspendieren das Pellet in vier Millilitern Medium, das mit einem Prozent FBS versetzt ist, für eine weitere Zentrifugation. Nach dem letzten Waschen werden die Zellen wieder auf fünf mal zehn bis sechs Tumorzellen pro Milliliter frischem Medium ohne FBS-Konzentration suspendiert und auf Eis gelegt.

Erwärmen Sie anschließend den Schwanz einer vier bis sechs Wochen alten männlichen C570 Black Six-Maus fünf bis zehn Minuten lang, um die Schwanzvenen zu erweitern, und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 26,5-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um die Zellen gründlich zu mischen, bis eine Einzelzellsuspension erreicht ist. Befüllen Sie die Spritze vorsichtig mit 200 Mikrolitern Zellen und legen Sie die Maus in einen Fixierbehälter. Injizieren Sie dann das gesamte Zellvolumen in das Lumen einer erweiterten Schwanzvene.

Nehmen Sie zum geeigneten Zeitpunkt nach der Injektion einen Längsschnitt an der Haut und an der Unterhaut vom Bauch bis zur Brust vor und öffnen Sie die Pleurahöhle, um Herz und Lunge freizulegen. Ligatieren Sie mit sterilen chirurgischen Nähten die obere und untere Hohlvene, um den Rückfluss der Profusionslösung zu verhindern, und verwenden Sie eine Schere, um eine zwei bis vier Millimeter große Fissur in den linken Ventrikel zu bohren, um das Abfließen des Perfusats aus der Lunge zu erleichtern. Verwenden Sie dann eine Drei-Milliliter-Spritze, um PBS in den rechten Ventrikel zu injizieren, und saugen Sie die abgelassene Lösung kontinuierlich an, bis sich die Lunge von einer rötlichen Farbe zu einer vollständig blassen Farbe ändert.

Achten Sie darauf, die obere und untere Hohlvene für eine erfolgreiche Lungendurchblutung richtig zu sichern. Legen Sie die Lungenlappen nach der Entnahme der Lunge in einen speziell angefertigten Lungenhalter in einer sechs Zentimeter großen Schale und befestigen Sie die Lunge auf der netzartigen Textur des Halters. Decken Sie die Lappen mit PBS ab, befeuchten Sie sie und stellen Sie die Kulturschale auf den Bildgebungstisch eines konfokalen Mikroskops.

Wählen Sie das 5-fach-Objektiv aus und drehen Sie das Filterrad auf NIBA. Mit einem 488-Nanometer-Laser wird die CFSE angeregt, um eine klare Visualisierung der fluoreszierend blau markierten Tumorzellen in den Lungenlappen zu ermöglichen. Drehen Sie das Filterrad auf R690, um mit einer Scangeschwindigkeit von zwei Mikrosekunden pro Pixel zu scannen und die Hochspannungsverstärkung und die Offset-Pegel zu optimieren.

Nehmen Sie dann fünf 12 x fünf 12-Pixel-Fluoreszenzbilder mit einer Scangeschwindigkeit von 10 Mikrosekunden pro Pixel auf. Mit der Färbemethode, wie sie gerade gezeigt wurde, werden die Tumorzellen dosisabhängig effektiv mit CFSE markiert. Mit der Fluoreszenzintensität der Markierung erreicht sie nahezu ein Plateau in sechsmal 10 bis fünf Lewis-Lungenkarzinomzellen pro Milliliter bei der 20 mikromolaren Konzentration.

Die Lungenperfusion vor der Entnahme, wie gerade gezeigt, befreit das Lungengefäßsystem von unspezifisch gehackten, zirkulierenden Tumorzellen vor der bildgebenden Analyse. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie zeigt das Vorhandensein der besiedelnden CFSE-markierten Tumorzellen in den entnommenen und perfundierten Lungenlappen. Die Verwendung einer geeigneten Bildanalysesoftware zur Umwandlung der Fluoreszenzbilder in Schwarzweiß erleichtert die Quantifizierung der Lungenbesiedlung.

Die intravenöse Verabreichung von Fibronektin-exprimierenden oder gerührten Fibronektin-exprimierenden Lewis-Lungenkarzinomzellen zeigt eine signifikant geringere Anzahl von Fibronektin-exprimierenden Zellen im Lungengewebe, die 38 und 45 Stunden nach der Injektion entnommen wurden, was die Rolle von Fibronektin bei der Besiedlung des Lungenlappens und der Tumorentwicklung unterstreicht. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Lunge sorgfältig zu durchbluten, damit die nicht anhaftenden Zellen weggespült werden können. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Krebsmetastasen, um die Lungenbesiedlung durch zirkulierende Tumorzellen in einem Null-Gramm-Modell der Maus zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Tumorzellsuspensionen fluoreszierend markiert, die Tumorzellen intravenös inokuliert, die Lungen von Mäusen durchblutet und die konfokale Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die metastasierten Tumorzellen abzubilden.