Vorbereitung und Charakterisierung von Nanoliposomen zur Entrapment ierung bioaktiver hydrophiler Globularproteine
31. August 2019
Diese Studie beschreibt die klassische Hydratation mit der Dünnschichtmethode zur Nanoliposomenpräparation, gefolgt von der Nanopartikelcharakterisierung. Ein 47 kDa-hydrophiles und kugelförmiges Protein, Tarin, wird erfolgreich als Strategie zur Verbesserung der Stabilität verkapselt, schnelle Clearance vermieden und eine kontrollierte Freisetzung gefördert. Die Methode kann an hydrophobe Moleküle angepasst werden.
Die Herstellung von liposomalen Nanokapseln durch eine Extrusionstechnik wird Schritt für Schritt in der Einschlussung von Tarin 48 Kilodaltons kugelig in hydrophilem Protein aus Kolokasien esculenta gereinigt durchgeführt werden. Alle Verfahren zur Charakterisierung der Nanokapseln umfassen die Rasterelektronenmikroskopie und die dynamische Lichtstreuung wird ebenfalls befolgt. Kapulationsverfahren können einige Herausforderungen von der Lipidwahl bis zur Erreichung einer hocheffizienten Verkapselung, die die Bio-Aktivität der eingeschlossenen Moleküle zu halten.
Das protokollarisch, das beschrieben wird, kann einige dieser Schwierigkeiten überwinden. Wiegen Sie die Liposomenkomponenten mit einem analytischen Gleichgewicht. Lösen Sie die Lipidkomponenten in Chloroform mit einem volumetrischen Kolben auf, der in einen Rotationsverdampfer passt, um Materialverlust zu vermeiden.
Die Mischung bei 150 Umdrehungen 15 Minuten rühren. Entfernen Sie das Chloroform mit einem Rotationsverdampfer. Stellen Sie den volumetrischen Kolbenmund auf die Standardposition für beste Effizienz ein, während Sie mit dem Wasser aus dem Heizbad in Kontakt stehen.
Legen Sie die Parameter gemäß dem beschriebenen Protokoll fest. Nach ca. 25 Minuten den Kolben entfernen und das verdampfte Lösungsmittel entsprechend entsorgen. Ein dünner und undurchsichtiger Film wird gebildet und kann leicht visualisiert werden.
Hydratisieren Sie den Lipidfilm in einer Ammoniumsulfatlösung, die Tarin mit einem Milligramm pro Milliliter enthält. Die Mischung 40 Minuten rühren und über Nacht bei vier Grad Celsius bebrüten. Dann beschallen Sie die Suspension für eine Minute bei 25 Grad Celsius, Raumtemperatur.
Um die Vesikelgröße zu reduzieren und eine Aggregation zu vermeiden, legen Sie die Polycarbonatmembran zwischen zwei vornassen Filterstützen und legen Sie sie in den Halter. Legen Sie eine leere Spritze in das Gerät ein, füllen Sie die andere mit einem Milliliter der liposomalen Suspension und legen Sie sie auf der gegenüberliegenden Seite ein. Führen Sie eine 12-Zyklus-Extrusion durch eine 2 Mikrometer Polykarbonat-Porenmembran durch.
Drücken Sie die Probe langsam von einer Spritze auf eine andere. Am Ende sollte die liposomale Suspension während des Exkursionsprozesses durch Größenreduktion deutlich werden. Etwa 2 Milliliter der Probe können in diesem Schritt verloren gehen.
Trennen Sie die Liposomen durch Ultrazentrifugation. Wiegen Sie zunächst die Probe in das Titanrohr und balancieren Sie die Rohre. Überprüfen Sie das zu befüllende Mindestvolumen, und passen Sie ggf. das Volumen mit Ammoniumsulfat an.
Die Titanrohre in den Schwenkeimer einbauen. Öffnen Sie die Zentrifugentür und platzieren Sie den Rotor darin. Schließen Sie die Zentrifugentür, drücken Sie Vakuum und warten Sie, bis das Vakuum zwischen 200 und weniger als 20 Mikrometern erreicht.
Passen Sie die Parameter in der Ultrazentrifugenanzeige an. Drücken Sie den Rückruf, überprüfen Sie die Bedingungen, und starten Sie den Lauf. Lassen Sie nach 90 Minuten das Vakuum los, indem Sie auf den Vakuumknopf klicken und die Zentrifugentür öffnen.
Entfernen Sie den Rotor von innen. Halten Sie die Ultrazentrifugenprobe auf Eis und trennen Sie dann den Überstand vom Pellet, indem Sie das Rohr auf den Kopf stellen, in eine Einwegzentrifuge von 59 mil, um den Überstand vom Pellet zu trennen. Bewahren Sie den Überstand, der das ungekapselte Protein enthält, bei vier Grad Celsius auf.
Dies wird verwendet, um die Verkapselungseffizienz zu bestimmen. Das Pellet wird als durchscheinendes Gelee präsentiert. Das Pellet aufhängen und HEPES gepufferte Saline-Lösung erhitzen.
Weitere Informationen finden Sie im Protokoll. Bestimmen Sie die Verkapselungseffizienz durch das Petersons Protokoll, um Lipidstörungen in der Proteinquantifizierung zu vermeiden. Die Proben sollten in dreifacher Ausfertigung analysiert werden.
In einem Mikrofugenrohr den lipsomalen Überstand oder BSA mit einem Milligramm pro Milliliter mit Wasser auf ein Endvolumen von einem Milliliter verdünnen. DOC hinzufügen und 10 Minuten inkubieren. 1 Milliliter 72%TCA hinzufügen und gut mischen.
Zentrifuge bei 3.000 g für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, indem Sie das Rohr nach unten abwenden, es auf ein saugfähiges Papier legen und trocknen lassen. Das Pellet in einem Milliliter Wasser aufhängen.
Mischen Sie gründlich, um sicherzustellen, dass das Pellet gelöst ist. Übertragen Sie dann die Probe in reageröhrte. Einen Milliliter Reagenz A hinzufügen, 10 Minuten bei Raumtemperatur mischen und inkubieren.
5 Milliliter Reagenz B hinzufügen, 30 Minuten bei Raumtemperatur mischen und inkubieren, vor Licht geschützt. Bestimmen Sie die Absorption bei 750 Nanometern und berechnen Sie die Verkapselungseffizienz. Der Größendurchschnitt und die Größenverteilung werden durch dynamische Lichtstreuung bestimmt.
Übertragen Sie die liposomalen Nanovesiken auf eine Einweg-Größenküvette. Passen Sie die Küvette in das Gerät ein. Stellen Sie die Geräteparameter ein.
Zur Stabilitätsbestimmung die Liposomen bei vier Grad Celsius lagern und die Größenverteilung und den Größendurchschnitt regelmäßig überprüfen. Die Liposomencharakterisierung durch Rasterelektronenmikroskop wird nach Murta und Ramasamy in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Befestigen Sie die Glasabdeckung sausen in der Unterseite einer Petrischale mit einem Klebeband.
Beschichten Sie die Deckelschlüpfer mit Poly-L-Lysin. Legen Sie ein nasses Filterpapier in die Petrischale, um Feuchtigkeit zu erhalten und eine Stunde lang zu brüten. Mit destilliertem Wasser abspülen.
Fügen Sie einen Tropfen der Probe hinzu und lassen Sie sie für eine Stunde bei Raumtemperatur trocknen. Um die Proben zu fixieren, bedecken Sie sie mit Glutaraldehyd, das im Phosphatpuffer hergestellt wird. Legen Sie nasse Filterpapiere in die Petrischale.
Es ist wichtig, die Petrischale zu versiegeln. 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius inkubieren. Spülen Sie die Abdeckung rutscht dreimal für jeweils fünf Minuten, mit dem gleichen Phosphatpuffer.
Dehydrieren Sie die Proben wie folgt, indem Sie in einer zunehmenden Ethanolkonzentrationslösung von 35% auf absolutes Ethanol waschen. Die Proben mit Hexamethyldisilazan 10 Minuten chemisch trocknen. Das Hexamethyldisilazan sollte sorgfältig in einer Dunstabzugshaube manipuliert werden.
Proben sollten über Nacht in einem Trockenschrank oder in der Dunstabzugshaube bei Raumtemperatur trocknen dürfen. Montieren Sie die getrockneten Proben auf einem Stub, mit einem kohlenstoffleitfähigen Klebeband. Sputter die Stubs mit Gold.
Nehmen Sie SEM-Bilder mit einem Rasterelektronenmikroskop, SEM, bei niedrigem Vakuummodus und Niederspannung, 20 Kilovolt auf. Abbildung eins beschreibt die Nano-Liposomen-Präparation. Phospholipide, Dope, Peg und Chems, die wichtigsten Liposomenbestandteile, wurden zuerst in Chloroform gelöst, um den Lipidfilm zu erhalten.
Der Lipidfilm wurde dann in einem Kochsalzlösungspuffer rehydriert, der das hydrophile Protein Tarin enthält, das eingeschlossen werden soll, und die Inkubation sollte über Nacht vorgeformt werden. Dann werden Beschallung und Extrusion angewendet, um kleine unilamellare Vesikel zu erzeugen. Der Ultrazentrifugationsschritt trennt die liposomale Zubereitung von freien Lipiden und unverkapseltem Protein.
Während der Überstand für die Bestimmung der Einschlusseffizienz verwendet wird. Nanoliposomen, die nach der oben genannten Methode hergestellt werden, weisen eine Größenverteilung von 51 bis 396 Nanometern und eine durchschnittliche Größe von 155 Nanometern auf. Die Zubereitung ist homogen, da der Polidispersitätsindex 168 beträgt.
Eine hohe Einschlusseffizienz von 83% wird erreicht, wenn die Liposomen durch eine 2 Mikrometer porengroße Membran extrudiert werden. Morphologische Nanolipominitika wurden durch Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Liposomen sollten schließlich ähnlich wie lebende Zellen behandelt werden, um qualitativ bessere Bilder zu erhalten.
Befestigungs- und Trocknungsverfahren sind wichtig, um die Visualisierung kleinerer intakter Vesikel zu gewährleisten, die über 20 Kilovolt unter Vakuumbedingungen unterstützen. Die Abbildungen 2A und 2B zeigen runde liposomale Vesikel im Bereich von 121 Nanometern, analysiert bei 20 Kilovolt. Während die Abbildungen 2C und 2D unzureichend vorbereitete Proben anzeigen.
Misshandelte Proben sind nur zur Beobachtung größerer oder oder beschädigter Vesikel zulässig, die Vakuum- und Spannungs- oder Spannungsbedingungen nicht widerstehen können. Das hier beschriebene Protokoll ermöglichte die Herstellung von reproduzierbaren Vesikeln mit einer runden Form, einer kleinen Oberfläche und einer durchschnittlichen Größe von etwa 150 Nanometern. Die Methode kann verwendet werden, um komplexe und große Moleküle einzufangen, als tetramerisches Protein, das einen hydrophilen Korrektor aufweist.
Die Mangelhafte Selbsteinschließung ist höher als 80% und die Leckrate ist sehr niedrig, unter 1,5%Wenn die Nanokapseln bei vier Grad Celsius gelagert werden. Wir hoffen, dass dieses Video Ihnen bei der Verkapselung großer Moleküle wie teri helfen würde.
Übersicht
Diese Studie demonstriert die Herstellung liposomaler Nanokapseln, die das hydrophile Protein Tarin mittels einer Dünnfilm-Lipid-Methode einschließen. Die Einschließung zielt darauf ab, die Stabilität zu verbessern, die Freisetzung zu kontrollieren und Herausforderungen bei der Erzielung einer hohen Einschließungseffizienz zu bewältigen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Nanotechnologie
- Biotechnologie
- Pharmazeutische Wissenschaften
Hintergrund
- Liposomale Nanokapseln werden für die Arzneimittelfreisetzung verwendet.
- Die Einschließung von Proteinen kann deren Stabilität und Bioverfügbarkeit verbessern.
- Herausforderungen umfassen die Auswahl der Lipide und die Aufrechterhaltung der Bioaktivität.
- Dynamische Lichtstreuung und Rasterelektronenmikroskopie sind zentrale Charakterisierungstechniken.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Einschließung von Tarin in liposomalen Nanokapseln.
- Verbesserung der Stabilität und kontrollierten Freisetzung hydrophiler Proteine.
- Bereitstellung eines Protokolls, das häufige Herausforderungen bei der Liposomenherstellung adressiert.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Liposomen mittels Extrusionstechnik.
- Charakterisierung durch dynamische Lichtstreuung und Rasterelektronenmikroskopie.
- Bestimmung der Einschlusswirkung nach Petersons Protokoll.
- Ultrazentrifugation zur Trennung von Liposomen und nicht eingekapselten Proteinen.
Hauptergebnisse
- Eine erfolgreiche Einschließung von Tarin wurde erreicht.
- Die Charakterisierung bestätigte Größe und Stabilität der Liposomen.
- Das Verfahren zeigte eine hohe Einschließungseffizienz.
- Herausforderungen bei der Auswahl der Lipide wurden wirksam bewältigt.
Schlussfolgerungen
- Die dünne Lipidfilm-Methode eignet sich zur Herstellung liposomaler Nanokapseln.
- Die Einschließung hydrophiler Proteine kann deren therapeutisches Potenzial erhöhen.
- Dieses Protokoll kann für andere hydrophobe Moleküle angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die Einschließung hydrophiler Proteine in Nanoliposomen löst zentrale Herausforderungen bei der Abgabe von Biopharmazeutika, einschließlich Stabilität, Bioverfügbarkeit und kontrollierter Freisetzung. Diese Methode unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien, indem sie eine reproduzierbare Formulierung komplexer Biomoleküle für funktionelle Assays ermöglicht. Die hohe Einschlussrate und die geringe Austrittsrate erhöhen die Vorhersagegenauigkeit in präklinischen Entwicklungsprozessen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Proteinfunktion in einer geschützten, biomimetischen Umgebung, um Zielmechanismen zu klären.
- Operationaler Wert: Stellt standardisierte Nanovesikel für konsistente Testbedingungen über verschiedene Entdeckungsteams hinweg bereit.
- Prädiktiver Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem die biologische Aktivität des Proteins während der Einschließung und Lagerung erhalten bleibt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt gleichmäßige, nanoskalige Vesikel (Durchmesser im Mittel 155 nm, PDI 0,168), die für Hochdurchsatz-Screening-Plattformen geeignet sind.
- Operativer Wert: Gewährleistet Reproduzierbarkeit durch Extrusion und Ultrazentrifugationsschritte, die die Variabilität zwischen Chargen minimieren.
- Eignung für Assays: Erleichtert die Herstellung stabiler Ligand-Rezeptor-Interaktionssysteme unter Verwendung eingekapselter globulärer Proteine.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Unterstützt den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem die strukturelle Integrität tetramerer Proteine erhalten bleibt.
- Risikominderung: Geringe Leckrate (<1,5 % bei 4 °C) ermöglicht zuverlässige pharmakokinetische und Biodistributions-Modellierung.
- Formulierungsbrücke: Stellt eine skalierbare Nanotransporter-Plattform bereit, die an andere hydrophile Biopharmazeutika angepasst werden kann.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung über die Lead-Optimierung bis zur präklinischen Formulierung ein, insbesondere für hydrophile Proteine, die einer Stabilisierung bedürfen.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die funktionelle Prüfung eingefangener Lektine und globulärer Proteine in Studien zur Aufklärung von Signalwegen.
- Screening: Erzeugt monodisperse Nanoliposomen, die für fluoreszenzbasierte oder Bindungs-Assays mit einheitlicher Partikelgröße geeignet sind.
- Analytik: Setzt dynamische Lichtstreuung für die quantitative Bestimmung der Größenverteilung und der Einschlusswirkung nach Petersons Protokoll zur genauen Quantifizierung ein.
- Translationale Forschung: Erhält die Proteintreue durch schonende Extrusion und Kühlung und unterstützt so biomarkerbasierte präklinische Modelle.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Legt einen reproduzierbaren Standardarbeitsablauf (SOP) für die liposomale Einschließung fest, der auf verschiedene Proteinziele und Projekte anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Hohe Einschlusswirkung (83 %) und geringe Leckage verbessern die Datenzuverlässigkeit bei Target-Bindungsstudien.
- Operativer Wert: Standardisierte Lipidfilmhydratation und Extrusion ermöglichen eine skalierbare, an GMP-Anforderungen anpassbare Produktion.
- Strategischer Wert: Verringert die Ausscheidungsrate, indem Formulierungsprobleme frühzeitig im Entdeckungsprozess entschärft werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Protein-Kandidaten basierend auf Entwickelbarkeit und Formulierbarkeit.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Lipiden, Sonikation, Extrusion und Ultrazentrifugationstechniken.
- Setzt den Zugang zu einem Rotationsverdampfer, einem Extruder mit Polycarbonatmembranen, DLS, REM und einer Ultrazentrifuge voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Arbeitsgruppen hinsichtlich der Lipidverhältnisse, Hydrationspuffer und Extrusionszyklen, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Die Anpassung an andere Modelle erfordert eine Optimierung der Lipidzusammensetzung und der Proteineinsatzkonzentration.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören mögliche Wechselwirkungen zwischen Lipiden und Proteinen sowie die Notwendigkeit einer dreifachen Analyse, um die Genauigkeit der Quantifizierung sicherzustellen.
