Name: Ein verbesserter grüner Fluoreszenzprotein-basierter Assay zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchses in primärneuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Erfahren Sie einen verbesserten Assay zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchses in primären embryonalen Rattenkortikalneuronen mittels EGFP-Kotransfektion. Diese Methode ermöglicht präzise Identifikation transfundierter Zellen.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel des Research Grants Council Hong Kong, health and Medical Research Fund (Hong Kong), CUHK Direct Grant Scheme, des United College Endowment Fund und des TUYF Charitable Trust unterstützt.

Alle verfahren entsprachen den ethischen Standards der Ethikkommission für Tierversuche der Chinesischen Universität Hongkong.
1. Herstellung von Coverlips
<ol><li>Legen Sie einen sterilen 18 mm runden Abdeckungsslip in jeden Brunnen einer 12-Well-Gewebekulturplatte.</li>
	<li>Beschichten Sie den Deckelschlupf mit 5 g/ml Poly-D-Lysin-Lösung in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator für mindestens 1 h.</li>
	<li>Die Poly-D-Lysin-Lösung von der Gewebekulturplatte absaugen und die beschichteten Abdeckungen einmal mit sterilem Wasser abspülen.</li>
</ol>2. Ratte Embryonale Neuronensektion
<ol><li>Opfern Sie eine zeitschwangere Sprague-Dawley-Ratte im Schwangerschaftsalter von 18 Tagen (E18) entweder durch Zervixdislokation oder CO2-Erstickung. HINWEIS: Bitte überprüfen Sie die örtlichen Vorschriften für das Opfer von trächtigen Ratten.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bauchhöhle der schwangeren Ratte mit einer Sezierschere und übertragen Sie die Gebärmutter auf eine 10 cm Petrischale.</li>
	<li>Öffnen Sie die Gebärmutter und den Fruchtwassersack vorsichtig mit einer kleinen Sezierenderin und entfernen Sie die Plazenta aus dem Rattenembryon mit einer kleinen Sezierenderin. Übertragen Sie den gesamten Embryo in eine 10 cm Petrischale mit vorgekühlter Phosphat-gepufferter Saline, ergänzt mit Glucose (PBS-Glucose, 10 mM Natriumphosphate, 2,68 mM Kaliumchlorid, 140 mM Natriumchlorid und 3 g/L Glukose) mit einem Paar kleiner Zangen.</li>
	<li>Schneiden Sie entlang der sagittalen Naht des Schädels und öffnen Sie es vorsichtig mit einem Paar kleiner Sezieren Schere. Übertragen Sie das embryonale Gehirn mit einem kleinen flachen Spachtel auf eine 10 cm Petrischale mit eiskaltem PBS-Glucose.</li>
	<li>Trennen Sie die beiden zerebralen Hemisphären vom Kleinhirn und Hirnstamm mit zwei #5 Pinzette unter einem Zerlegungsmikroskop. HINWEIS: Siehe Referenz12 für die Struktur des Rattenhirns.</li>
	<li>Entfernen Sie die Meninges mit der #5 Pinzette.</li>
	<li>Isolieren Sie den Kortex von den Großhirnhälften mit zwei geraden #5 Pinzette.</li>
	<li>Übertragen Sie den isolierten Kortex in eine 15 ml Zentrifugenröhre in eiskalte PBS-Glucose.</li>
</ol>3. Primäre kortikale Neuronenkultur
HINWEIS: Alle Verfahren in den Schritten 3 und 4 werden in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II durchgeführt.
<ol><li>Den isolierten Kortex bei 4 °C 5 min durch Schwerkraft absetzen und die PBS-Glukose ansaugen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA in den isolierten Kortex und mischen Sie sanft durch Tippen und Inkubieren des Gewebes in einem 37 °C Wasserbad für 10 min, um eine enzymatische Verdauung zu ermöglichen. Tippen Sie vorsichtig auf das Rohr, um alle 2 min zu mischen.</li>
	<li>4 ml Pflegemedium (z.B. Neurobasal Medium) in das Gewebe/Trypsin-Gemisch geben. HINWEIS: Alle Wartungsmedium in diesem Protokoll verwendet wird mit Penicillin-Streptomycin und B-27 Ergänzung13ergänzt.</li>
	<li>Dissoziieren Sie das Gewebe sanft durch Triturierung mit einer 1 ml Pipette.</li>
	<li>Pellet die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation bei 200 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.5 bis 3.7 zweimal.</li>
	<li>Das Zellpellet in 1 ml Wartungsmedium wieder aufsetzen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 L von 0,4% Trypan Blue-Lösung zu 10 l Zellsuspension für die Zählung lebensfähiger Zellen durch ein Hämozytometer hinzu.</li>
	<li>Die Neuronen mit einer Dichte von 65.000/cm2 (lebensfähige Zellen) in 1 ml Pflegemedium pro Brunnen in einer 12-Well-Platte verkleben.</li>
</ol>4. Zelltransfektion und Fixierung
<ol><li>Nach 2 Tagen in vitro (DIV2) transfekt man 0,5 g EGFP-Konstrukt (pEGFP-C1) zusammen mit oder ohne 0,5 g POI in Neuronen unter Verwendung von 1 l Transfektionsreagenz (z. B. Lipofectamin 2000). Verwenden Sie die Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Säugetierexpressionskonstrukte wurden mit einem Endotoxin-freien Plasmid-Präparat-Kit hergestellt. Die Behandlung mit Chemikalien/Molekülen (in diesem Manuskript wurden Cytochalasin D (Cyto D) und Nervenwachstumsfaktor (NGF) verwendet) kann bei 6 h nach der Transfektion erfolgen.</li>
	<li>Das Kulturmedium 24 h nach der Transfektion ansaugen und die transfizierten Zellen einmal mit 37 °C PBS (10 mM Natriumphosphate, 2,68 mM Kaliumchlorid, 140 mM Natriumchlorid) waschen.</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die festen Zellen dreimal mit PBS.</li>
	<li>Fügen Sie eine minimale Menge an Fluoreszenz-Montagemedium auf einem Mikroskop-Glasschlitten hinzu. Übertragen Sie den Deckelrutsch von der 12-Well-Platte vorsichtig auf das Montagemedium mit der Probe zur Glasrutsche. HINWEIS: Versiegeln Sie den Rand des Deckels mit Nagellack, wenn ein wässriges Montagemedium verwendet wird.</li>
</ol>5. Messung des Neuritenauswüchses
<ol><li>Verwenden Sie ein 40-faches Objektiv, um Bilder mit einem Epifluoreszenzmikroskop zu erfassen.</li>
	<li>Erfassen Sie Bilder von mindestens 40 intakten Neuronen mit EGFP-Signal pro Transfektion.</li>
	<li>Öffnen Sie das aufgenommene Bild in der ImageJ-Software mit dem NeuronJ-Plugin11, um die Länge des längsten Neurites vom Zellkörper bis zur Spitze des Wachstumskegels jedes abgebildeten Neurons zu messen.</li>
	<li>Analysieren Sie die mit der Software erhaltenen Daten, um die Wirkung der gezielten Proteine im Neuritenwachstum zu bestimmen.</li>
</ol>

<ol><li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system%3A+Lessons+from+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li>
<li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li>
<li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Chemical+Genomics%22%5BJournal%5D)">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li>
<li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li>
<li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+functional+expression+of+NMDA+receptors+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells.</a> Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).</li>
<li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+use+of+neuro-2a+neuroblastoma+cells+versus+intact+neurons+in+primary+culture+for+neurotoxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li>
<li>Cheung, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+the+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain%3A+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li>
<li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+B27%2Fneurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum%2C+substantia+nigra%2C+septum%2C+cerebral+cortex%2C+cerebellum%2C+and+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li>
<li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth%3A+roles+of+microfilaments+and+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li>
<li>Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+inhibits+actin+polymerization+and+induces+depolymerization+of+actin+filaments+formed+during+platelet+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change.</a> Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+regulating+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Enhancing and regulating neurite outgrowth.</a> Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).</li>
<li>Lau, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li>
<li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18(2010).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation%2FReoxygenation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%3A+International+Journal+of+Experimental+Cellular+Physiology%2C+Biochemistry%2C+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li>
<li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6(2018).</li>
<li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+for+advanced+glycation+end+products+%28RAGE%29--soluble+form+%28sRAGE%29+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Investigation%22%5BJournal%5D)">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li>
<li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li>
<li>Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRadbruch%2C+A+%22Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting%22">Flow Cytometry and Cell Sorting</a>. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).</li>
<li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li>
<li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li>
<li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures%3A+a+methodological+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899(2013).</li>
<li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+%28hiPSC%29-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143(2017).</li>
<li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell-type+classification%3A+challenges%2C+opportunities+and+the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li>
<li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit dem Inhalt dieses Artikels haben.

Wie bereits erwähnt, PC12 und seine Subklonen sind weit verbreitet für das Studium der Neuritenerweiterung verwendet, weil sie ausgezeichnete Transfektionseffizienz2,3haben. Im Gegensatz dazu haben primäre Neuronen eine niedrige Transfektionsrate, was ein großes Hindernis für die Untersuchung von Neuriten-Auswuchsregulatoren durch Transfektion7darstellt. Hier beschreiben wir ein praktisches Protokoll zur Quantifizierung des Neuritenwachstu...

Neurite, einschließlich Axone und Dendriten, sind die Projektionen von Neuronen, die an der Etablierung der neuronalen Netze beteiligt sind. Das dynamische Wachstum von Neuriten ist für die Neuroentwicklung unerlässlich. Die zugrunde liegenden Regulierungsmechanismen bleiben jedoch unklar. Insbesondere neuritäre Schäden werden oft bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen und nach Hirnverletzungen beobachtet1. Daher würde die Untersuchung der Rolle vermeintlicher Moleküle in verschiedenen neuriteren Auswuchs-Regulierungswegen unser Verständnis des Prozesses verbessern. Darüber hinaus kann es neue therapeutische Ziele für verschiedene neurologische Störungen offenbaren. Neuronale Zelllinien sind wertvolle Modelle für die Untersuchung neuronaler Prozesse einschließlich Neuritenwachstum, da sie leicht zu manipulieren und transfektsind 2,3. Es wurde jedoch berichtet, dass genetische Drift in einigen häufig verwendeten Zelllinien auftritt, was zu Variationen ihrer physiologischen Reaktionen führen könnte4. Darüber hinaus wurde eine differenzielle Proteinexpression zwischen neuronalen Zelllinien und primären Neuronen gezeigt. Zum Beispiel, PC12, eine neuronale Zelllinie aus Derbe rinder Nebennieren, die weit verbreitet für die Untersuchung von Neuritenauswachsen verwendet wird2,3, nicht ausdrücken NMDA-Rezeptoren5. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass die reduzierte Reaktionsfähigkeit der Maus Neuroblastom Linie Neuro-2a zu Neurotoxinen im Vergleich zu primären Neuronen ist aufgrund der mangelnden Expression bestimmter Membranrezeptoren und Ionenkanäle6. Daher sind primäre Neuronen ein wünschenswerteres und repräsentativeres Modell für die Untersuchung des Neuritenwachstums. Jedoch, die Verwendung von primären Neuronen wird durch ihre geringe Transfektion Effizienz behindert7.
Hier beschreiben wir eine Methode, die die Kotransfektion des Proteins von Interesse (POI) und EGFP in primäre kortikale Neuronen der Ratte beinhaltet. Das EGFP dient als morphologischer Marker zur Identifizierung erfolgreich transfizierter Neuronen und ermöglicht die Messung von Neuriten. Wir validierten diese Methode, indem wir Verbindungen/Moleküle verwendet haben, von denen berichtet wurde, dass sie das Neuritenwachstum modulieren. Darüber hinaus wurde FE65, ein neuronales Adapterprotein, das nachweislich das Neuritenwachstum stimuliert, verwendet, um diesen Ansatz zu veranschaulichen8,9. Dieses Protokoll beinhaltet (1) die Isolierung von primären kortikalen Neuronen von embryonalen Tag 18 (E18) Rattenembryonen, (2) die Kotransfektion von Neuronen mit EGFP und dem POI (FE65 in dieser Studie) und (3) die Bildgebung und Analyse der Neuronen mit Hilfe der Bildverarbeitung Software ImageJ mit dem NeuronJ Plugin10,11.

<table><tbody><tr><td>#5 Pinzette</td><td>Regine</td><td>5-COB</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Circle Cover Slips</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00180RA</td><td>Vor Gebrauch sterilisieren</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Invitrogen</td><td>PHZ1063</td><td>Gelöst in DMSO</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere, 10 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere, 12,5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Eindeckmedium</td><td>Dako</td><td>S302380</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfektion Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF 2.5S Natives Mausprotein</td><td>Gibco</td><td>13257019</td><td></td></tr><tr><td>Nugent Utility Forceps, 10 mm, gerade Spitze</td><td>World Precision Instruments</td><td>504489</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>#6084-1</td><td></td></tr><tr><td>pCI FE65</td><td></td><td></td><td>Bitte beachten Sie Referenzen 8 und 15</td></tr><tr><td>PBS Tabletten</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysinhydrobromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4147</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenol rote</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau Lösung, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

ein verbesserter grüner fluoreszenzprotein-basierter assay zur untersuchung des neuriten-auswuchses in primärneuronen

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

Neuritenwachstum ist ein grundlegendes Ereignis bei der Bildung der neuronalen Schaltkreise während der Entwicklung des Nervensystems. Schwere Neuritenschäden und synaptische Dysfunktion treten bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen und altersbedingten Degeneration nen auf. Die Untersuchung der Mechanismen, die das Neuritenwachstum regulieren, würde nicht nur wertvolles Licht auf die Entwicklungsprozesse des Gehirns werfen, sondern auch auf solche neurologischen Störungen. Aufgrund der geringen Transfektionseffizienz ist es derzeit schwierig, die Wirkung eines bestimmten Proteins auf das Neuritenwachstum in primären Säugetierneuronen zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Untersuchung des Neuritenauswuchses durch die Kotransfektion von primären kortikalen Neuronen der Ersten Ratte mit EGFP und einem Protein von Interesse (POI). Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von POI transfizierten Neuronen über das EGFP-Signal, und so kann die Wirkung des POI auf das Neuritenwachstum genau bestimmt werden. Dieser EGFP-basierte Assay bietet einen bequemen Ansatz für die Untersuchung von Wegen zur Regulierung des Neuritenwachstums.

Um diese Methode zu testen, verwendeten wir Cyto D und den Nervenwachstumsfaktor NGF, die nachweislich das Neuritenwachstum bzw.14,15,16hemmen und stimulieren. Die Neuritenlänge der mit EGFP transfizierten Neuronen wurde nach der Behandlung mit Cyto D oder NGF gemessen. Die Transfektionseffizienz von EGFP auf die Neuronen betrug 2,7% (1.068 Neuronen gezählt). Wie in Abbildung...

In diesem Bericht beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Untersuchung des Neuritenauswüchss in embryonalen kortikalen Neuronen von Ratten durch Co-Transfecting mit EGFP und dem Protein von Interesse.

Ein verbesserter grüner Fluoreszenzprotein-basierter Assay zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchses in primärneuronen

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

Niedrige Transfektionseffizienz ist ein großes Hindernis für die Bestimmung, wie Protein reaktiviert Neuritenwachstum in primären Neuronen. Unser Protokoll behebt dieses Problem durch die Co-Transfektion von EGFP, um erfolgreich transfizierte Zellen zu identifizieren. Die hohe Co-Transfektionsrate von EGFP und den Proteinen von Interesse gewährleistet die Genauigkeit des Assays.Und folglich ist jetzt eine Immunfluoreszenzfärbung erforderlich. Da das Neuritenwachstum während der neuronalen Regeneration auftritt, kann diese Methode zur Identifizierung neuartiger Ziele zur Wiederherstellung des beschädigten neuronalen Netzwerks bei Hirntraumata oder neurodegenerativen Erkrankungen angewendet werden. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, legen Sie einen sterilen 18-Millimeter-Runddeckel in jeden Brunnen einer 12 Brunnen-Gewebekulturplatte und beschichten Sie jeden Coverslip mit fünf Mikrogramm pro Millimeter Poly-D-Lysin-Lösung mindestens eine Stunde lang in einem befeuchteten 37-Grad-Grad-Zirkationszentrum.Am Ende der Inkubation die Poly-D-Lysin-Lösung ansaugen und die Deckellipsen mit sterilem Wasser abspülen. Legen Sie am 18. Tag der Embryonal die Gebärmutter, die von einer schwange

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Live Cell Imaging ist von besonderem Nutzen bei der Untersuchung der Dynamik von Organellen Menschenhandel. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Live-Darstellung von Dense-Core-Vesikel in kultivierten Neuronen mit Weitwinkel-Fluoreszenzmikroskopie. Dieses Protokoll ist flexibel und kann an image anderen Organellen wie Mitochondrien angepasst werden, Endosomen und Peroxisomen.

Live-Imaging von Dense-Core-Vesikel in Primary hippokampalen Neuronen

Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges Protokoll und Reagenz-Set für empfindliche Messung der neurotoxischen Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen auf Co-Kulturen von Neuronen und Astrozyten mit High Content Analyse entwickelt. Die Ergebnisse zeigen, dass High Content Analyse eine spannende neue Technologie für die Neurotoxizität Beurteilung darstellt.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

FRAP wurde verwendet, um die Mobilität von grün fluoreszierendes Protein (GFP)-markierter Proteine ​​in kultivierten Zellen zu quantifizieren. Wir untersuchten die mobile / immobile Fraktionen der GFP durch die Analyse der Fluoreszenz-Recovery-Anteil nach Ausbleichen. In dieser Studie wurde FRAP am Rücken von Hippocampus-Neuronen durchgeführt.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

In diesem Video beschreiben wir eine auf Lumineszenz basierende Methode, um die Neurotoxizität von Neuritenauswuchs fördernden niedermolekularen Verbindungen auf die Lebensfähigkeit von hNPC-abgeleiteten Neuronen zu bewerten. Der Assay misst den intrazellulären ATP-Spiegel, einen Indikator für die Lebensfähigkeit der Zellen, um die Neurotoxizität nach der Behandlung mit der Testsubstanz zu bewerten.

Lumineszenz-basierter Assay zur Beurteilung der Neurotoxizität von Testverbindungen auf Neuronen

In diesem Video demonstrieren wir einen EGFP-basierten Immunfluoreszenz-Assay, um die Wirksamkeit von Zielproteinen auf das Neuritenwachstum primärer kortikaler Neuronen zu identifizieren. Die primären Neuronen werden mit einem fluoreszierenden Protein, EGFP, und einem Zielprotein transfiziert, und dann wird ein Immunoassay durchgeführt, um die Wirkung des Zielproteins auf das Neuritenwachstum zu untersuchen.

Immunfluoreszenz-Assay zur Bewertung der Wirkung von Zielproteinen auf das Neuritenwachstum

Neuronale Morphogenese und Migration sind entscheidende Ereignisse zugrunde liegenden richtige Entwicklung des Gehirns. Hier beschreiben wir Verfahren zur genetischen Manipulation kultivierten zerebellären Körnerzellen und die Entwicklung von Kleinhirn für die Beurteilung der Morphologie und der Migrationseigenschaften von Neuronen.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Wir beschreiben einen optischen Test zur synaptischen Vesikel (SV) recycling in kultivierten Neuronen. Kombinieren dieses Protokoll mit doppelten Transfektion einer präsynaptischen Marker und Protein des Interesses zum Ausdruck bringen kann wir finden präsynaptischen Websites, deren synaptischen Vesikel Recyclingkapazität, und bestimmen die Rolle des Proteins des Interesses.

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine Methode für einen Neuriten-Auswuchs-Assay und neurotoxizitätsbewertete kleine Molekülverbindungen.

Ein Neurit Engrowth Assay und Neurotoxizität Satonie-Bewertung mit menschlichen neuronalen Vorläufer Cell-Derived Neuronen

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Unter Verwendung transgener fluoreszierender Mäuse werden detaillierte Protokolle beschrieben, um den axonalen Transport von Signalendosomen und Mitochondrien innerhalb motorischer und sensorischer Axone des intakten Ischiasnervs bei lebenden Tieren in vivo zu beurteilen.

Erweiterung des Toolkits für die In-vivo-Bildgebung des axonalen Transports

Erfahren Sie einen verbesserten Assay zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchses in primären embryonalen Rattenkortikalneuronen mittels EGFP-Kotransfektion. Diese Methode ermöglicht präzise Identifikation transfundierter Zellen.

Ein verbesserter grüner Fluoreszenzprotein-basierter Assay zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchses in primärneuronen

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