Ein verbesserter grüner Fluoreszenzprotein-basierter Assay zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchses in primärneuronen

Niedrige Transfektionseffizienz ist ein großes Hindernis für die Bestimmung, wie Protein reaktiviert Neuritenwachstum in primären Neuronen. Unser Protokoll behebt dieses Problem durch die Co-Transfektion von EGFP, um erfolgreich transfizierte Zellen zu identifizieren. Die hohe Co-Transfektionsrate von EGFP und den Proteinen von Interesse gewährleistet die Genauigkeit des Assays.

Und folglich ist jetzt eine Immunfluoreszenzfärbung erforderlich. Da das Neuritenwachstum während der neuronalen Regeneration auftritt, kann diese Methode zur Identifizierung neuartiger Ziele zur Wiederherstellung des beschädigten neuronalen Netzwerks bei Hirntraumata oder neurodegenerativen Erkrankungen angewendet werden. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, legen Sie einen sterilen 18-Millimeter-Runddeckel in jeden Brunnen einer 12 Brunnen-Gewebekulturplatte und beschichten Sie jeden Coverslip mit fünf Mikrogramm pro Millimeter Poly-D-Lysin-Lösung mindestens eine Stunde lang in einem befeuchteten 37-Grad-Grad-Zirkationszentrum.

Am Ende der Inkubation die Poly-D-Lysin-Lösung ansaugen und die Deckellipsen mit sterilem Wasser abspülen. Legen Sie am 18. Tag der Embryonal die Gebärmutter, die von einer schwangeren Sprague Dawley Ratte geerntet wurde, in eine 10 Zentimeter lange Petrischale und öffnen Sie mit einer kleinen Sezierschere die Gebärmutter und den Fruchtwassersack. Verwenden Sie die Schere, um die Plazenta zu entfernen und verwenden Sie Zangen, um einen ganzen Embryo in eine neue 10-Zentimeter-Petrischale mit gekühlter PBS-Glukose zu übertragen.

Verwenden Sie die Schere, um entlang der sagittalen Naht des Schädels zu schneiden und verwenden Sie einen kleinen flachen Spachtel, um das embryonale Gehirn in eine neue 10 Zentimeter Petrischale mit frischer eiskalter PBS-Glukose zu übertragen. Trennen Sie mit zwei Pinzetten nummer iert er und einem Zerlegungsmikroskop die beiden Hirnhalbkugeln vom Kleinhirn und Hirnstamm und entfernen Sie die Hirnhirne. Isolieren Sie dann den Kortex von den Großhirnhälften und legen Sie den Kortex in eine 15-Milliliter-Röhre, die frische eiskalte PBS-Glukose enthält.

Für primäre kortikale Neuronenkultur, in einem Klasse II Biosicherheitskabinett, erlauben Sie dem Kortex, durch Schwerkraft für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zu begleichen, bevor die PBS-Glukose durch 0,05% Trypsin EDTA ersetzt wird. Mischen Sie das Gewebe mit sanftem Klopfen und bebrüten Sie das Gewebe in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 10 Minuten mit zusätzlichem sanften Klopfen alle zwei Minuten. Am Ende der Inkubation, stoppen Sie die Verdauung mit vier Milliliter Wartungsmedium und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um das Gewebe mit sanfter Trituration zu dissoziieren.

Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Pflegemedium für eine zweite Zentrifugation wieder auf. Setzen Sie das pellet, das nach der zweiten Zentrifugation gebildet wurde, in einem Milliliter frischem Pflegemedium zum Zählen und Verblechen der isolierten Neuronen bei einer 6,5-mal 10-zu-die-vierten lebensfähigen Zelle pro Zentimeter quadratische randalierte Konzentration in einem Milliliter Pflegemedium pro Brunnen in einer 12-Well-Platte wieder auf. Nach zwei Tagen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid EGFP und Zielproteinplasmid DNAs und Transfektionsreagenz in zwei separaten 1,5 Milliliter-Röhren verdünnen und dann vermischen.

Transfezieren Sie die Zellen mit EGFP-Konstrukt, indem Sie den Transfektionsmix zu den Brunnen hinzufügen. Waschen Sie die Zellen nach 24 Stunden mit 37 Grad Celsius PBS und fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die festen Zellen dreimal mit frischem PBS pro Waschgang waschen und ein minimales Volumen an Fluoreszenz-Montagemedium auf einem Mikroskopglasschlitten pro Probe hinzufügen.

Dann die beschichteten Abdeckungen vorsichtig auf das Montagemedium mit den Proben zu den Glasgbessern übertragen. Um das Neuritenwachstum abzubilden, wählen Sie das 40-fache Objektiv auf einem Epifluoreszenzmikroskop aus und klicken Sie auf Start, um Bilder von mindestens 40 intakten EGFP-positiven Neuronen pro Transfektion zu erfassen. Wenn alle Neuriten abgebildet sind, öffnen Sie die aufgenommenen Bilder in ImageJ mit dem NeuronJ-Plugin und messen Sie die Länge des längsten Neuritus jedes Neurons vom Zellkörper bis zur Spitze des Wachstumskegels.

Analysieren Sie dann die mit der Software erhaltenen Daten, um die Wirkung der gezielten Proteine auf das Neuritenwachstum zu bestimmen. Cytochalasin D unterdrückt die Neuritenverlängerung in einer dosisabhängigen Weise, während das Neuritenwachstum in Neuronen verstärkt wird, die mit dem Nervenwachstumsfaktor behandelt werden. Darüber hinaus stimuliert das neuronale Wachstumsadapterprotein FE65 das Neuritenwachstum im Vergleich zu untransfizierten Neuronen signifikant.

Trotz einer geringen Transfektionseffizienz zeigt die Immunfluoreszenzanalyse, dass über 80 % einer zweitägigen Zellkultur erfolgreich mit EGFP und FE65 kotransfiziert werden können. Die EGFP-Expression wird nach der Transfektion nach sechs Stunden erkannt, während FE65 zum ersten Mal in Stunde 12 erkannt wird und beide Signale für bis zu sieben Tage nach der Transfektion erkannt werden. Die Transfektion von primären kortikalen Neuronen der Ersten Ratte mit unterschiedlichen Mengen an FE65-Plasmid-DNA zeigt eine dosisabhängige Zunahme der Neuritenerweiterung mit 0 bis 0,5 Mikrogramm FE65-Plasmid.

Jedoch, kein signifikanter Unterschied im Wachstum wird bei Neuronen transfiziert mit 0,5 oder einem Mikrogramm des Plasmids beobachtet. Beim Versuch des Protokolls ist es wichtig, die entsprechende Region vom embryonalen Gehirn zu isolieren. Diese Technik kann auch auf die Untersuchung des neuronalen Wachstums in menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen angewendet werden, die wertvolle Werkzeuge für die regenerative Medizin haben.