Lumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von O₂ mit einem Frequency-Domain-basierten Kamerasystem

Als bester Elektronenakzeptor spielt Sauerstoff eine entscheidende Rolle in biologischen Systemen. Mit diesem Protokoll können Sie die Sauerstoffverteilung in 2D mit einer Optode abbilden. Neben der hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung erfordert diese Methode keinen zusätzlichen Referenzfarbstoff, ist extrem robust und ermöglicht die Erfassung von Strukturbildern.

Diese Methode kann auf verschiedene Forschungsbereiche angewendet werden, in denen Sauerstoff eine Schlüsselrolle spielt, einschließlich Ökologie, medizinische Forschung, Bioprinting und druckempfindlichem Druck. Die Optode-Fertigung kann eine Herausforderung sein, da die Menge an Cocktail, die der Stützfolie hinzugefügt wird, und die Zuggeschwindigkeit der Messerbeschichtungsvorrichtung Optimierung und Übung erfordern kann. Mit diesem Videobeitrag wollen wir diese leistungsstarke Technik Forschern aus anderen Studienbereichen zugänglich machen.

Um eine planare Sauerstoffoptode vorzubereiten, verwenden Sie zunächst einen Wasserfilm oder 70% Ethanol, um eine saubere staubfreie PET-Folie auf einer sauberen Glasplatte zu befestigen. Legen Sie eine saubere 120 Mikrometer Messerbeschichtung auf die Folie und verwenden Sie eine Glaspipette, um eine Sensor-Cocktail-Linie vor dem Gerät aufzutragen. Ziehen Sie als nächstes die Messerbeschichtung langsam und gleichmäßig über die PET-Folie, um den Cocktail gleichmäßig zu verteilen.

Dann trocknen Sie das fertige planare sauerstoffempfindliche Optode in der Umgebungsluft für eine Stunde, bevor Sie über Nacht in einem beheizten Schrank bei 50 bis 60 Grad Celsius trocknen. Bis zum nächsten Morgen wird eine etwa 12 Mikrometer dicke Schicht erhalten sein. Bewahren Sie die optode vor Licht geschützt bis zur weiteren Verwendung auf.

Um eine Rhizo-Sandwich-Kammer vorzubereiten, verwenden Sie lichthärtenden Acryl-basierten Instant-Klebstoff, um Mikroskop-Dias entlang der Ränder einer Glasplatte zu kleben und eine lange Kante offen zu lassen. Schneiden Sie die planare Optode in die gewünschte Form und Größe, um in den Raum zwischen den geklebten Mikroskop-Dias zu passen und legen Sie die Optode auf der Innenseite der vorderen Glasplatte mit der beschichteten Seite nach oben. Eine Kante der Optodefolie auf die Glasplatte kleben und Leitungswasser zwischen der Glasplatte und der Optodefolie hinzufügen.

Senken Sie die Folie langsam auf die Wassertröpfchen, so dass sich die Optode auf der Glasoberfläche aufrichten und mit einem Weichgewebe vorsichtig eine Luftblase entfernen kann, die zwischen optode und der Platte eingeschlossen ist. Wischen Sie dann die Glasplatte trocken und verkleben Sie die restlichen Kanten der Folie auf die Platte. Verwenden Sie als Nächstes eine flache Glasplatte, um 0,5 Millimeter Siebsediment gleichmäßig auf die gleiche Dicke wie die Mikroskop-Schiebeabstandhalter zu verteilen.

Reinigen Sie die obere Oberfläche des Mikroskopschlittens sorgfältig, um sicherzustellen, dass die zweite Glasplatte die Kammer richtig abdichtet und Silikonfett auf die Mikroskop-Diaoberfläche aufträgt. Dann bedecken Sie das Sediment mit einem dünnen Wasserfilm und vermeiden Sie dabei sorgfältig die Bildung von Luftblasen. Bevor Sie eine Probe auf das Sediment legen, waschen Sie vorsichtig einen einzelnen Schuss Littorella uniflora und positionieren Sie den Trieb auf einem Sediment mit den Blättern, die von der oberen offenen Seite herausragen.

Wenn die Probe an Ort und Stelle ist, legen Sie die Glasplatte mit der Optode auf das Sediment und wenden Sie sanften Druck an, um die Optode in engen Kontakt mit den Pflanzenwurzeln und dem umgebenden Sediment zu bringen. Verwenden Sie Klemmen, um die Platten zusammen zu befestigen und die äußeren Ränder mit Tissuepapier zu trocknen. Fügen Sie den Blättern wiederholt ein paar Tropfen Wasser hinzu, um die Pflanze während der Montage des Rhizo-Sandwiches hydratisiert zu halten und verwenden Sie Vinyl-Elektroband, um die Rhizo-Sandwich-Kammer zu straffen.

Dann versiegeln Sie die Kanten mit Modellierton und zusätzlichem Elektroband. Zur Vorbereitung der Bildgebung die Deckfolie nach der Inkubation aus dem Optodenbereich entfernen und die Rhizo-Sandwichkammer mit der Glaswand mit der Optode aufrecht gegen die Aquarienwand positionieren. Verwenden Sie einen Abstandsraum, um die Rhizo-Sandwich-Kammer gegen die Wand zu drücken.

Platzieren Sie die frequenzbereichsbasierte Lumineszenz-Lebensdauerkamera, die mit einem Objektiv ausgestattet ist, vor das Aquarium und den Interessenbereich. Befestigen Sie einen geeigneten Emissionsfilter zur Abbildung des Indikatorfarbstoffs am Kameraobjektiv und fixieren Sie die Lichtführung in der LED-Anregungsquelle. Positionieren Sie dann die Führung so, dass sie die planare Optodefolie, die den Interessenbereich abdeckt, gleichmäßig ausleuchtet.

Wählen Sie in der Bildverarbeitungssoftware die Kamera und in der LED-Steuerungssoftware die LED aus. Stellen Sie die LED-Intensität nach Bedarf ein und ticken Sie analog und synchronisieren Sie, um zu bestätigen, dass die LED durch die externe Transistor-Transistor-Logik ausgelöst wird. Richten Sie die Kamera manuell aus und stellen Sie die objektive Blende ein und stellen Sie die interne Modulationsquelle, die Sinuswelle für die Ausgangswellenform, zusätzliche Phasenproben, achtphasige Proben, Phasenreihenfolge gegenüber, Tippen Sie auf A B-Auslesung und fünf Kilohertz Modulationsfrequenz ein.

Passen Sie die Belichtungszeit an, bis die Statistik der Region des Interesses für das normalisierte Lumineszenzintensitätsbild im Bereich von 0,68 bis 0,72 liegt. Klicken Sie dann auf Erfassungsreferenz, um mit der Erfassung einer Referenzmessreihe zu beginnen. Um das Optode zu kalibrieren, verwenden Sie eine Gasmischvorrichtung, um das Wasser in einem Kalibrieraquarium mit einem Umgebungsluftstickstoffgasgemisch mit einer bekannten Sauerstoffkonzentration zu spülen, die die Sauerstoffkonzentration mit einer externen Sonde mit einem Sauerstoffsensor überwacht.

Erfassen Sie dann eine Reihe von Bildern mit unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen in der Kalibrierkammer, um eine richtige Kurve zu erhalten, die zu den erfassten Kalibrierdaten passt. Wenn das System kalibriert wurde, schalten Sie die Lichter aus, die die Anlage bestrahlung und alle anderen Lichtquellen bestrahlung, und passen Sie die Erfassungszeit basierend auf der Intensität des Bildes an, um sicherzustellen, dass das Signal weder übersättigt noch zu schwach für ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis bei der Lebensdauerbestimmung ist. Wenn alle Sauerstofflebensdauerbilder erfasst wurden, schalten Sie die Lichter wieder ein, um ein Strukturbild zu erhalten, und erhalten Sie ein Bild mit einem Lineal im Sichtfeld, um eine nachträgliche Skalierung der erfassten Bilder zu ermöglichen.

Vor der Abbildung der Probe muss die Optode kalibriert werden. Nach einem quasi-exponentiellen Zerfall nimmt die gemessene Lumineszenzlebensdauer mit zunehmender Sauerstoffkonzentration ab. Diese Beziehung kann auch mit dem vereinfachten Modell mit zwei Standorten beschrieben werden.

Sobald die Optode kalibriert wurde, ist es möglich, die Sauerstoffkonzentration durch Abbildung der Lumineszenzlebensdauer zu bestimmen, wie in diesen Bildern beobachtet, in denen die Verteilung der Sauerstoffkonzentration in der Rhizosphäre von Littorella uniflora nach Lichteinwirkung von 500 Mikromol-Photonen pro Meter quadratisch pro Sekunde für 12 Stunden und nach 12 Stunden in dunkelheit abgebildet wurde. Neben Lebensdauerbildern können auch Strukturbilder unter äußerer Beleuchtung aufgenommen werden, wobei die bildgebende Geometrie so fixiert bleibt, dass die Sauerstoffbildgebung präzise mit dem Strukturbild korreliert werden kann. Sauerstoffkonzentrationsprofile über eine einzelne Wurzel können dann beispielsweise aus den in Dunkelheit und Licht aufgenommenen Bildern extrahiert werden.

Es ist wichtig, einen guten Kontakt zwischen der Probenmatrix und der Optode zu haben, um unnötige Artefakte zu vermeiden. Wenn Sie Zweifel haben, remake das Sandwich. Die sofortige Erfassung eines Bildes in zerstörungsfreier Weise ermöglicht die Überwachung der Sauerstoffumgebung.

Die Methode könnte ebenso gut mit anderen Optoden für pH-Wert oder andere Analyten kombiniert werden. Achten Sie darauf, Optode-Herstellung in einer Dunstabzugshaube durchzuführen, da der Sensorcocktail Chloroform enthält. Planare Optodes können verwendet werden, um mikrobielle Gemeinschaften im Sediment zu identifizieren.

Und nach der Bildgebung kann das Sandwich geöffnet werden, um diese Hotspots für die mikrobielle Gemeinschaftsanalyse zu probieren.