Name: Bulk Droplet Vitrification für primäre HepatozytenKonservierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Erfahren Sie die Bulk Droplet Vitrification zur Kryokonservierung primärer Hepatozyten mit niedrigen Kryoprotektivkonzentrationen. Diese Methode verbessert Zellviabilität und metabolische Aktivität für Transplantationen.

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Die Finanzierung durch die US National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875 und R01DK114506) und das US Department of Defense (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) wird sehr anerkannt.

Die primären Hepatozytenisolationen für dieses Protokoll wurden vom Cell Resource Core (CRC) am Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA durchgeführt. Das Tierprotokoll (#2011N000111) wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Massachusetts General Hospital genehmigt.
1. Bulk-Droplet-Vitrifikation
<ol><li>Bereiten Sie die Verglasungslösungen vor.
	<ol>
<li>Fügen Sie 40 mg Rinderserumalbumin (BSA) zu 17,0 ml der Lösung der University of Wisconsin (UW) hinzu, um Vitrifizierungslösung 1 (V1) herzustellen. Sterilfilter der V1-Lösung mit einem 0,22-mm-Filter und lagern bei 4 °C. HINWEIS: UW ist eine häufig verwendete Organkonservierungslösung. Es enthält 50 g/L Hydroxyethylstärke, 35,83 g/L Lactobionsäure, 3,4 g/L Kaliumphosphat monobasic, 1,23 g/L Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 17,83 g/L-Raffinose-Pentahydrat, 1,34 g/L Adenosin, 0,136 g/L Allopurinol, 0,992 g/L Totalglutathion, 5,61 g /L Kaliumhydroxid und Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen.</li>
		<li>Kombinieren Sie 7,0 ml UW, 6,5 ml DMSO, 6,5 ml Ethylenglykol (EG), 40 mg BSA und 5,48 g Saccharose zur Verglasungslösung 2 (V2). Sterilfilter der V2-Lösung mit einem 0,22-mm-Filter. 3,5 ml steril gefilterte V2-Lösung in eine 3 ml Spritze geben und bei 4 °C lagern. HINWEIS: Um die Auflösung der CPAs zu erleichtern, werden Lösungen in größeren Mengen als erforderlich vorbereitet.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie die Bulk-Droplet-Verglasungsapparat.
	<ol>
<li>Um die Mischnadel vorzubereiten, schneiden Sie zuerst entlang einer Seite der äußeren grauen Hülse der Mischnadel und biegen Sie dann die Hülse auf, um sie von der Mischnadel zu entfernen.</li>
		<li>Schieben Sie zwei 25 mm Silikonschläuche über die Einlässe der Mischnadel und sichern Sie ihre Position mit Kleber (Abbildung 1A).</li>
		<li>Schneiden Sie die Nadel auf eine Länge von 20 mm (d. h. die Länge der inneren Mischhelix) wie in Abbildung 1Adargestellt. HINWEIS: Die Mischnadellänge ist proportional zum Volumen innerhalb der Nadel und kann daher geändert werden, um die Belichtungszeit der Hepatozyten gegenüber der Lösung mit hoher CPA-Konzentration zu steuern.</li>
		<li>Setzen Sie den Trennausgang der Mischnadel in eine 20 G Injektionsnadel ein (Abbildung 1B). HINWEIS: Die Größe der Injektionsnadel beeinflusst die Tröpfchengröße.</li>
		<li>Sterilisieren Sie die Mischnadelbaugruppe durch Autoklavieren.</li>
		<li>Füllen Sie einen sterilen Dewar mit flüssigem Stickstoff. Sterilisieren Sie die Außenseite des Dewar mit Isopropanol, bevor Sie den Dewar in eine sterile laminare Flusszellkulturhaube legen. HINWEIS: Eine Kontamination ist ein wichtiger Aspekt bei der direkten Exposition der Tröpfchen gegenüber flüssigem Stickstoff. Obwohl im aktuellen Protokoll keine Kontamination mit nicht sterilisiertem flüssigem Stickstoff vorlag, kann flüssiger Stickstoff gefiltert oder bestrahlt werden, um bei Bedarf die Sterilität zu gewährleisten16.</li>
		<li>Legen Sie einen Trichter mit dem gleichen Außendurchmesser wie der Innendurchmesser des flüssigen Stickstoffs Dewar in ein 50 ml konisches Rohr ein, um die Tröpfchensammelvorrichtung zu erstellen (Abbildung 1C-E).</li>
		<li>Tauchen Sie die Tröpfchensammelvorrichtung in den flüssigen Stickstoff ein, indem Sie sie langsam in ihrer endgültigen vertikalen Position mit großen Zangen nach unten drücken. Stellen Sie sicher, dass das konische Rohr in einer vertikalen Position am unteren Rand des Dewar stagniert (Abbildung 1D-E). HINWEIS: Der Trichter sollte in das konische Rohr eingelegt bleiben und auf dem konischen Rohr ruhen. Der Flüssigstickstoffgehalt sollte 1 cm unter der Einlasshöhe des Trichters liegen, wie in Abbildung 1Ddargestellt.</li>
		<li>Montieren Sie eine Spritzenpumpe in einer vertikalen Position an der Wand der Zellkulturhaube, indem Sie eine Schnur von den Füßen der Spritzenpumpe an Schrauben binden, die aus der Zellkultur-Haubenwand herausragen.</li>
		<li>Legen Sie den flüssigen Stickstoff Dewar mit der Tröpfchensammelvorrichtung unter die vertikal montierte Spritzenpumpe (Abbildung 1E).</li>
	</ol></li>
	<li>Vorinkubation mit CPAs.
	<ol>
<li>Nach Erhalt frisch isolierter Rattenhepatozyten, zählen Sie die Lagerkonzentration durch Trypan blauen Ausschluss und nehmen 40 Millionen lebensfähige Hepatozyten. HINWEIS: Der sanfte Umgang mit Hepatozyten in suspension ist entscheidend, um den Zelltod zu verhindern.</li>
		<li>Zentrifuge bei 50 x g für 5 min ohne Bremse.</li>
		<li>Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Hepatozyten in 3,4 ml V1-Lösung wieder aus.</li>
		<li>3 min auf Eis bebrüten.</li>
		<li>Fügen Sie den Hepatozyten 150 l DMSO und 150 L EG hinzu und mischen Sie sie vorsichtig.</li>
		<li>3 min auf Eis bebrüten.</li>
		<li>Fügen Sie die Hepatozyten nochmals 150 l DMSO und 150 L EG hinzu und mischen Sie sie vorsichtig.</li>
		<li>3,5 ml in eine 3 ml Spritze geben.</li>
	</ol></li>
	<li>Vitrifizierung durchführen.
	<ol>
<li>Setzen Sie die Spritze mit vorbebrühten Hepatozyten und die V2-Lösungsspritzen auf den Spritzenpumpenadapter.</li>
		<li>Befestigen Sie zwei weibliche Luer-Verriegelungs-Rohr-Widerhaken-Adapter an den Spritzen und schieben Sie die Silikonschläuche der Mischnadel-Baugruppe über die Widerhakenarmaturen(Abbildung 1F).</li>
		<li>Legen Sie die gesamte Baugruppe in die Spritzenpumpe (Abbildung 1E).</li>
		<li>Drei Min. nach der letzten Zugabe von DMSO und EG zu den Hepatozyten starten Sie die Pumpe bei 2 ml/min.</li>
		<li>Stoppen Sie die Pumpe, nachdem dem flüssigen Stickstoff alle Hepatozyten zugesetzt wurden.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Kryogene Lagerung
<ol><li>Punktieren Sie 10 kleine Löcher im Deckel eines 50 ml konischen Rohres mit einer 20 G Nadel und wickeln Sie die Außenseite des Deckels mit einem flexiblen Film, wie in Abbildung 1Bdargestellt. Dadurch entsteht ein Ventil, das das Entweichen von verdampfendem flüssigem Stickstoff ermöglicht.</li>
	<li>Um die verglasten Hepatozytentröpfchen zu sammeln, entfernen Sie zuerst den Trichter aus dem flüssigen Stickstoff Dewar. Als nächstes verwenden Sie lange Zangen, um das konische Rohr zu nehmen, das die Tröpfchen aus dem flüssigen Stickstoff enthält, und gießen Sie langsam den überschüssigen flüssigen Stickstoff aus dem konischen Rohr aus.</li>
	<li>Schließen Sie das konische Rohr mit dem durchlöcherten Deckel und legen Sie das geschlossene konische Rohr mit verglasten Hepatozytentröpfchen direkt wieder in den flüssigen Stickstoff Dewar.</li>
	<li>Übertragen Sie das konische Rohr aus dem flüssigen Stickstoff in einen flüssigen Stickstoffdampf-Kryotank.</li>
</ol>3. Wiedererwärmung der verglasten Hepatozytentröpfchen
<ol><li>
Bereiten Sie die Rewarming-Lösung vor.
	<ol>
<li>17,13 g Saccharose in 100 ml DMEM Hepatozytenkulturmedien auflösen, um die Rewarminglösung zu finden. Steriler Filter der Rewarming-Lösung mit einem 0,22-mm-Filter und warm auf 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Die Hepatozyten aufwärmen.
	<ol>
<li>Nehmen Sie die konische Röhre mit verglasten Hepatozyten aus dem Kryotank und transportieren Sie sie in einem flüssigen Stickstoff Dewar zur Zellkulturhaube.</li>
		<li>Lösen Sie die Kappe leicht und legen Sie das konische Rohr wieder in den flüssigen Stickstoff.</li>
		<li>Die verglasten Hepatozytentröpfchen in ein leeres Becherglas geben, sofort die warme (37 °C) Aufwärmlösung hinzufügen und sofort 10 s rühren. HINWEIS: Es ist wichtig, schnell zu arbeiten, um das Einfrieren während des Erneuten Aufwärmens zuvermeiden. Je nach Studienbedarf können einige bis alle verglasten Tröpfchen auf einmal wieder aufgewärmt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Entladen Sie die Wiederaufwärmlösung.
	<ol>
<li>Teilen Sie die Rewarminglösung mit Hepatozyten über zwei 50 ml konische Rohre.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die beiden konischen Rohre für 2 min bei 100 x g bei 4 °C ohne Bremse.</li>
		<li>Saugen Sie den Überstand an, um ein Gesamtvolumen von 12,5 ml unter Verwendung der Graduierungsmarke des konischen Rohrs als Referenz zu lassen, und fügen Sie 12,5 ml eiskaltes DMEM pro konischem Rohr hinzu, um die Rewarminglösung auf 50 % zu verdünnen.</li>
		<li>Die Hepatozyten wieder aufsetzen und 3 min auf Eis brüten.</li>
		<li>Fügen Sie 25 ml eiskaltes DMEM pro konischem Rohr hinzu, um die Rewarminglösung auf 25% zu verdünnen.</li>
		<li>Zentrifuge für 5 min bei 50 x g bei 4 °C ohne Bremse.</li>
		<li>Den Überstand ansaugen und die Hepatozyten in 2 ml des gewünschten Kulturmediums für den Einsatz wieder aussetzen. HINWEIS: Die Zentrifugation des Dichtegradienten kann verwendet werden, um tote Hepatozyten auf Wunsch aus der Zellsuspension zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären konkurrierende finanzielle Interessen. Drs. de Vries, Weng, Toner, Tessier und Uygun haben vorläufige Patentanmeldungen, die für diese Studie relevant sind. Dr. Uygun hat ein finanzielles Interesse an Organ Solutions, einem Unternehmen, das sich auf die Entwicklung von Organkonservierungstechnologie konzentriert. Alle Interessen von Forschern werden von der MGH und Partners HealthCare in Übereinstimmung mit ihrer Interessenkonfliktpolitik verwaltet.

Die Kryokonservierung von Hepatozyten durch langsames Einfrieren führt zu verminderter Lebensfähigkeit und metabolischer Funktion. Vitrifikation bietet eine vielversprechende Alternative für die klassische Kryokonservierung, da Gefrierverletzungen vollständig vermieden werden9. Eine Vorinkubation mit CPAs ist jedoch erforderlich, um die kritische Kühlrate8zu senken. Folglich wird die Verglasung durch die CPA-Toxizität17 behindert und auf kleine Probe...

Verlust der Zelllebensfähigkeit und metabolische Funktion nach Kryokonservierung von Hepatozyten ist immer noch ein großes Problem, das klinische Anwendungen begrenzt1,2,3. Die Benchmark-Methode der Hepatozyten-Kryokonservierung ist das langsame Einfrieren, das durch Vorinkubation der Hepatozyten mit CPA (Dimethylsulfoxid [DMSO], Glucose und Albumin) und anschließender kontrollierter Rate gefriert (bei ca. 1 °C/min) kryogene Temperaturen4,5. Trotz vieler gemeldeter Optimierungen bleiben CPA-Toxizität zusammen mit schädlichen osmotischen Ungleichgewichten beim Einfrieren und mechanischer Belastung der Eisbildung grundlegende Nachteile des langsamen Einfrierens6,7.
Vitrifizierung bietet einen Vorteil gegenüber langsamem Einfrieren, da Verletzungen durch Eisbildung durch einen direkten Phasenübergang des Wassers in den Glaszustand6vollständig vermieden werden. Um jedoch die Glasübergangstemperatur von reinem Wasser (-137 °C) zu erreichen, muss das Wasser in einer Größenordnung von einer Million Grad Celsius pro Sekunde (d. h. der kritischen Abkühlrate) gekühlt werden, um eine Eisbildung über der Glasübergangstemperatur 8 zu vermeiden. . Die Zugabe von CPAs kann die kritische Kühlrate senken und die Glasübergangstemperatur wässriger Lösungenerhöhen 9. Doch auch bei hohen CPA-Konzentrationen (z.B. 40% v/v DMSO oder höher) sind für eine erfolgreiche Verglasung8,9dennoch schnelle Abkühlraten erforderlich.
Die erforderlichen Kühlraten und hohen CPA-Konzentrationen führen zu zwei großen Nachteilen der Verglasung. Um eine schnelle Kühlung zu ermöglichen, müssen die Proben zunächst eine geringe thermische Masse haben. Zweitens müssen CPAs langsam eingeführt und vollständig zwischen den intra- und extrazellulären Kompartimenten6ausgeglichen werden, um hohe CPA-Konzentrationen zu erreichen und gleichzeitig osmotische Verletzungen zu vermeiden. Dies erhöht die Expositionszeit von Zellen gegenüber toxischen CPAs. Zusammen macht dies die Verglasung zu einem umständlichen Prozess, der auf ein paar kleine Proben (Mikroliter) gleichzeitig beschränkt ist. Als mögliche Lösung für diese Beschränkungen wurde die Tröpfchenverglasung vorgeschlagen. Durch die Exposition von winzigen zellbeladenen Tröpfchen (Nanolitern) gegenüber flüssigem Stickstoff wird die Kühlrate deutlich erhöht, was eine erhebliche Reduktion der CPA-Konzentration10,11,12 ermöglicht. ,13,14. Obwohl mehrere hochfrequente Tröpfchen-erzeugungserzeugende Düsen potenziell gleichzeitig verwendet werden könnten, begrenzt die extrem kleine Tröpfchengröße den Durchsatz auf Mikroliter pro Minute10, was eine effiziente Verglasung großer Zellen verhindert. Volumen mit um Magnituden höheren Verarbeitungsraten in der Größenordnung von Millilitern pro Minute.
Kürzlich wurde gezeigt, dass diese inhärenten Einschränkungen der Vitrifizierung durch Bulk-Droplet-Vitrifizierung15überwunden werden können. Diese neuartige Methode nutzt eine schnelle osmotische Dehydrierung, um eine intrazelluläre CPA-Konzentration von 7,5 % v/v Ethylenglykol und DMSO unmittelbar vor der Vitrifizierung zu konzentrieren, wodurch die vollständige Ausgleichung toxischer CPA-Konzentrationen entfällt. Die zelluläre Dehydrierung wird in einem fluidischen Gerät durch eine kurze Exposition der Hepatozyten bei einer hohen extrazellulären CPA-Konzentration durchgeführt. Obwohl diese Exposition eine schnelle osmotische Dehydrierung verursacht, ist es zu kurz, als dass die hohe CPA-Konzentration in die Zellen diffundieren könnte. Unmittelbar nach der Dehydrierung werden die Zellen in Tröpfchen geladen, die direkt in flüssigem Stickstoff verglast sind. Diese Methode eliminiert die Notwendigkeit einer vollständigen intrazellulären Aufnahme hoher CPA-Konzentrationen, während die hohe extrazelluläre CPA-Konzentration die Verglasung großer Tröpfchen ermöglicht, was zu hohen Durchsatzvolumina mit minimaler CPA-Toxizität führt.
Tröpfchenverglasung verbessert die direkte und langfristige Lebensfähigkeit nach der Konservierung, sowie Morphologie und metabolische Funktion der primären Rattenhepatozyten im Vergleich zur klassischen Kryokonservierung durch langsames Einfrieren15. Dieses Manuskript enthält die methodischen Details für die Massentropfenverglasung von primären Rattenhepatozyten.

<table><tbody><tr><td>BD 3-ml-Einwegspritzen mit Luer-Lok-Spitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>Becherglas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS1000-250</td><td></td></tr><tr><td>Belzer UW Kühllagerlösung</td><td>Bridge to Life</td><td>BUW-001</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Weiblicher Luer auf 1/16" halbstarrer Schlauchwiderhaken mit niedrigem Profil, PP</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45508-12</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Tank / Kryotank</td><td>Chart Industries</td><td>MVE 800</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Pulver, hoher Glukosegehalt, Pyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107-21-1</td><td></td></tr><tr><td>Extra lange Pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Easy Reader Schnellleser-Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff mit flachem Verschluss</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>Angelschnur</td><td>Stren</td><td>SOFS4-15</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff</td><td>Airgas</td><td>7727-37-9</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Platingehärteter Silikonschlauch, L/S 14</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-14</td><td></td></tr><tr><td>Mix-Spitzen, zur Verwendung mit 3HPW1</td><td>Grainger</td><td>3WRL7</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Polypropylen Pulver Trichter</td><td>ThermoFisher</td><td>4252-0100</td><td></td></tr><tr><td>Nadel 20 ga</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M - Flexible Folie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06369-18</td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Steriflip Sterilfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose (kristallin/ACS-zertifiziert)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Flasche Tischbehälter für flüssigen Stickstoff</td><td>ThermoFisher</td><td>2122</td><td></td></tr></tbody></table>

bulk droplet vitrification für primäre hepatozytenkonservierung

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Die Vitrifizierung ist eine vielversprechende eisfreie Alternative zur klassischen Slow-Freezing (bei ca. 1 °C/min) Kryokonservierung biologischer Proben. Die Vitrifizierung erfordert extrem schnelle Kühlraten, um den Übergang von Wasser in die Glasphase zu erreichen und gleichzeitig eine schädliche Eisbildung zu vermeiden. Obwohl die Vorinkubation mit kryoprotektiveN (CPA) die kritische Abkühlrate biologischer Proben reduzieren kann, sind in der Regel hohe Konzentrationen erforderlich, um eine eisfreie Kryokonservierung durch Verglasung zu ermöglichen. Infolgedessen wird die Verglasung durch CPA-Toxizität behindert und auf kleine Proben beschränkt, die schnell gekühlt werden können. Kürzlich wurde gezeigt, dass diese inhärenten Einschränkungen durch die Verglasung von Tröpfchen überwunden werden können. Mit dieser neuartigen Methode werden Zellen zunächst mit einer niedrigen intrazellulären CPA-Konzentration vorinkubiert. Durch die Nutzung einer schnellen osmotischen Dehydrierung konzentriert sich das intrazelluläre CPA direkt vor der Vitrifizierung, ohne dass toxische CPA-Konzentrationen vollständig ausgeglichen werden müssen. Die zelluläre Dehydrierung wird in einem fluidischen Gerät durchgeführt und mit kontinuierlicher hoher Durchsatzerzeugung von großen Tröpfchen integriert, die in flüssigem Stickstoff verglast sind. Diese eisfreie Kryokonservierungsmethode mit minimaler CPA-Toxizität eignet sich für große Zellmengen und führt zu einer erhöhten Hepatozytenlebensfähigkeit und Metabolisierungsfunktion im Vergleich zur klassischen langsam gefrierenden Kryokonservierung. Dieses Manuskript beschreibt die Methoden für eine erfolgreiche Bulk-Droplet-Verglasung im Detail.

Frisch isolierte primäre Hepatozyten aus fünf verschiedenen Rattenlebern wurden für einen direkten Vergleich der Massentropfenverglasung mit der klassischen Kryokonservierung unter Verwendung der in derLiteratur 4 berichteten herausragenden Slow-Freezing-Protokolle verwendet. 5. Kurz gesagt, die Hepatozyten wurden in UW mit BSA (2,2 mg/ml), Glukose (333 mM) und DMSO (10% v/v) ergänzt und mit einem kontrollierten Gefrierschrank eingefroren. Nach der Lagerung bei ...

Dieses Manuskript beschreibt eine eisfreie Kryokonservierungsmethode für große Mengen von Rattenhepatozyten, bei der Primärzellen mit kryoprotektiven Mitteln in geringer Konzentration vorinkubiert und in großen Tröpfchen verglast werden.

Bulk Droplet Vitrification für primäre HepatozytenKonservierung

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Vitrifikation wird in der Regel durch Toxizität von kryoprotektive Mittel behandelt. Und wieder in kleine Proben eingefügt, die schnell gekühlt werden können. Dieses Protokoll ermöglicht die Verglasung großer Zellmengen bei gleichzeitig geringer CPA-Konzentration während der Vorinkubation.Durch schnelle osmotische Dehydrierung wird der niedrige Zwischenkeller-CPA direkt vor der Vitrifizierung im Fluidgerät konzentriert. Dadurch entfällt die Notwendigkeit, toxische CPA-Konzentrationen vollständig auszudemtzuführen. Bulk-Tropfen-Vitrifikation kann lebensfähige und metabolisch aktive Hepatozyten für die Verwendung von Hepatozyten Transplantation und bio-künstliche Leber-Geräte, die unsere derzeit durch unzureichende Ergebnisse nach Kryokonservierung behindert.Diese Methode kann möglicherweise für die Verglasung anderer Zelltypen angepasst werden, die in großen Mengen kryokoniert werden müssen;z. B. Blutprodukte oder Stammzellen unter anderem. Um zu beginnen, machen Vitrifizierung Lösung 1 durch Hinzufügen von 40 Milligramm BSA zu 17,0 Milliliter der University of Wisconsin Solution. Verwenden Sie einen 0,22 Mikrometer-Filter, um die Lösung zu sterilisieren und bei vier Grad Celsius aufzubewahren.Erstellen Sie Vitrifizierungslösung 2, wie im Protokoll beschrieben. Und steril es durch einen 0,22 Mikrometer Filter filtern. 3,5 Milliliter sterilgefilterte V2-Lösung in eine Drei-Milliliter-Spritze geben und bei vier Grad Celsius lagern.Um die Bulk-Tröpfchen-Vitrifizierungsapparat vorzubereiten, zuerst entlang einer Seite der Mischnadeln äußere graue Hülse schneiden. Biegen Sie die Hülse auf, um sie von der Mischnadel zu entfernen. Schneiden Sie dann die Mischnadel auf eine Länge von 20 Millimetern und legen Sie ihren Cutoff-Auslass in eine 20-Spur-Injektionsnadel ein.Schieben Sie zwei 25-Millimeter-Silizium-Schlauchabschnitte über die Einlässe der Mischnadel. Und sichern Sie ihre Position mit Kleber. Sterilisieren Sie diese Baugruppe durch Autoklavieren.Füllen Sie einen sterilen Dewar-Kolben mit flüssigem Stickstoff. Und sterilisieren Sie die Außenseite mit Isopropanol, bevor Sie es in eine sterile Laminer-Flow-Zell-Kulturhaube legen. Achten Sie darauf, geeignete persönliche Schutzausrüstung zu tragen, da flüssiger Stickstoff schwere Verbrennungen verursachen kann.Um die Tröpfchensammelvorrichtung zu erstellen, legen Sie einen Trichter mit dem gleichen Außendurchmesser wie der Innendurchmesser des Dewar in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Mit großen Zangen drücken Sie das Tröpfchensammelgerät langsam in den flüssigen Stickstoff in seiner endgültigen vertikalen Position. Stellen Sie sicher, dass das konische Rohr in vertikaler Position am unteren Rand des Dewar stagniert.Und der Flüssigstickstoffgehalt ist einen Zentimeter niedriger als der Rand des Trichters. Um eine Spritzenpumpe an einer vertikalen Position an der Wand der Zellkulturhaube zu montieren, binden Sie eine Schnur von den Füßen der Spritzenpumpe an Schrauben, die aus der Zellkultur-Haubewand herausragen. Legen Sie dann den flüssigen Stickstoff Dewar mit der Tröpfchensammelvorrichtung unter die vertikal montierte Spritzenpumpe.Nach Erhalt frisch isolierter Rattenhepatozyten, zählen Sie die Lagerkonzentration durch Tri-Pan-Blau-Ausschluss. Und übertragen Sie 40 Millionen lebensfähige Hepatozyten in eine 50 Milliliter konische Röhre. Zentrifugieren Sie die Hepatozyten bei 50 mal G für fünf Minuten ohne Pause.Aspirieren Sie den Überstand. Setzen Sie die Hepatozyten in 3,4 Millilitern V1-Lösung wieder aus. Und drei Minuten auf Eis brüten.Dann 150 Mikroliter DMSO und 150 Mikroliter EG hinzufügen; sanft mischen und drei Minuten lang wieder auf Eis brüten. 150 Mikroliter DMSO und 150 Mikroliter EG wieder zu den Hepatozyten geben und vorsichtig mischen. 3,5 Milliliter dieser Mischung in eine Drei-Milliliter-Spritze geben.Setzen Sie die Spritze mit vorbebrüten Hepatozyten und die Spritze mit V2-Lösung auf den Spritzenpumpenadapter. Befestigen Sie zwei Buchsen-Schleuse-Adapter an den Spritzen. Und schieben Sie die Siliziumschläuche der Mischnadelbaugruppe über die Widerhakenarmaturen.Legen Sie diese gesamte Baugruppe in die Spritzenpumpe. Drei Minuten nach der letzten Ausgabe von DMSO und EG zu den Hepatozyten, starten Sie die Pumpe mit zwei Milliliter pro Minute. Immerhin wurden dem flüssigen Stickstoff stopp die Pumpe Hepatozyten zugesetzt.Mit einer 20-Spur-Nadel, punktieren Sie 10 kleine Löcher in den Deckel eines 50 Milliliter konischen Rohr. Und wickeln Sie die Außenseite des Deckels mit einem flexiblen Film, wodurch ein Ventil entsteht, das das Entweichen von verdampfendem flüssigem Stickstoff ermöglicht. Um die verglasten Hepatozytentröpfchen zu sammeln, entfernen Sie zuerst den Trichter aus dem Dewar mit flüssigem Stickstoff.Als nächstes, mit langen Zangen, nehmen Sie das konische Rohr, das die Tröpfchen aus dem flüssigen Stickstoff enthält, und gießen Sie langsam den überschüssigen flüssigen Stickstoff aus dem konischen Rohr. Schließen Sie das konische Rohr mit dem durchlöcherten Deckel und legen Sie dann das geschlossene konische Rohr mit verglasten Hepatozytentröpfchen mit flüssigem Stickstoff direkt wieder in den Dewar. Schließlich übertragen Sie das konische Rohr aus dem flüssigen Stickstoff in einen flüssigen Stickstoffkrynotank.Nach der Herstellung der Rewarming-Lösung mit Saccharose- und DMEM-Hepatozyten-Kulturmedien verwenden Sie einen 0,22-Mikrometer-Filter, um sie zu sterilisieren. Dann auf 37 Grad Celsius erwärmen. Um die Hepatozyten wieder aufzuwärmen, entfernen Sie das konische Rohr mit verglasten Hepatozyten aus dem Kryotank und transportieren es in einem flüssigen Stickstoff Dewar in die Subkulturhaube.Lösen Sie die Kappe leicht und legen Sie das konische Rohr wieder in den flüssigen Stickstoff. Arbeiten Sie schnell, fügen Sie alle verglasten Hepatozytentröpfchen zu einem leeren Becher, dann fügen Sie schnell 100 Milliliter 37 Grad Celsius warmes Aufwärmlösung unter Rühren für 10 Sekunden. Wenn die Tröpfchen aus flüssigem Stickstoff entfernt werden, tritt das inest Einfrieren innerhalb von Sekunden auf, wenn die Tröpfchen nicht schnell wieder aufgewärmt werden.Daher ist es wichtig, die Rewarming-Medien direkt zu den Tröpfchen hinzuzufügen, während sie rühren. Teilen Sie die Rewarminglösung mit Hepatozyten in zwei 50 Milliliter konische Schläuche auf. Zentrifugieren Sie die Rohre für zwei Minuten bei 100 mal G bei vier Grad Celsius ohne Pause.Aspirieren Sie die Überstande, um ein Gesamtvolumen von 12,5 Millilitern zu hinterlassen, indem Sie die Graduierungsmarke der Röhre als Referenz verwenden. Um die Rewarming-Lösung zu 50% zu verdünnen, fügen Sie 12,5 Milliliter eiskaltes DMEM pro konischem Rohr hinzu. Drei Minuten lang wieder aufeisern und bebrüten.Um die Rewarminglösung auf 25% zu verdünnen, fügen Sie 25 Milliliter eiskaltes DMEM pro konischem Rohr hinzu. Nach fünf Minuten zentrifugieren bei 50 mal G bei vier Grad Celsius ohne Pause, den Überstand ansaugen und die Hepatozyten in zwei Millilitern des gewünschten Kulturmediums wieder aussetzen. Gemessen durch Tri-Pan-Blau-Ausschluss-Tests, die die Membranintegrität bestimmt, führte die Massentropfenverglasung zu einer direkten Hepatozyten-Lebensfähigkeit nach der Konservierung von 79%. Dies war signifikant höher als die 68%ige Lebensfähigkeit nach klassischer optimierter Kryokonservierung.Die Ausbeute der Bulk-Droplet-Vitrifizierung war 56%, was 10% höher und konsistenter als die klassische Kryokonservierung war. Mit Presto-Glue-Metabolisierungs-Assay in langfristigen College- und Sandwichkulturen wurde die metabolische Aktivität an den Hepatozyten gemessen, um nach der Massentröpfchenverglasung dann nach der klassischen Kryokonservierung deutlich höher zu sein. Albumin-Synthese, als der am weitesten verbreitete Parameter der synthetischen Funktion von Hepatozyten, war größer um fast das Zweifache nach Bulk-Droplet-Vitrifizierung, dann nach klassischer Kryokonservierung.Die Harnstoffproduktion wurde verwendet, um die Entgiftungsfunktion von Hepatozyten in einer einwöchigen Kultur zu messen. In bulk droplet verglasten Hepatozyten war die Harnstoffproduktion deutlich höher als bei klassischen Kryokonservenhepatozyten. Für konsistente Ergebnisse nach der Verglasung von Bulk-Droplet ist es wichtig, genau dem Timing während der Vorinkubation von CPAs und dem erneuten Aufwärmen zu folgen, wie in diesem Protokoll beschrieben.Nach dem Erneutaufwärmen der verglasten Hepatozytentröpfchen erhalten Sie am Ende eine bessere Größensuspension, die daher auf die gleiche Weise verwendet werden kann, als ob sie frisch isoliert wären. Als verbesserte Konservierungsmethode kann die Massentropfenverglasung die Verfügbarkeit für Forschung und klinische Anwendungen erhöhen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Eine Technik zur Isolierung menschlicher Hepatozyten und nicht-parenchymaler Leberzellen vom selben Spender wird beschrieben. Die unterschiedlichen Leberzelltypen bilden die Grundlage für funktionelle Lebermodelle und Tissue Engineering. Diese neue Methode zielt darauf ab, Leberzellen in einer hohen Ausbeute und Lebensfähigkeit zu isolieren.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Das Ziel dieses Protokolls ist, hohe Wirtschaftlichkeit und hohe Ausbeute von Hepatozyten und sinusförmigen endothelial Zellen von Leber zu erhalten. Dies geschieht durch die Vorrichtung der Leber mit einer Typ IV Kollagenase Lösung über die Pfortader, gefolgt von differentielle Zentrifugation, Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen zu erhalten.

Reinigung von Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen aus Maus Leber Perfusion

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung von gesunden und funktionalen primäre Maustaste Hepatozyten. Anweisungen für die Erkennung von hepatischen im Entstehen begriffenen Proteinsynthese durch nicht-radioaktiven Kennzeichnung Substrat wurden zum besseren Verständnis der Mechanismen, die Protein-Synthese im Rahmen des Energie-Stoffwechsel-Homöostase in der Leber.

Isolierung der primäre Maustaste Hepatozyten für entstehende Protein Synthese Analyse von nicht-radioaktiven L-Azidohomoalanine Kennzeichnung Methode

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine schrittweise Anleitung zur 3-d "Leber-on-a-Chip" Infektion mit dem Hepatitis B-Virus Experimente zur Verfügung stellen.

"Leber-on-a-Chip" Kulturen der primäre Hepatozyten und Kupffer Zellen für Hepatitis B-Virus-Infektion

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung von Maushepatozyten aus erwachsenen Mauslebern mit einer modifizierten Kollagenase-Perfusionstechnik vorgestellt. Ebenfalls beschrieben ist die Langzeitkultur von Hepatozyten in einer 3D-Kollagen-Sandwich-Einstellung sowie die Immunkennzeichnung der zytoskelettalen Komponenten zur Untersuchung der Gallenkanalbildung und deren Reaktion auf die Behandlung.

Isolation und 3D Kollagen Sandwich Kultur der primären Maus Hepatozyten, um die Rolle des Zytoskeletts in Bile Canalicular Formation In Vitro zu studieren

Primäre Hepatozyten sind ein wertvolles Werkzeug, um die Leberreaktion und den Metabolismus in vitro zu untersuchen. Unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien wurde ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus entwickelt.

Ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines speziellen intravenösen Katalysators, eines standardisierten sterilen Einwegschlauchs, einer Temperaturregelung, die durch Echtzeitüberwachung ergänzt wird, und eines Alarmsystems für ein zweistufiges Kollagenase-Perfusionsverfahren, um die Konsistenz der Lebensfähigkeit, Ausbeute und Funktionalität isolierter primärer Rattenhepatozyten zu verbessern.

Isolierung primärer Rattenhepatozyten mit Multiparameter-Perfusionskontrolle

Fettsäure-β-Oxidation ist ein essentieller Stoffwechselweg, der für die Energieerzeugung in vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Hepatozyten, verantwortlich ist. Hier beschreiben wir eine Methode zur Messung der Fettsäure-β-Oxidation in frisch isolierten primären Hepatozyten unter Verwendung von 14C-markierter Palmitinsäure.

Messung der Fettsäure-β-Oxidation in einer Suspension frisch isolierter Maus-Hepatozyten

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Isolierung primärer Maushepatozyten aus der Leber und zur Elektropolatierung von CRISPR-Cas9 als Ribonukleoproteine und mRNA, um ein therapeutisches Zielgen zu stören, das mit einer erblichen Stoffwechselerkrankung der Leber assoziiert ist. Die beschriebenen Methoden führen zu einer hohen Lebensfähigkeit und einem hohen Grad an Genmodifikation nach der Elektroporation.

Elektroporationsvermittelte Abgabe von Cas9-Ribonukleoproteinen und mRNA in frisch isolierte primäre Maus-Hepatozyten

Lipidbeladene Hepatozyten sind der Leberregeneration inhärent, gehen aber normalerweise bei der Zentrifugation mit Dichtegradienten verloren. Hier stellen wir ein optimiertes Zellisolationsprotokoll vor, das steatotische Hepatozyten beibehält, was repräsentative Populationen von regenerierenden Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen ergibt.

Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen

Dieses Protokoll stellt eine optimierte zweistufige Kollagenase-Leberperfusionstechnik in einem Rattenmodell vor und zeigt die Verwendung von isolierten Hepatozyten für die in vitro Langzeitkultur von 3D-Organoiden.

Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist

Erfahren Sie die Bulk Droplet Vitrification zur Kryokonservierung primärer Hepatozyten mit niedrigen Kryoprotektivkonzentrationen. Diese Methode verbessert Zellviabilität und metabolische Aktivität für Transplantationen.

Bulk Droplet Vitrification für primäre HepatozytenKonservierung

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